枸杞多糖通過激活Nrf2/HO-1 通路保護HK-2細胞氧化損傷的作用

趙 杰,史素芳,單鐵強,郭 明,皮珊珊,張銀平,郭 菲

(1.邯鄲市中心醫院 臨檢科,河北 邯鄲056002;2.河北工程大學附屬醫院 護理科,河北 邯鄲056002;3.秦皇島市海港醫院 a.檢驗科;b.腎內科,河北 秦皇島066000)

枸杞多糖(LBP)是從中草藥枸杞成熟果實中分離出來的一種生物活性成分,對生物體具有抑制腫瘤的生長和擴散、調控免疫應答、減輕組織炎癥反應、增強抗氧化反應能力等多種藥理學功效[1-3]。近幾年的研究表明,枸杞多糖能通過降低脂多糖誘導的小鼠肺組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量、增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及促進Akt/eNOS 通路的表達來減輕肺組織損傷[4]。LBP能提高糖尿病小鼠的睪丸組織中抗氧化酶活性,提高自噬水平及激活PI3K/Akt信號通路達到改善睪丸功能的作用[5]。枸杞多糖對腎小管上皮細胞氧化損傷修復及其潛在的分子機制尚不清楚。因此,本研究在體外孵育人腎小管上皮細胞株(HK-2),并經過適當濃度的過氧化氫作用構建氧化損傷細胞模型,經枸杞多糖干預后,從細胞長勢、形態和存活率,細胞內產生氧化產物MDA的量、抗氧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的水平,HK-2內的核因子 E2 相關因子 2(Nrf2)/血紅素氧合酶-1(HO-1)通路激活的情況,分析枸杞多糖拮抗HK-2細胞氧化損傷的分子機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人腎小管上皮細胞系購自上海中喬新舟生物公司;枸杞多糖購自陜西永源生物公司,提前將其用少量三蒸水溶解、高壓滅菌、冷藏,實驗時稀釋為相應濃度。檢測細胞存活率的試劑盒、胰蛋白酶及30%雙氧水均購自山東匯恒生物公司;測量細胞內MDA含量、SOD和GSH-Px水平的檢測試劑盒均購自上海滬崢生物公司;定量細胞內蛋白Nrf2、HO-1的抗體檢測試劑盒均購自北京安諾倫生物公司。

1.2 方法

1.2.1細胞實驗分組和形狀、長勢觀察 體外孵育HK-2細胞到長勢、狀態最佳時,將其等量分成4組:正常組(A組)、LBP組(B組)、氧化損傷組(C組)及LBP干預組(D組)。正常組:常規孵育液;LBP組:內含枸杞多糖(100 mg/L)孵育液;氧化損傷組:內含過氧化氫(100 μmol/L)的孵育液;LBP干預組:提前24 h培養于含有枸杞多糖(100 mg/L)孵育液中,再加入過氧化氫(100 μmol/L)培育30 min。4組細胞作用等同時間后,分別觀察細胞的形狀和長勢情況。

1.2.2細胞存活率測定 在多孔孵育板中將每組細胞接種為重復的6孔,作用等同時間后,每孔中的孵育液被吸干凈,分別加入試劑盒內的檢測活細胞數量的試劑,再繼續培養4 h。將多孔孵育板放進酶標儀中測定每孔細胞的吸光度值。最后計算并分析每組細胞的存活率。

1.2.3細胞內MDA、SOD及GSH-Px水平的檢測 每組細胞均作用24 h時,用胰蛋白酶處理貼壁細胞,分離出的細胞放入無菌的試管中,連續冰凍溶解3次,細胞破碎釋放出內含物,分別收集4組細胞的內含物,按照試劑說明書的程序,依次定量4組細胞內MDA、SOD及GSH-Px的水平。

1.2.4細胞內蛋白相對值的檢測 每組細胞均作用24 h時,緩沖液漂洗細胞,置于低溫下充分裂解細胞后,檢測每組細胞中所含的總蛋白量。蛋白煮沸使其變性,每個泳道中加入40 μg進行恒壓電泳2.5 h,接著在恒定電流作用下,將膠中的蛋白條帶轉至薄膜中,將膜浸入封閉溶液里室溫孵育1 h,依次加入第一抗體稀釋溶液Nrf2(1∶500)和HO-1(1∶500)中,置于溫箱中作用4 h,投進第二抗體稀釋溶液(1∶1200)中反應1 h,發光液顯影、定影到X光片上、掃描后分析各種蛋白的相對值。

2 結果

2.1 細胞形狀和長勢的觀察光鏡下可見,正常組與LBP組相比,兩組細胞均生長良好,在形狀、長勢方面無差異;氧化損傷組的細胞皺縮變圓并脫落、貼壁的細胞數量變少;LBP干預組的細胞形狀伸展、長勢有所恢復、貼壁細胞較多。見圖1。

圖1 各組活細胞形狀和長勢的觀察(×100)

2.2 各組細胞存活率的比較通過每組6孔細胞的吸光度均值計算細胞存活率,正常組與LBP組相比,兩組細胞的存活率差異無統計學意義(P>0.05);氧化損傷組的細胞存活率顯著低于正常組(P<0.01);LBP干預組的細胞存活率顯著高于氧化損傷組(P<0.01)。見表1。

表1 各組細胞的存活率、細胞內MDA、SOD及GSH-Px水平的分析

2.3 各組細胞內MDA、SOD及GSH-Px水平的比較正常組與LBP組相比,兩組細胞內的MDA、SOD及GSH-Px水平差異均無統計學意義(均P>0.05);氧化損傷組細胞內MDA水平顯著高于正常組(P<0.01),而SOD及GSH-Px水平均顯著低于正常組(P<0.01);LBP干預組細胞內MDA水平顯著低于氧化損傷組(P<0.01),而SOD及GSH-Px水平均顯著高于氧化損傷組(P<0.01)。見表1。

2.4 各組細胞內Nrf2/HO-1通路蛋白相對值的比較正常組與LBP組相比,兩組細胞內Nrf2、HO-1蛋白的相對值差異均無統計學意義(均P>0.05);氧化損傷組細胞內Nrf2、HO-1蛋白的相對值均顯著低于正常組(P<0.01);LBP干預組細胞內Nrf2、HO-1蛋白的相對值均顯著高于氧化損傷組(均P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組細胞內Nrf2/HO-1通路蛋白相對值的比較

圖2 各組細胞內Nrf2、HO-1的蛋白條帶

3 討論

腎臟的主要功能為濾過血液產生原尿、重吸收原尿、分泌排泄生成終尿,從而使機體內的水、電解質處于平衡狀態。腎小管是組成腎臟實質的結構和功能重要組分,其壁由一層上皮細胞圍成。此種細胞的主要作用為吸收原尿中的有用成分使之重新入血;分泌、排泄一些離子、小分子等成分進入尿液[6];相鄰細胞側面間的緊密連接構成保護屏障,防止有害物質的入侵[7]。當腎組織受到有害因素刺激發生氧化損傷時,腎小管對此刺激最為敏感,其管壁細胞表現為程度不等的壞死狀態[8]。根據上述腎小管功能的重要性及易受損傷性,因此,探索其抗氧化的潛在分子機制對臨床上腎臟氧化損傷的防治具有十分重要的意義。

過氧化氫為一種強氧化劑,具有很強的氧化活性,當其作用于細胞時,能迅速穿透細胞膜,破壞細胞內部所含的脂質、蛋白質及核酸等生物分子的結構,使其功能降低或喪失[9]。文獻已經證實,利用過氧化氫能成功建立多種類型細胞的氧化損傷模型[10]。因此,本實驗采用100 μmol/L過氧化氫的孵育液刺激HK-2細胞,細胞皺縮變圓并脫落、貼壁的細胞數量變少,細胞存活率下降。這表明HK-2細胞氧化損傷模型已經成功建立。

氧化與抗氧化的平衡是維持細胞正常生命的必備條件,調節此平衡的途徑有多種,較為常見的調節是胞質內氧化物質與抗氧化物質含量的平衡。正常狀態下,細胞內的抗氧化酶如SOD、GSH-Px等能及時清除代謝過程產生的活性氧、自由基等氧化物質。這些氧化物質具有毒害作用,若其產量增多超過抗氧化酶的清除力時,細胞會遭受氧化損害[11]。過氧化氫作用細胞后,細胞內生成過量的有害氧化物質不僅消耗SOD、GSH-Px等抗氧化酶,而且還會生成毒性產物MDA,使損傷程度加深、范圍擴大[12]。因此,細胞內抗氧化酶SOD、GSH-Px的水平可作為衡量細胞抗氧化能力的高低,氧化產物MDA的水平能衡量細胞受到的氧化損傷程度[13]。

Nrf2/HO-1通路激活對細胞內的氧化反應起負調控作用[14]。Nrf2常和Keap1相結合為復合物存在于胞質中,若細胞受到氧化刺激時,Keap1被磷酸化而失活并與Nrf2分開,游離的Nrf2入核后結合相應基因,啟動并增強抗氧化酶如SOD、GSH-Px等基因的轉錄和表達,降低胞質內氧化反應的強度并減輕氧化損傷[15]。HO-1是受Nrf2調控的抗氧化蛋白,其抗氧化作用表現為:① 能催化血紅素這種強氧化劑的分解,從而減少血紅素的促氧化作用;②HO-1 分解血紅素生成的分解產物具有較強的清除ROS、氧自由基等抗氧化功效[16]。本研究結果顯示,經過氧化氫作用的HK-2細胞內Nrf2、HO-1蛋白的相對值降低、抗氧化酶SOD、GSH-Px的水平降低,氧化產物MDA的水平升高。經LBP干預后,HK-2細胞內Nrf2、HO-1蛋白的相對值升高、抗氧化酶SOD、GSH-Px的水平上升,氧化產物MDA的水平降低。這提示過氧化氫能抑制Nrf2/HO-1通路的活性降低抗氧化酶的活性使細胞發生氧化損傷,LBP能激活Nrf2/HO-1通路增強細胞的抗氧化能力來改善其氧化損傷。

綜上所述,過氧化氫通過抑制HK-2細胞內Nrf2/HO-1通路的活性,降低抗氧化酶的含量,使MDA的水平升高,從而使細胞產生氧化損傷。經LBP干預后,提高Nrf2/HO-1通路的活性,升高抗氧化酶的含量,使MDA的水平降低,使細胞的氧化損傷得到改善。