腦脊液宏基因組二代測序在小兒神經外科術后顱內細菌感染診斷中的應用

謝 岷,司道林,何 劍,鄧小鹿,王 霞

(中南大學湘雅醫院兒科,湖南 長沙 410008)

神經外科術后顱內細菌感染與圍手術期病死率直接相關,嚴重影響患者的預后,盡早診斷并及時啟動抗感染治療至關重要。目前臨床診斷標準存在假陽性率過高[1],從而導致抗菌藥物過度使用的問題。由于神經外科手術的特殊性和患者基礎疾病的病種及病變部位不同,發熱、頭痛、嘔吐、意識改變、腦膜刺激征、腦脊液常規及生化這些對非手術病例較為特異性的指標,對神經外科術后病例的特異性明顯降低,明確診斷需依賴病原學檢查,而腦脊液細菌培養需要時間長,陽性率低,生長緩慢的細菌需要更長的培養時間,不利于抗菌藥物的合理使用,容易導致臨床耐藥菌的產生。

宏基因組二代測序(mNGS)技術診斷隱球菌腦脊液感染的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和符合率分別為93.5%、96.0%、87.8%、98.0%、95.4%,提示mNGS具有良好的診斷能力,目前已被納入《非人類免疫缺陷病毒相關隱球菌性腦膜炎診斷的中國專家共識》[2],尤其是陰性預測值高達98.0%,對于減少過度診斷顱內感染的診斷價值高,但腦脊液mNGS檢測結果陰性在神經外科術后顱內感染病例診斷中的應用價值尚未見報道。本文分析2020年1月1日—2023年8月31日在中南大學某醫院兒童重癥監護病房神經外科術后顱內細菌感染(包括臨床診斷及確診)病例的臨床資料,在經驗性使用抗顱內感染藥物前送檢腦脊液培養和mNGS檢測。探討腦脊液mNGS檢測結果在兒童神經外科術后顱內細菌感染診斷中的意義,為其臨床診治提供思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2020年1月1日—2023年8月31日在中南大學某醫院兒童重癥監護病房住院的神經外科術后符合中樞神經系統感染的病例。診斷標準參照《神經外科中樞神經系統感染診治中國專家共識(2021版)》[1]:(1)臨床診斷病例,病例出現發熱(體溫>38℃)或低體溫(體溫<36℃),顱高壓癥狀(頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、意識改變),腦脊液渾濁或膿性,白細胞計數(WBC)增高(>100×106/L)、葡萄糖<2.2 mmol/L及腦脊液葡萄糖/血清葡萄糖≤0.4;(2)病原學診斷確診病例,在臨床診斷的基礎上,標本涂片、引流管頭、植入物及腦脊液微生物培養陽性(排除污染和定植)。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測時間 病例術后出現發熱、腦脊液改變符合術后顱內感染臨床診斷標準時,在經驗性使用抗顱內感染藥物前送檢腦脊液培養和mNGS檢測。此后連續送腦脊液培養≥1次。

1.2.2 檢測方法 (1)傳統病原學檢測:微生物培養,血、腦脊液、引流管頭、植入物等均嚴格遵照無菌操作,送該院微生物實驗室,細菌分離及培養參照微生物學檢驗診斷常規進行。(2)腦脊液mNGS檢測,所有病例均送腦脊液進行mNGS檢測,由予果生物科技(北京)有限公司免費檢測?；緳z測流程包括:標本采集、核酸提取(cell free DNA)、文庫建立和生物信息分析。(3)僅腦脊液培養陽性或僅mNGS檢測陽性的標本需進行復核。結合臨床轉歸、抗菌藥物使用情況,符合以下情況考慮污染:在使用入顱抗菌藥物前再次復查腦脊液培養、mNGS檢測均陰性,且有效抗菌藥物治療未達療程時,臨床癥狀很快緩解,腦脊液葡萄糖恢復正常。(4)其他實驗室檢查和影像學檢查,如血常規、尿常規、腦脊液常規、腦脊液生化、胸片或肺部CT、頭部MRI等均送該院相應的部門和科室檢測、檢查。

1.2.3 分組干預措施和比較 分析2020年1月—2021年9月(對照組)及2021年10月—2023年8月(干預組)臨床診斷病例入顱抗菌藥物使用時間。(1)對照組臨床診斷顱內感染后接受經驗性抗菌藥物治療,停用入顱抗菌藥物指征為至少等待1次腦脊液培養結果陰性,其他停藥指征參照文獻[1]:①體溫正常;②臨床感染體征消失;③腦脊液葡萄糖含量正常;④腦脊液常規WBC符合正常標準;⑤血液WBC和中性粒細胞正常。(2)2021年10月起,對同時符合以下情況的臨床診斷病例(干預組)不啟動入顱抗菌藥物經驗性治療:①腦脊液培養24 h及以上未預警,mNGS回報陰性。②血性腦脊液,未使用入顱抗菌藥物,復查腦脊液葡萄糖逐漸上升。③對腦脊液培養72 h以上未預警且mNGS陰性的臨床診斷病例盡早停用經驗性抗顱內感染治療。④所有病例密切觀察,一旦病例臨床進展,如出現發熱反復、體溫峰值上升、意識改變、顱壓下降后再上升,則及時再次送腦脊液培養,必要時再次送腦脊液進行mNGS檢測,并同時啟動經驗性抗顱內感染治療。⑤所有病例停止抗菌藥物治療后隨訪1個月,體溫正常,未出現與原發病無關的新的神經系統癥狀及體征,臨床排除細菌性腦膜炎。

1.3 統計學處理 應用SPSS 23軟件進行統計學分析,組間比較采用獨立樣本非參數檢驗,P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 43例病例中,男性29例,女性14例,年齡14個月～18歲?；A疾病:髓母細胞瘤10例,膠質瘤7例,生殖細胞瘤6例,顱咽管瘤3例,胚胎性腫瘤(節細胞瘤)1例,室管膜瘤4例,腦積水2例,癥狀性癲癇4例,腦血管畸形6例。顱內感染臨床診斷組38例,病原學診斷組5例。所有病例均有發熱,38例臨床診斷顱內感染病例中,5例存在肺部感染,其余病例均未找到顱外感染病灶。

2.2 腦脊液檢查結果

2.2.1 腦脊液常規 病原學診斷組病例腦脊液WBC、多核白細胞分類與臨床診斷組比較,差異均無統計學意義(χ2分別為0.078、0.028,均P>0.05),見圖1A、B。

圖1 病原學診斷組與臨床診斷組病例腦脊液檢查結果比較

2.2.2 腦脊液生化 病原學診斷組病例腦脊液蛋白含量、葡萄糖濃度及腦脊液葡萄糖/血清葡萄糖比值與臨床診斷組比較,差異均無統計學意義(χ2分別為1.255、0.003、0.003,均P>0.05),見圖1C～E。臨床診斷組38例病例中,29例腦脊液糖低考慮為血性腦脊液所致;9例腦脊液中找到腫瘤細胞,考慮為腫瘤轉移致葡萄糖低。9例腫瘤轉移致葡萄糖低患者中,2例髓母細胞瘤病例術后發熱,腦脊液葡萄糖持續低,其中1例放射治療、化學治療后腫瘤病灶逐漸增大,最后死亡,另1例放射治療、化學治療后葡萄糖逐漸恢復正常。

2.2.3 腦脊液培養 病原學診斷組檢出4例陽性(陰溝腸桿菌2例,大腸埃希菌、表皮葡萄球菌各1例),另有2例第一次腦脊液培養陽性(分別為表皮葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌),在腦脊液培養一級預警時立即復查腦脊液培養,并根據革蘭陽性菌和革蘭陰性菌分別加用利奈唑胺和美羅培南,此2例病例復查腦脊液時(未使用抗菌藥物前)葡萄糖含量已開始上升,體溫呈下降趨勢,結合腦脊液培養復查結果均陰性,考慮為污染菌株。

2.2.4 腦脊液mNGS mNGS檢測病原學陽性5例(陰溝腸桿菌2例,大腸埃希菌、溶血孿生球菌和表皮葡萄球菌各1例),其中包括腦脊液培養4例陽性。此外,2例腦脊液培養懷疑為污染菌株者,mNGS檢測均為陰性,腦脊液培養、mNGS檢測復查均為陰性;3例病例因反復發熱腦脊液葡萄糖低,進行了2次腦脊液mNGS檢測,均陰性。

2.3 腦脊液mNGS診斷結果 神經外科術后顱內細菌感染的金標準是細菌培養陽性,臨床診斷病例無金標準參照,故對28例臨床診斷顱內感染但mNGS檢測陰性的病例未進行經驗性抗顱內感染治療,或未達療程,后根據臨床轉歸及追蹤隨訪均排除細菌性腦膜炎。

2.4 抗菌藥物使用情況 病原學診斷組5例病例均進行常規抗感染治療,1例患兒顱內感染控制后因原發病進展死亡,4例存活,其中1例因并發腦積水,顱內感染控制后行腦室腹腔分流術。對照組共10例臨床診斷病例,均予經驗性抗顱內感染治療(拉氧頭孢、利奈唑胺單用,或美羅培南與萬古霉素或利奈唑胺聯用、頭孢曲松與利奈唑胺聯用),經驗性抗顱內感染治療平均時間為9 d。干預組臨床診斷的28例病例中,mNGS病原學檢測和腦脊液培養(至少2次)均陰性,結合臨床資料,其中16例病例未進行經驗性抗顱內感染治療,另12例病例在mNGS回報陰性后結合臨床資料及時停止經驗性抗顱內感染治療,追蹤隨訪28例病例均無細菌性腦膜炎發生,經驗性抗顱內感染治療平均時間為0(0,4) d,遠低于對照組抗菌藥物平均使用時間8(7,11) d (χ2=10.993,P<0.05)。見表1。

表1 38例臨床診斷病例資料及抗菌藥物使用情況

3 討論

神經外科術后顱內細菌感染主要包括術后硬膜外膿腫、硬膜下積膿、腦膿腫、腦膜炎、腦室炎等,局部膿腫或積膿由于有影像學改變,相對容易識別和診斷,而對于細菌性腦膜炎或腦室炎,由于手術干擾,其臨床表現、頭部影像學、腦脊液常規和生化改變的特異性降低[3-4],如果有高風險因素,且術后出現發熱,其診斷具有極大挑戰。本研究發現臨床診斷組病例腦脊液WBC、多核白細胞分類及腦脊液蛋白、葡萄糖濃度等與病原學診斷組比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。盡管相對于腦脊液蛋白和WBC,腦脊液葡萄糖低在診斷神經外科術后中樞神經系統感染意義較大,但一些非感染性中樞神經系統疾病同樣可導致腦脊液葡萄糖低,如癌性腦膜炎、蛛網膜下腔出血、白血病/淋巴瘤伴中樞神經系統受累,尤其是癌性腦膜炎,臨床上不容易與細菌性腦膜炎鑒別[5]。本研究中38例臨床診斷病例,29例腦脊液葡萄糖低考慮為血性腦脊液所致,9例腦脊液中找到腫瘤細胞,考慮腫瘤轉移導致葡萄糖低,其中2例髓母細胞瘤病例術后發熱,腦脊液葡萄糖持續低,1例放射治療、化學治療后腫瘤病灶逐漸增大,最后死亡,另1例化學治療后葡萄糖逐漸恢復正常,說明傳統的腦脊液生化檢查對診斷神經外科術后顱內細菌感染存在非特異性,腦脊液病原學檢測仍是診斷神經外科術后顱內細菌感染的重要手段。

傳統的腦脊液培養陽性率低,且受圍手術期抗菌藥物使用的影響,細菌培養陽性率僅為30%～60%[6-7]。研究[8-9]發現腦脊液mNGS檢測與傳統腦脊液培養陽性符合率高,兩者聯合檢測可提高顱內感染病原體檢出率。本研究中,腦脊液細菌培養和mNGS檢測陽性結果一致,1例病例腦脊液培養陰性,mNGS檢測到溶血孿生球菌,結合臨床及轉歸考慮系致病菌,提示腦脊液mNGS檢測可以提高兒童神經外科術后顱內細菌感染的病原菌檢出率。

mNGS檢測病原體陰性的原因有:(1)非感染性因素導致發熱或其他類似感染征象;(2)送檢標本不合適;(3)RNA病原體感染只做了DNA病原學檢測;(4)病原學序列數過低;(5)感染病原體細胞壁較厚,破壁程度不足導致漏檢,如隱球菌和結核分枝桿菌[10-11]?！吨袠猩窠浵到y感染性疾病的腦脊液宏基因組學第二代測序應用專家共識》[10]建議:(1)腦脊液微生物DNA檢測結果為陰性時需要考慮RNA病毒感染的可能,建議送檢腦脊液微生物RNA檢測,并送檢RNA病毒相關的抗體檢測和聚合酶鏈反應(PCR)檢測;(2)腦脊液mNGS結果為陰性時,臨床應關注非感染性病因的可能性,包括自身免疫性腦炎、腫瘤、中樞神經系統血管性疾病等,進一步完成相關檢查與鑒別診斷。神經外科術后腦脊液mNGS檢測陰性的診斷價值仍處于探索階段。非感染性病變神經外科術后顱內細菌感染可來源于術中或術后,且特殊病原菌感染可能性小,因此送檢腦脊液標本檢測細菌DNA不存在標本取樣問題,且腦脊液為無菌標本,嚴格無菌操作下腦脊液mNGS假陽性率不高,理論上術后腦脊液mNGS檢測陰性可基本排除顱內細菌感染。Salzberg等[12]對10例有神經系統癥狀,無法排除感染但傳統臨床微生物檢測結果陰性或檢測結果摸棱兩可的患者,采用mNGS對腦組織、腦膜組織或脊髓標本進行檢測,并同時檢測病理結果及追蹤臨床轉歸,結果顯示5例患者mNGS檢測陰性,病理和臨床轉歸排除了感染因素,故認為mNGS陰性結果有助于排除感染因素。由于神經外科術后顱內細菌感染的金標準是細菌培養陽性,臨床診斷病例無金標準可參照。雖然本研究通過前瞻性干預,未對腦脊液陰性的臨床診斷組28例病例進行經驗性抗顱內感染治療或未達療程,根據臨床轉歸及追蹤隨訪均排除了細菌性腦膜炎,但腦脊液mNGS檢測陰性是否可以排除神經外科術后顱內細菌感染,仍需更多標本進一步驗證。

神經外科術后顱內細菌感染預后差,病死率和致殘率高,病原學確診困難。因此,對術后有中樞神經系統感染危險因素的患者,共識中采用臨床診斷標準指導經驗性抗感染治療,但經驗性抗感染治療常會選擇廣譜抗菌藥物聯合用藥,且療程相對較長,容易導致耐藥菌產生。臨床診斷病例何時停用抗菌藥物也是挑戰之一,術后發熱和腦脊液糖持續降低原因眾多,無法作為持續使用抗菌藥物的指征。孟琨等[13]對86例顱腦腫瘤患者術后發熱原因分析發現,中樞性高熱為顱腦腫瘤患者術后發熱的主要原因(44.2%),顱內感染僅占3.4%。因此,尋找客觀依據指導臨床合理、經驗性使用抗菌藥物至關重要。能否借助mNGS檢測陰性結果指導治療,目前尚處于探索階段。Wilson等[11]在一項多中心研究中采用腦脊液mNGS檢測和傳統方法分析了204例(其中40.8%的患者為免疫抑制患者)有腦膜炎、腦炎或脊髓炎癥狀患者的病原學,57例患者病因明確為感染因素,其中mNGS陽性31例,而mNGS檢測陰性的26例患者中,18例是通過非腦脊液標本診斷(11例通過血清病毒和神經梅毒抗體陽性診斷,7例通過組織標本活檢診斷,除腦脊液mNGS外,腦脊液培養、聚合酶鏈反應和抗原等常規檢查均陰性),另8例因腦脊液mNGS檢測序列數低于預先設立的閾值,按常規腦脊液檢測證實為臨界陽性或不確定,故研究認為腦脊液mNGS檢測陰性結果聯合常規腦脊液病原學檢測陰性結果,可以幫助臨床醫生為疑診自身免疫性腦炎患者排除活動性感染,從而盡早啟動免疫抑制治療。本研究中,28例臨床診斷病例中,mNGS病原學和腦脊液培養均陰性,結合臨床資料,其中16例病例未進行經驗性抗顱內感染治療,另12例病例在mNGS回報陰性后結合臨床資料及時停止經驗性抗顱內感染治療,追蹤隨訪28例病例均無細菌性腦膜炎發生,其入顱抗菌藥物平均使用時間低于干預前的臨床診斷病例,提示神經外科術后腦脊液mNGS檢測陰性結果有助于指導神經外科術后細菌性腦膜炎臨床診斷病例入顱抗菌藥物的使用,且術后腦脊液標本僅需進行細菌DNA檢測,在一定程度上也減輕了mNGS檢測費用昂貴的缺點。對于有可能因序列數太低所致的假陰性,根據臨床特點,可以選擇復查。本研究中3例病例因發熱、腦脊液糖持續低,初次腦脊液培養和mNGS均陰性,復查腦脊液培養及mNGS檢測均陰性,及時停用了抗顱內感染治療。建議有條件的單位當患者臨床表現難以排除顱內感染時,可盡早借助于腦脊液mNGS來綜合判斷。

本研究第一次在經驗性使用抗顱內感染藥物前送檢腦脊液培養和mNGS檢測。采用腦脊液病原學mNGS檢測結果指導神經外科術后顱內細菌感染臨床診斷病例抗菌藥物的使用,后續將納入更多病例進行研究,為神經外科術后抗菌藥物的合理使用提供客觀依據。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。