琥珀酰化修飾對甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性的影響

李曉旭 王猛 李晶晶 馬小霞 梁文裕 王玲霞

摘 要 通過定點突變和生物學分析，研究了賴氨酸琥珀酰化對GAPDH活性的影響。結果表明：發菜GAPDH基因全長為1 014 bp，由338個氨基酸組成，其中K264位點在藻類中高度保守。將K264位點的氨基酸K（AAA）突變為R（AGA），野生型和突變型GAPDH在大腸桿菌中表達，獲得一個36.61 ku的外源蛋白。純化后蛋白活性測定發現，發生琥珀酰化修飾比未發生琥珀酰化修飾的GAPDH（K264）活性顯著降低，表明琥珀酰化修飾參與發菜GAPDH活性的調節。研究結果為深入研究發菜GAPDH的分子信息和生物學功能提供理論參考。

關鍵詞 發菜；干旱脅迫；GAPDH；琥珀酰化修飾；定點突變

蛋白質琥珀酰化修飾是一種普遍存在、可逆且高度調控的蛋白質翻譯后修飾方式，通過改變蛋白質的結構、穩定性、復合體的形成及酶活性等，參與調控光合作用、糖酵解／糖異生、TCA循環和脂肪酸代謝等多種細胞過程，在植物生長、發育、開花、逆境脅迫及激素信號應答等中起重要的調控作用。近年來，蛋白質琥珀酰化修飾調控機制研究首先是在哺乳動物、細菌等物種中展開。Park等[1]在小鼠細胞中發現，deacylase Sirtuin 5（SIRT5）是細胞和組織中去琥珀酰化修飾的主要酶，SIRT5抑制丙酮酸脫氫酶復合物體（PDC）和琥珀酸脫氫酶（SDH）兩個細胞呼吸相關酶活性。另外，研究發現小鼠中的限速生酮酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶2 （HMGCS2）的活性受特異性的去琥珀酰化酶SIRT5的調控，HMGCS2作為線粒體中賴氨酸琥珀酰化修飾的調節因子，通過抑制HMGCS2的活性限制酮的生成[2]。在天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）中發現一種類似Sirtuin的去琥珀酰化修飾酶ScCobB2，并證明了它在S. coelicolor的多個生物學過程中具有關鍵的調節作用，主要影響甘油醛-3-磷酸脫氫酶、烏頭酸水合酶和幾種核糖體蛋白的豐度[3]。此外，TCA循環中的異檸檬酸脫氫酶2 （IDH）被SIRT5去琥珀酰化，以維持細胞NADPH穩態并增強細胞抗氧化防御[4]。這些研究表明，琥珀酰化修飾可能是呼吸作用相關酶活性的重要調節因素。至今植物和藍藻中有關琥珀酰化修飾調節酶活性的研究報道較少。在植物中，將體外重組表達蛋白（酶）與SIRT5孵育，然后檢測對照與處理組的酶活性變化，發現去琥珀酰化修飾酶SIRT5改變了水稻葉片中過氧化氫酶和谷胱甘肽S-轉移酶的活性[5]。在藍藻中，為了評估蛋白質翻譯后修飾（丙酰化和丙二酰化修飾）對果糖-1，6二磷酸酶（FbpI）和磷酸甘油酸酯激酶（PGK）活性的影響，對FbpI的K156和PGK的K205進行定點突變，K156和K205的突變導致了FbpI和PGK酶活性顯著降低，表明了賴氨酸丙酰化和丙二酰化修飾參與調節FbpI和PGK酶活性[6-7]。但是在藍藻中目前還沒有琥珀酰化修飾調節酶活性的相關報道。

發菜（Nostoc flagelliforme Born. et Flah）是一種主要分布于西北干旱-半干旱荒漠地區的陸生固氮耐旱藍藻，對干旱具有極強的耐受性，研究發菜耐旱的分子調控機理具有重要意義[8]。GAPDH是細胞質中參與糖酵解的重要酶[9]，主要催化依賴于NAD的甘油醛-3-磷酸轉化為1，3二磷酸甘油酸，為植物的生長發育提供ATP和細胞代謝所需中間產物。在植物生長過程中，呼吸作用是植物所需能量及體內各種物質之間轉換代謝的樞紐，對植物的生長發育尤其是對逆境的適應起重要作用。通過呼吸損失的碳水化合物的比例決定了植物的整體代謝效率[10]。干旱脅迫往往會導致植物的光合作用下降，除非碳消耗同時按比例減少，否則干旱期間光合作用能力下降會導致負碳平衡[11]。有研究報道，干旱脅迫下不同品種金銀花和蘆葦的呼吸速率下降，即呼吸作用消耗的光合產物減少，以利于碳水化合物代謝平衡，提高植物耐旱性[12-13]。耐旱小麥在土壤嚴重干旱條件下，通過降低根系呼吸和生物量提高其的生長和生理活性，這也使得在干旱地區耐旱小麥比干旱敏感品種更有優勢[14]。值得注意的是，越來越多的證據表明，GAPDH不僅是糖酵解途徑的關鍵酶，而且作為一種多功能蛋白廣泛參與生物體內的轉錄調控、信號轉導和 DNA修復等過程，尤其是生物和非生物脅迫顯著誘導GAPDH的轉錄[15]。筆者前期研究發現GAPDH 中的8個位點發生了琥珀酰化修飾，且干旱脅迫下發菜的GAPDH（K169、K264）琥珀酰化修飾水平顯著上調（FC>1.5， P<0.05）[16]。但目前為止發菜GAPDH基因的分子信息及是否會通過琥珀酰化修飾改變其酶活性進而響應干旱脅迫尚未明確。因此，本研究從發菜基因組中克隆GAPDH基因，并采用定點突變對發菜琥珀酰化修飾GAPDH的保守性位點進行單一點突變，以驗證琥珀酰化修飾對其酶活性的影響，進一步闡釋蛋白質琥珀酰化修飾對發菜干旱脅迫的響應? 機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發菜藻絲體于2020年10月13日采自寧夏賀蘭山東麓（38.41′N，105.95′E）發菜自然生長地，自來水沖洗后自然風干，貯藏于-80 ℃，? 備用。

1.2 發菜GAPDH琥珀酰化修飾位點質譜檢測及序列分析

發菜GAPDH琥珀酰化修飾位點質譜檢測參照Li等[16]的方法。運用NCBI中的BLAST進行序列比對分析。利用SWISS-MODEL預測GAPDH的三級結構。

1.3 發菜野生型GAPDH基因克隆及突變型基因序列的合成

采用CTAB法提取發菜總DNA[17]。根據發菜的GAPDH序列設計特異性引物（表1），擴增條件為94 ℃變性8 min，（94 ℃ 50 s，55.9 ℃?? 50 s，72 ℃ 1 min）進行25個循環，72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，將回收純化的目的基因與pMD18-T載體進行連接，然后涂布于Amp篩選的LB固體培養基上培養后進行菌液PCR驗證，并對菌液進行測序和BLAST檢索比對。對GAPDH琥珀酰化蛋白修飾位點進行序列保守性分析，根據野生型基因的測序結果，將具有保守性且差異表達的琥珀酰化修飾蛋白K位點突變為R[6，18]，以保持賴氨酸的電性不變，由上海生工生物合成GAPDH突變型基因序列。

1.4 GAPDH基因原核表達

根據發菜GAPDH的基因測序結果，設計并合成酶切引物（表1）。對含有GAPDH基因的陽性菌液進行PCR擴增，然后使用BamH I和Xho I分別對目的基因與pET28a進行雙酶切? 1 h。將連接后獲得的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，最后涂布于Kan篩選的LB固體培養基上，37 ℃過夜倒置培養后挑取陽性克隆子至含Kan的LB液體培養基內培養12 h，進行雙酶切鑒定。過夜培養物加入100 mL含Kan的LB液體培養基，37 ℃，180 r/min震蕩培養至OD600為0.5～1.0。1 mmol/L的IPTG進行誘導表達GAPDH，最后進行12.5% SDS-PAGE電泳檢測，用BeyotimeTM考馬斯亮藍超快染色液（中國，上海）染色1 h，蒸餾水脫色。

1.5 GAPDH原核表達產物的蛋白純化

取2 mL的磁珠懸液用于蛋白純化，磁性分離后棄上清，加入5 mL的Binding buffer（20 mmol/ L Phosphate Buffer， 500 mmol/ L NaCl， 5～50 mmol/ L Imidazole， pH 7.4）重復洗滌磁珠3次，棄上清。將驗證表達成功的野生型和突變型GAPDH菌液進行擴大培養，4 ℃， 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入10 mL的Binding buffer進行重懸，低溫下（冰浴）超聲破碎（200 W、15 min），4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入裝有預處理磁珠的離心管中，在4 ℃，100 r/min的搖床上結合2 h，然后進行磁珠洗滌，具體操作步驟參照Beaver BeadsTM His-tag Protein Purification 說明書，最后采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度[19] 。

1.6 GAPDH酶活性檢測

按照蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒（中國，江蘇）進行GAPDH活性測定。

2 結果與分析

2.1 發菜GAPDH琥珀酰化修飾位點同源性? 比對

GAPDH是發菜糖酵解途徑中的關鍵酶，催化1，3-二磷酸甘油酸和NADH的形成。筆者前期研究發現在干旱脅迫下，發菜GAPDH中有8個可靠的琥珀酰化修飾位點（K47、54、110、169、216、226、228、264）（表2），且GAPDH（K264）的琥珀酰化修飾發生了顯著變化[16]，其相應肽段的MS/MS譜見圖1-A。多序列比對分析表明，GAPDH的K264位點在藻類中高度保守（圖1-B）。通過SMART軟件預測，發現GAPDH（K264）位點在C端結構域上。高度保守的K264位于α-螺旋區域（圖2）。因此選擇GAPDH的K264作為突變位點，進一步分析該琥珀酰化修飾位點是否會影響GAPDH的酶活性。

2.2 發菜GAPDH基因的突變

以發菜DNA為模板，PCR擴增得到1 014 bp的單一條帶（圖3-A）。Blastn檢索比對，GAPDH基因由338個氨基酸組成，其理論分子質量為36.61 ku。將GAPDH的K264位點突變為R，即將該位點的AAA序列突變為AGA序列，通過DNA測序驗證表明，該位點突變成功（圖3-B）。

2.3 野生型和突變型GAPDH的原核表達

構建GAPDH表達載體pET28a-GAPDH，轉化至大腸桿菌，然后進行質粒雙酶切驗證，分別得到pET28a與GAPDH和GAPDH突變型兩條條帶，表明表達載體構建成功 （圖4）。IPTG誘導后GAPDH野生型和突變體在大腸桿菌BL21中均可以高效表達。[FL）]

2.4 野生型和突變型GAPDH蛋白純化和酶活性分析

為了進一步檢測發菜野生型和突變型GAPDH的活性是否受到琥珀酰化修飾的影響，對誘導表達成功的GAPDH蛋白進行了純化。SDS-PAGE結果顯示，野生型和突變型GAPDH蛋白條帶單一且清晰，與預測蛋白分子量大小一致（圖5-A）。酶活性檢測結果顯示，與野生型GAPDH（K264）相比，GAPDH突變型（K264R）的活性顯著增加（P <0.05）（圖5-B），表明GAPDH（K264R）琥珀酰化修飾會顯著影響其酶活性。

3 討? 論

近年來，研究發現GAPDH在多種細胞過程中的新作用，不僅僅作為催化糖酵解的關鍵酶，而且正在成為許多基本細胞過程的功能和調節的關鍵成分，特別是GAPDH在植物細胞中一個重要的非催化作用是對各種非生物脅迫的響應，包括鹽、干旱、熱、冷、厭氧和鎘毒性[20-26]。非生物脅迫誘導GAPDH的表達，這可能是植物適應環境變化的自然機制。

筆者前期研究發現參與發菜糖酵解的GAPDH有8個位點發生了琥珀酰化修飾，其中K264位點在發菜響應干旱脅迫過程中發生了顯著變化[16]。為了進一步驗證GAPDH酶活性是否受琥珀酰化修飾影響進而響應干旱脅迫，筆者對糖酵解的關鍵酶GAPDH琥珀酰化修飾位點進行分析。本研究通過設計特異性引物克隆獲得? 1 014 bp的野生型發菜GAPDH全序列。將GAPDH的K264位點的AAA序列突變為AGA序列，獲得突變型GAPDH。原核表達得到一個分子量大小約36.61 ku的外源蛋白，且野生型和突變型GAPDH在大腸桿菌BL21中均高效表達。多序列比對分析發現GAPDH的K264位點在藻類中高度保守，且K264琥珀酰化修飾位點在發菜響應干旱脅迫時顯著上調，暗示了這個位點在GAPDH進化過程中功能的保守性具有重要的意義。通過位點突變發現K264對R的突變導致GAPDH酶活性顯著增加（P<0.05），這表明GAPDH（K264）的琥珀酰化修飾會導致GAPDH的酶活性下降，琥珀酰化修飾可能影響GAPDH酶活性。因為琥珀酰化的賴氨酸基團被賦予2個負電荷，價態從+1變成-1，高于乙酰化（+1到0）和單甲基化（無變化）造成的電荷改變[27]，并在賴氨酸上增加了一個琥珀酰基（100 D）[18]。這種結構變化對發生琥珀酰化修飾的蛋白的結構和功能有著更實質性的影響。因此，K264位點的琥珀酰化引起GAPDH構象和酶活性的顯著變化，并進一步改變了發菜細胞呼吸作用等代謝過程。呼吸作用決定了植物在長時間干旱下的生存和生產力的快速恢復[28]。植物在干旱脅迫下，體內水分代謝與碳代謝會發生失衡，而植物根系呼吸速率上升，使得ATP合成減少和活性氧增加[11]，從而對植物的生長造成傷害。為了維持植物新陳代謝，植物通過呼吸作用的下調，維持碳代謝平衡[29]。因此認為發菜能耐受極端干旱環境且在復水后迅速恢復生理活性[30]，其很可能通過降低呼吸速率和減少碳消耗適應干旱。

蛋白質的功能受轉錄、翻譯及蛋白質翻譯后修飾等多因素、多水平調節。本研究結果揭示了琥珀酰化修飾對發菜GAPDH活性的調節作用，證實了琥珀酰化修飾能夠改變GAPDH的活性，并推測發菜可能由于GAPDH活性下降等原因降低呼吸作用來提高其耐旱性。這一研究發現為今后進一步深入探究發菜GAPDH響應非生物脅迫的重要作用提供了參考。

參考文獻 Reference：

［1］ PARK J，CHEN Y，TISHKOFF D X，et al.SIRT5-mediated lysine desuccinylation impacts diverse metabolic pathways[J].Molecular Cell，2013，50（6）：919-930.

[2]RARDIN M，HE W，NISHIDA Y，et al.SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks[J].Cell Metabolism，2013，18（6）：920-933.

[3]ZHANG H，LI P，REN S X，et al.ScCobB2-mediated lysine desuccinylation regulates protein biosynthesis and carbon metabolism in Streptomyces coelicolor[J].Molecular & Cellular Protemics，2019，18（10）：2003-2017.

[4]ZHOU L S，WANG F，SUN R Q，et al.SIRT5 promotes IDH2 desuccinylation and G6PD deglutarylation to enhance cellular antioxidant defense[J].EMBO Reports，2016，? 17（6）：811-822.

[5]ZHOU H，FINKEMEIER I，GUAN W，et al.Oxidative stress-triggered interactions between the succinyl- and acetyl-proteomes of rice leaves[J].Plant，Cell & Environment，2018，41（5）：1139-1153.

[6]MA Y Y，YANG M K，LIN X H，et al.Malonylome analysis reveals the involvement of lysine malonylation in metabolism and photosynthesis in cyanobacteria[J].Journal of Proteome Research，2007，16（5）：2030-2043.

[7]YANG M K，HUANG H，GE F.Lysine propionylation is a widespread post-translational modification involved in regulation of photosynthesis and metabolism in cyanobacteria[J].International Journal of Molecular Sciences，2019，? 20（19）：4792.

[8]王 猛，李曉旭，張 箏，等.發菜PspA基因克隆及其轉基因植物的抗旱性分析[J].植物遺傳資源學報，2021，22（2）：224-233.

WANG M，LI X X，ZHANG ZH，et al.Analysis of drought resistance of PspA gene cloning and transgenic plants[J].Journal of Plant Genetic Resources，2021，22（2）：224-233.

[9]JAMES T，HARPER，PATRICK J，et al.Keeling.Nucleus-encoded，plastid-targeted glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH） indicates a single origin for chromalveolate plastids[J].Molecular Biology and Evolution，2003，20（10）：1730-1735.

[10] DAVIDSON E A，VERCHOT L V，CATTANIO J H，et al.Effects of soil water content on soil respiration in forests and cattle pastures of eastern Amazonia[J].Biogeochemistry，2000，48（1）：53-69.

[11]FAROOQ M，WAHID A，KOBAYASHI N，et al.Plant drought stress：effects，mechanisms and management[J].Agronomy for Sustainable Development，2009，29（1）：185-212.

[12]戚志偉，姜 楠，高燕娜，等.崇明島東灘濕地蘆葦光合作用對土壤水鹽因子的響應[J].濕地科學，2016，14（4）：538-545.

QI ZH W，JIANG N，GAO Y N，et al.Response of reed photosynthesis to soil water and salt factors in dongtan wetland of chongming? island[J].Wetland Science，2016，14（4）：538-545.

[13]彭素琴，劉郁林.不同品種金銀花光合作用對干旱脅迫的響應[J].北方園藝，2016（19）：191-193.

PENG S Q，LIU Y L.Photosynthesis of different varieties of honeysuckle in response to drought stress[J].Northern Horticulture，2016（19）：191-193.

[14]LIU H S，LI F M.Root respiration，photosynthesis and grain yield of two spring wheat in response to soil drying[J].Plant Growth Regulation，2005，46（3）：233-240.

[15]MIRKO Z，SIMONA F，ALEX C，et al.Plant cytoplasmic GAPDH：redox post-translational modifications and moonlighting properties[J].Frontiers in Plant Science，2013，4：450.

[16]LI X X，WANG L X，WANG M，et al.Global analysis of protein succinylation modification of Nostoc flagelliforme in response to dehydration[J].Journal of Proteomics，2021，237：104149.

[17]梁文裕，焦廣飛，周有文，等.干旱脅迫條件下發菜Ferritin差異表達與基因克隆[J].植物科學學報，2012，? 30（1）：75-81.

LIANG W Y，JIAO G F，ZHOU Y W，et al.Differential expression and gene cloning of Nostoc flagelliforme under drought stress[J].Journal of Plant Science，2012，? 30（1）：75-81.

[18]ZHANG Z H，TAN M J，XIE Z Y，et al.Identification of lysine succinylation as a new post-translational modification[J].Nature Chemical Biology，2011，7（1）：58-63.

[19]LI X X，DING M M，WANG M，et al.Proteome profiling reveals changes in energy metabolism，transport and antioxidation during drought stress in Nostoc flagelliforme[J].BMC Plant Biology，2022，22（1）：162.

[20]JEONG M J，PARK S C，KWON H B，et al.Isolation and characterization of the gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，278（1）：192-196.

[21]JIANG Y，YANG B，HARRIS N S，et al.Comparative proteomic analysis of NaCl stress-responsive proteins in Arabidopsis roots[J].Journal of Experimental Botany，2007，58（13）：3591-3607.

[22]BAEK D，JIN Y，JEONG J C，et al.Suppression of reactive oxygen species by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Phytochemistry，2008，69（2）：333-338.

[23]WAWER I，BUCHOLC M，ASTIER J，et al.Regulation of Nicotiana tabacum osmotic stress-activated protein kinase and its cellular partner GAPDH by nitric oxide in response to salinity[J].Biochemical Journal，2010，429（1）：73-83.

[24]GUO L，DEVAIAH S P，NARASIMHAN R，et al.Cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases interact with phospholipase Dδ to transduce hydrogen peroxide signals in the Arabidopsis response to stress[J].Plant Cell，2012，24（5）：2200-2212.

[25]KRASENSKY J，JONAK C.Drought，salt，and temperature stress-induced metabolic rearrangements and regulatory networks[J].Journal of Experimental Botany，2012，63（4）：1593-1608.

[26]LIM H，HWANG H，KIM T，et al.Transcriptomic analysis of rice plants overexpressing PsGAPDH in response to salinity stress[J].Genes，2021，12（5）：641.

[27]YANG Y，GIBSON G E.Succinylation links metabolism to protein functions[J].Neurochemical Research，2019，? 44（10）：2346-2359.

[28]PINHEIRO C，CHAVES M M.Photosynthesis and drought：can we make metabolic connections from available data？ [J].Journal of Experimental Botany，2011，? 62（3）：869-882.

[29]董 蕾，李吉躍.植物干旱脅迫下水分代謝，碳饑餓與死亡機理[J].生態學報，2013，33（18）：5477-5483.

DONG L，LI J Y.Water metabolism，carbon starvation and death mechanism under plant drought stress[J].Acta Ecologica Sinica，2013，33（18）：5477-5483

[30]LIU Y H，YU L，KE W T，et al.Photosynthetic recovery of Nostoc flagelliforme （Cyanophyceae） upon rehydration after 2 years and 8 years dry storage[J].Phycologia，2010，49（5）：429-437.

Effect of Succinylation Modification on Activity of Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase

Abstract Lysine succinylation，a reversible and widely distributed post-translational modification，is known to play a regulatory role in both eukaryotes and prokaryotes.Our previous study found significant succinylation of GAPDH in Nostoc flagelliforme under drought stress，however，the effect of succinylated modification on GAPDH enzyme activity remains unclear.In this study，we investigated the influence of lysine succinylation on GAPDH activity by site-directed mutagenesis and biological analysis.The results showed that the GAPDH gene of N.flagelliforme was 1 014? bp in length and consisted of 338 amino acids，of which K264 was highly conserved in algae.The amino acid sequence AAA at K264 site was mutated into R （AGA），and wild type and mutant GAPDH of N.flagelliforme were expressed in E.coli to obtain a 36.61 ku foreign protein.The activity of GAPDH （K264） with succinylation modification after purification was significantly lower than that of GAPDH without the modification，indicating that succinylation modification was involved in the regulation of GAPDH activity in N.flagelliforme.These results confirm that the succinylation modification of GAPDH is an regulation mechanism in response to drought stress of N.flagelliforme，which provide a theoretical basis for further research on the molecular information and biological functions of GAPDH in?? N.flagelliforme.

Key words Nostoc flagelliforme；Drought stress；GAPDH；Succinylation; Site-directed mutagenesis