海馬干細胞來源的外泌體對血管性癡呆大鼠學習記憶能力改善作用及其機制探究

潘成利,黃月萍,薛炬君,陳 曦,齊 丹,侯曉君,孫 爽,王喜春,付宏娟

(黑龍江省醫院 老年神經內科,黑龍江 哈爾濱150036)

隨著社會的發展,人們生活節奏加快,血管性癡呆的發病率正逐年提高,據統計,血管性癡呆的五年病死率超過65%,現已成為影響人們生命健康及生存質量的重要疾病[1]。目前,關于血管性癡呆的發病機制尚不明確,可能與慢性腦灌注不足、鈣超載、炎性反應以及凋亡通路的激活具有重要關系[2]。有研究發現,當海馬部位神經元處于慢性缺血性壞死狀態時,會出現遲發性認知功能障礙[3]。外泌體為細胞分泌的直徑30～100 nm的細胞外囊泡,幾乎存在于所有細胞中,有研究發現,在生理或病理條件下中樞神經系統中的細胞均能夠分泌外泌體[4]。據相關報道[5],外泌體的低免疫原性、能夠穿過血腦屏障以及循環半衰期長等特征可用于治療中樞神經系統疾病。本研究旨在探究海馬干細胞來源的外泌體對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的改善作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

特殊清潔級(SPF)健康雄性SD大鼠 (北京維通利華實驗動物技術有限公司),體重212±15 g,周齡8周,所有實驗均在溫度23±2℃,濕度50%±15%,晝夜比例1∶1的環境中適應性飼養7 d。

1.2 主要儀器及試劑

低溫高速離心機(上海精密儀器儀表有限公司);透射電子顯微鏡(北京儀信網通科技有限公司);恒溫水浴箱(上海赫田科學儀器有限公司);石蠟切片機(上海之信儀器有限公司);-80℃超低溫冰箱(中科美菱生物醫療股份有限公司);蘇木精(上海美軒生物科技有限公司);無水乙醇(蘇州歐特化工有限公司);Morris水迷宮(江蘇賽昂斯生物科技有限公司);10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司);Bcl-2檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司);Bax檢測試劑盒(上海將來實業股份有限公司)。

1.3 海馬干細胞提取

取10只大鼠處死,取大鼠海馬組織,充分裂解制成單細胞懸液,離心,取上清液,采用增殖培養液重懸細胞,當細胞形成神經球后消化傳代,將細胞培養至4代,當細胞融合至85%左右時換為無血清培養基培養48 h,離心,取上清液,再次離心后進一步濃縮上清液,加入外泌體沉淀液,混勻,在4℃條件下靜置過夜,離心,去除上清液,所得沉淀物即為海馬干細胞外泌體。

1.4 建立大鼠血管性癡呆模型

建立大鼠血管性癡呆模型:建模前大鼠禁食10 h。將大鼠麻醉,取仰臥位固定于實驗臺上,頸部備皮,分離兩側頸總動脈,腹腔注射硝普鈉造成低血壓,注射完成后將雙側頸總動脈夾閉15 min左右,放開動脈夾約15 min,再次夾閉約15 min,操作3次,縫合皮膚及各層肌肉,在手術創口處噴灑及注射抗生素防止感染。過程中注意對大鼠進行保溫。

將大鼠隨機分為假手術組、模型組及外泌體組3組,每組大鼠30只。其中,假手術組不注射硝普鈉,阻斷頸總動脈。外泌體組尾靜脈注射30 μg海馬干細胞來源外泌體,模型組及假手術組注射等劑量生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1海馬干細胞外泌體觀察 取外泌體沉淀物,加入磷酸鹽緩沖液溶解,取上清液加至載樣銅網上,使用磷鎢酸溶液染色,采用透射顯微鏡觀察記錄。

1.5.2Morris水迷宮實驗對大鼠的學習及記憶能力進行檢測 將水迷宮分為4個區域,在每個區域內進行入水點標記設置,將一隱蔽的圓形平臺放于第三區域。在定向航行試驗中(每天3次,共4 d),每次隨機選取一個區域入水,在60 s內找到圓形平臺的時間為逃避潛伏期。觀察并記錄大鼠找到并爬上平臺所需時間。第5天時將平臺撤去進行空間探索實驗,從原區域入水,記錄大鼠在100 s內找到原平臺區域的探索時間,若在60 s內未找到平臺,則需將大鼠引到平臺。48 h后重復實驗,觀察并記錄大鼠逃避潛伏期時間變化、平臺區域探索時間,有效區停留時間及錯誤次數。

1.5.3氧化應激因子檢測 行為學檢測結束后,取大鼠心臟血,離心,取上清液,采用硫代巴比妥顯色法檢測血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平。操作步驟均嚴格按照操作說明書進行。

1.5.4海馬組織病理學檢測 將大鼠處死,取海馬組織,采用HE染色法觀察大鼠海馬組織病理學變化。取海馬組織,常規制作石蠟切片,將切片放入70℃烤箱烘烤過夜,二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,磷酸鹽緩沖液沖洗,蘇木素染液,鹽酸酒精分化,自來水沖洗,伊紅染液染色,自來水沖洗,經梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,使用顯微鏡進行觀察。

1.5.5海馬組織因子檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測海馬組織乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、內皮素-1(Endothelin-1,ET-1)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。所有操作步驟均嚴格按照操作說明書進行。

1.5.6腦微血管密度檢測 采用免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織腦微血管密度變化。取海馬組織,常規脫水后包埋成蠟塊,其放入切片機中切成5 μm厚度的切片,放入烤箱中烤干。將切片浸入枸櫞酸溶液中高溫煮沸并冷卻進行抗原修復,將切片靜置自然冷卻至37℃加入BDNF及Trk B抗體孵育1 h,使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次3 min,采用免疫組化法進行染色,DAB顯色5 min,蘇木精進行復染、脫水、透明、封片。顯微鏡觀察記錄。

1.5.7凋亡因子檢測 采用蛋白質印記法檢測各組大鼠海馬組織凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達水平。取海馬組織充分裂解,離心,取上清液。配制BCA工作液,充分混勻,各孔加入200 μL BCA工作液,測定蛋白濃度,將各管蛋白稀釋至7 μg/μL;將蛋白質進行變性處理,制備10 mL SDS-聚丙烯酰胺分離膠及4 mL SDS-聚丙烯酰胺堆積膠,經上樣、電泳、轉膜后封閉;加入Bcl-2、Bax一抗,在4℃條件下搖床過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入二抗;滴加顯影液,使其均勻覆蓋,避光孵育2 min,放于凝膠成像系統中顯影,檢測目的蛋白的相對光密度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 透射顯微鏡下海馬干細胞來源外泌體形態

透射顯微鏡觀察到外泌體結構呈圓形或橢圓形杯狀結構的小囊泡,其結構完整,直徑50～100 nm之間。經蛋白質印記法檢測發現外泌體中均有特異性標記蛋白CD9、CD63陽性表達。見圖1～2。

圖1 透射顯微鏡下海馬干細胞來源外泌體形態

圖2 細胞外泌體表面標志物CD9、CD63檢測

2.2 各組大鼠學習記憶能力變化

與假手術組比較,模型組大鼠逃避潛伏期及錯誤次數明顯延長,平臺區域探索時間及有效區停留時間明顯縮短(P<0.05);與模型組對比,外泌體組大鼠逃避潛伏期明顯縮短,平臺區域探索時間及有效區停留時間明顯延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠學習記憶能力變化

2.3 各組氧化應激因子對比

與假手術組比較,模型組大鼠血清MDA水平明顯升高,SOD水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,外泌體組大鼠血清MDA水平明顯降低,SOD水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組氧化應激因子對比

2.4 各組大鼠海馬組織病理學組織變化

假手術組大鼠海馬組織細胞排列緊密,結構清晰,大小、形態一致,且具有豐富的尼氏小體;模型組大鼠海馬組織細胞排列紊亂,形態、結構不完整,尼氏小體數量明顯減少;外泌體組大鼠海馬組織較模型組明顯改善,細胞形態較模型組明顯完整,尼氏小體數量增多。見圖3。

圖A:假手術組;圖B:模型組;圖C:外泌體組

2.5 各組大鼠海馬組織AchE、5-HT、ET-1、VEGF表達水平對比

與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織AchE、ET-1、VEGF表達水平均明顯升高,5-HT水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,外泌體組大鼠海馬組織AchE、ET-1、VEGF表達水平均明顯升高,5-HT水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織AchE、5-HT、ET-1、VEGF表達水平對比

2.6 各組大鼠海馬組織腦微血管密度對比

與假手術組比較,模型組大鼠腦微血管內皮細胞明顯減少(P<0.05);與模型組比較,外泌體組大鼠腦微血管內皮細胞明顯增多(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織腦微血管密度對比

2.7 各組大鼠海馬組織凋亡因子對比

與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織Bax表達水平明顯升高,Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,外泌體組大鼠海馬組織Bax表達水平明顯降低,Bcl-2表達水平明顯升高(P<0.05)。見表5,圖4。

表5 各組大鼠海馬組織凋亡因子對比

圖4 各組大鼠海馬組織凋亡因子對比

3 討論

血管性癡呆是一種中樞神經系統性疾病且再生及修復能力較弱,其受損神經功能難以恢復。目前,關于血管性癡呆的發病機制尚不明確,同時缺乏有效治療的藥物,因此建立血管性癡呆大鼠模型,分析討論血管性癡呆的發生機制,對疾病的早期治療、診斷及預防具有重要作用。近年來,隨著對干細胞研究的不斷深入,人們逐漸嘗試將干細胞移植用于中樞神經系統疾病的治療,并取得了一定效果。研究表明[6],移植的干細胞主要通過旁分泌的方式發揮治療作用,而外泌體是細胞發揮旁分泌作用的關鍵。越來越多的研究發現[7-8],干細胞來源的外泌體具有與其母體干細胞相似的功能作用。脂肪間充質干細胞來源的外泌體在腎缺血再灌注損傷的治療中具有重要作用。骨髓干細胞來源的外泌體能夠明顯改善神經損傷大鼠模型中的勃起功能障礙。本研究旨在探究海馬干細胞來源的外泌體在血管性癡呆大鼠學習記憶能力方面的改善作用及相關機制。

認知功能障礙是血管性癡呆最基本且最典型的癥狀。動物行為學測試常應用于神經科學的多個領域,尤其是在評估認知功能障礙相關性疾病的動物模型等發揮著重要作用[9]。本組研究中采用Morris水迷宮實驗測定各組大鼠學習及記憶功能,結果發現,血管性癡呆大鼠空間學習及記憶功能明顯下降。這可能是因為海馬是學習、記憶的關鍵腦區,海馬神經元損傷是造成記憶功能障礙的重要原因,當發生血管性癡呆時,大量自由基產生、興奮性氨基酸及細胞內鈣超載,使海馬神經元發生缺失,進而對大鼠的空間學習記憶能力產生影響[10]。而尾靜脈注射海馬干細胞來源的外泌體能夠明顯改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力。此外,本研究結果發現,當發生血管性癡呆后,海馬組織出現明顯的病理學改變,椎體細胞出現明顯壞死,細胞明顯減少。這可能是因為海馬區對缺血缺氧十分敏感,當發生缺血缺氧后,海馬區神經元受到損傷,從而發生壞死脫落[11]。海馬干細胞來源的外泌體對海馬組織的損傷具有一定的治療作用。

MDA為脂質過氧化的產物,有研究證實[12],MDA水平可能與細胞損傷程度明顯相關。SOD是一種源于生命的活性物質,對清除機體新陳代謝廢物,消除氧自由基具有重要作用。本研究結果發現,血管性癡呆大鼠血清MDA水平明顯升高,SOD水平明顯降低。這可能是因為,當發生腦損傷時,腦內氧自由基水平明顯增加,進而損傷腦組織神經元。而人為靜脈注射外泌體能夠明顯抑制MDA水平,促進SOD表達,抑制氧自由基水平,減少腦損傷,與DHALIWAL等[13]研究結果相似。

大腦海馬區是學習記憶的重要結構,也是缺血缺氧非常敏感的腦區之一。有研究發現[14],血管性癡呆大鼠認知功能的改變可能與單胺類神經遞質的釋放及代謝關系密切。AchE是一種在學習記憶過程中起著重要作用的神經遞質,相關研究發現[15],其在阿爾茲海默癥等多種疾病中表達水平明顯降低,且其水平與患者疾病呈明顯負相關。5-HT主要表達于突觸中,對突觸的發育成熟及傳遞功能具有重要作用。研究表明[16],5-HT廣泛存在與哺乳動物組織中,尤其在大腦皮層及神經突觸中含量很高,能夠促進神經元的分化作用。ET-1是一種縮血管肽,廣泛存在于腦血管系統中,據報道[17],當發生腦缺血缺氧時,ET-1水平明顯增加,可能會誘導神經細胞凋亡的發生,加重腦損傷,引起認知功能的改變。VEGF是一種血管形成因子,能夠促進新生血管的生成。本組研究結果中,血管性癡呆大鼠海馬組織AchE、ET-1、VEGF表達水平明顯升高,5-HT表達水平明顯降低,且海馬組織腦微血管密度明顯降低,海馬干細胞來源的外泌體能夠明顯降低AchE、ET-1、VEGF水平,升高5-HT水平,促進腦組織血管新生。

細胞凋亡是一種正常過程,發展可受到多種基因的調控。Bcl-2與Bax均屬于Bcl-2家族,在細胞凋亡過程中扮演著重要角色。其中,Bcl-2能夠降低Bax濃度,影響細胞膜的通透性,抑制細胞凋亡的發生;Bax是一種促凋亡基因,能夠促進細胞的凋亡[18-19]。既往有研究發現[20],凋亡不僅與神經系統的發育及可塑性具有重要關系,也可能與神經系統的病理狀態具有重要關系。本研究結果發現,尾靜脈注射海馬干細胞來源的外泌體,能夠明顯促進Bcl-2/Bax表達水平,促進細胞凋亡。

綜上所述,海馬干細胞來源的外泌體能夠明顯改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力,對海馬神經元損傷起到一定的保護作用,其作用機制可能與抑制氧化應激與細胞凋亡,調控神經遞質含量,促進增加腦微血管密度有關。