夏枯草提取物對間變性大細胞淋巴瘤細胞株Karpas 299生物學特性的影響*

李偉明,張凱新,薛偉麗,付曉瑞,孫振昌,張明智

(1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046; 2.鄭州大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450052)

間變性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma,ALCL)是惡性腫瘤非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)中的一類[1],占淋巴瘤的3%～8%,好發于成年人,男性多見,男女比例約為2∶1[2]。在成人NHL中ALCL發病率為1%～2%,在兒童NHL中發病率10%～15%[3]。ALCL的臨床表現和體征無特異性,因此診斷依賴于組織學特點、臨床特點、免疫表型、分子生物學表達等,CD30抗原陽性是其特征性表達。分子生物學表達的異常是淋巴瘤分子診斷的重要依據,同時為淋巴瘤的預后、治療提供了一定的參考價值[4]。大多數患者在經CHOP、CHOPE等方案治療后病情得到緩解,但容易復發,復發治療耐藥率較高。使用CD30藥物可以有效控制,影響兒童及青少年ALCL預后的不良因素是腫瘤細胞CD3的表達、臨床B癥狀、病理類型為非普通型、皮膚和骨髓受累[5]。目前該病的治療方法主要是放療、化療和骨髓移植,但臨床療效一般,有多數患者出現耐藥和復發。中醫藥現代化在提高人民健康水平方面發揮顯著作用。夏枯草是治療淋巴瘤的常用中藥,具有清肝瀉火、散結消腫的作用。國內相關研究證實夏枯草對淋巴瘤、甲狀腺癌、肝癌等腫瘤均有治療作用[6-9]。本研究以夏枯草提取物為研究對象,觀察其對ALCL的干預效果,探討其可能的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

ALCL細胞系Karpas 299細胞,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫,傳代培養。

1.2 藥品、試劑與儀器

夏枯草,購自河南中醫藥大學第三附屬醫院中草藥房,由鄭州大學藥學院經乙醇提取。國產培養基RPMI 1640, 500 mL/瓶,美國gibco公司產品,批號8122281;低內毒素胎牛血清, 100 mL/瓶,杭州四季青生物工程材料有限公司產品,批號10281335;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(500 T,批號211104Z01-08)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-膜聯蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡檢測試劑盒(50 T,批號220412L03-08),蘇州宇恒生物科技有限公司產品;全蛋白提取試劑盒(強),50 T,北京索萊寶科技有限公司產品,批號20595;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA )蛋白定量試劑盒,康為世紀生物科技股份有限公司產品,批號13722;重組B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)單克隆抗體[EPR17509],100 μL/支,艾博抗公司產品,批號HC37-1250021232;Bcl2關聯X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)多克隆抗體,100 μL/支,浙江三鷹化學試劑有限公司產品,批號121258531;二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒,100 mL/瓶,上海碧云天生物技術有限公司產品,批號665072。IGS60型恒溫培養箱、Attune CytPix型流式細胞儀,美國賽默飛公司產品;5424型低溫高速離心機,美國艾本德公司產品;Eclipse E100型倒置光學顯微鏡,日本尼康公司產品;SW-CJ-1d型無菌操作臺,蘇凈凈化有限公司產品;DYCZ-24DN型電泳儀,北京六一儀器廠產品。

1.3 細胞培養

將RPMI 1640培養基和胎牛血清按照9∶1比例充分混勻,培養條件為溫度37.0 ℃、 CO2體積分數50 mL/L,將細胞轉移至細胞培養瓶,加入細胞培養液,放置細胞培養箱中進行培養。取處于對數生長周期細胞進行實驗。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 Karpas 299細胞的增殖

制備細胞懸液,稀釋細胞終濃度到2.0×105/mL,接種至96孔細胞培養板,每個培養孔加100 μL細胞懸液,每個樣本重復3個孔。將Karpas 299細胞分為空白組、夏枯草提取物組、長春新堿組,將質量分數100、50、25、12.5、6.25 mg/L的夏枯草提取物、質量分數0.008、0.004、0.002、0.001、0.000 5 mg/L的長春新堿分別加入Karpas 299細胞中,放置37 ℃培養箱中培養,分別作用24 h 、48 h和72 h。其間通過倒置顯微鏡觀察Karpas 299細胞的生長狀態,主要包括細胞數量、胞體、胞質、折光性等。培養完成后,每個培養孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續培養1～4 h。將紫外分光光度儀波長設置為450 nm,每0.5 h檢測1次OD值,計算Karpas299細胞的抑制率和藥物半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

1.4.2 Karpas 299細胞的凋亡

通過流式細胞儀檢測。將Karpas 299細胞分為空白組、夏枯草提取物組、長春新堿組,分別培養,將細胞濃度稀釋至2.0×105/mL,以33.2 mg/L 的夏枯草提取物、0.003 mg/L的長春新堿分別作用Karpas 299細胞48 h,然后轉移至低溫高速離心機中,離心半徑10 cm、轉速10 000 r/min,4 ℃下離心5 min,收集細胞。用預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2次,收集(1～5)×105細胞。加入100 μL的1×結合緩沖液重懸細胞,加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI,輕輕混勻。上機前避光、室溫下反應10 min,加入400 μL 1×結合緩沖液,混勻;采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,在1 h內完成。

1.4.3 Karpas 299細胞中Bcl-2、Bax蛋白的表達

采用蛋白質印跡法(Western blot)檢測。分組和細胞收集方法同1.4.2。將放射免疫沉淀法(radio immuno precipitation assay,RIPA) 裂解液1 mL和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟10 μL混勻,在冰上裂解10 min,用移液槍反復吹打,取上清液用于蛋白濃度測定。記錄取樣量,根據取樣量后續加入相應體積的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液進行電泳實驗,采用Western blot法半定量分析。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 夏枯草提取物對Karpas 299細胞增殖的影響

與空白組對比,不同質量分數夏枯草提取物均有抑制細胞增殖的作用,呈劑量和時間相關性。作用24、48和72 h,IC50分別是(52.6±3.7)mg/L、(33.2±1.8)mg/L、(64.05±4.6)mg/L,顯示夏枯草提取物對Karpas299細胞作用48 h的IC50最低。見表1。

表1 不同質量分數夏枯草提取物對Karpas 299細胞增殖的影響

倒置顯微鏡下:空白組Karpas 299細胞呈串珠樣生長,懸浮胞體圓潤,胞質透明、均勻,折光性良好。夏枯草提取物組、長春新堿組隨時間延長,細胞凋亡的數量逐漸增加,Karpas 299細胞呈現單個懸浮生長,部分細胞出現胞體皺縮,少數細胞的折光性有所減弱,細胞的顆粒數目明顯增多。見圖1。

圖1 各組Karpas299細胞生長狀態對比(×10)

2.2 夏枯草提取物對Karpas 299細胞凋亡的影響

與空白組對比,長春新堿組、夏枯草提取物組的凋亡率升高,差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明,長春新堿和夏枯草提取物均有促進Karpas 299細胞凋亡的作用。見表2。

表2 各組Karpas 299細胞凋亡率對比

2.3 夏枯草提取物對Karpas 299細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與空白組對比,夏枯草提取物組和長春新堿組的Bcl-2蛋白表達下降(P<0.05),Bax蛋白表達上調(P<0.05)。見表3、圖2。

1.空白組;2.夏枯草提取物組;3.長春新堿組

表3 各組Karpas 299細胞Bcl-2、Bax蛋白表達對比

3 討 論

根據淋巴瘤的臨床表現可將其歸于中醫學“瘰疬”“惡核”“石疽”“失榮”“痰核”等范疇[10]。中醫藥對淋巴瘤的認識在病因、病機、治療等方面均有不同程度的進步。齊瑞麗等研究發現淋巴瘤瘀血內阻證居多,且不同類型的淋巴瘤的中醫證型有所差別,彌漫大B細胞淋巴瘤以痰瘀互結證居多,濾泡淋巴瘤以痰濕凝結證居多[11],因此化痰散結成為中醫治療淋巴瘤的主要治則?；瞪⒔Y類的中藥有半夏、陳皮、夏枯草[12]、膽南星等。

ALCL是一種高度惡性淋巴瘤,5年生存率為52%[13]。治療可實施放療、化療、骨髓移植等方法。ALCL細胞形態特殊,類似R-S細胞,有時ALCL可與霍奇金淋巴瘤和惡性組織細胞病混淆。ALCL臨床常有皮膚侵犯,伴或不伴淋巴結及其他結外部位病變。免疫表型可為T細胞型。ALCL的預后與腫瘤的發生年齡、有無癥狀、原發部位、臨床分期及免疫學分型有關,與組織學分型無明顯關系[14]。兒童及青年對治療反應好,5年生存率遠高于成年人。臨床無癥狀者較有癥狀者預后好,原發結內較結外者預后好[15]?；熥顬檫m宜,多數病例可完全緩解,復發率低,3年和5年生存率均較高。放療起初效果良好,但遠期易復發[16]。因此,需要更多的治療方案參與到ALCL的治療中。近年來中藥在調控淋巴瘤相關信號通路分子的研究中取得了較大進展,為闡釋淋巴瘤的發病和耐藥復發機制提供了思路。探討中藥單體及復方在淋巴瘤治療中的主要靶點及優勢可以為優化淋巴瘤治療方案提供相關依據[17]。

夏枯草包含許多活性化學成分,主要包括三萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類等化合物,具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用[18]。董佳等[19]通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺篩選出夏枯草-半夏藥對的有效成分及其對應的靶基因,然后通過GeneCards等國內外數據庫搜索彌漫大B細胞淋巴瘤的疾病靶點,分析出夏枯草-半夏治療彌漫大B細胞淋巴瘤的作用靶標,并構建了“夏枯草-半夏活性成分-彌漫大B細胞淋巴瘤靶標基因”結構網絡圖,通過PPI網絡大數據分析篩選出核心靶基因,發現夏枯草-半夏治療彌漫大B細胞淋巴瘤的重點活性成分共13類,其作用的關鍵靶點是蛋白激酶B1、JUN、TP53、絲裂原活化蛋白激酶、腫瘤壞死因子等。付曉瑞等發現,夏枯草提取物對B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤均有不同程度的抑制作用,且對Raji細胞的作用大于Jurkat細胞,其機制可能與調節B淋巴細胞瘤-2基因和Bax蛋白的表達以誘導細胞凋亡有關。細胞凋亡是一個非常關鍵的生物學過程, 對調控細胞的穩態發揮了重要的作用,主要包含兩條調控細胞凋亡的信號通路, 即受體介導和線粒體介導的細胞凋亡途徑[20-21]。

本實驗研究證實,不同質量分數的夏枯草提取物均能抑制ALCL的Karpas 299細胞增殖。筆者通過計算IC50值發現,隨著藥物質量分數的增加Karpas 299細胞的抑制率逐漸升高;隨著給藥時間的延長Karpas 299細胞的抑制率也呈現逐漸升高,但作用72 h的細胞死亡是由于細胞培養液的缺乏導致,而非藥物的抑制增殖作用,因此48 h的作用時間最佳。此外,本研究還發現,在促進凋亡方面,夏枯草提取物顯示出與長春新堿一樣的療效,并通過蛋白質印跡法證實夏枯草提取物促凋亡的作用機制與Bcl-2家族成員的調節控制有關。

本研究結果顯示,夏枯草提取物可誘導Karpas 299細胞凋亡,抑制Bcl-2蛋白表達,上調Bax蛋白表達,提示其抑制Karpas 299細胞的增殖與誘導Karpas 299細胞的凋亡有關。在既往的研究中,本課題組也發現夏枯草提取物通過JAK/STAT信號通路發揮抗腫瘤作用,抑制Karpas 299細胞[22];后期還需要完善更多細胞系的研究來驗證夏枯草提取物的作用效果和機制。