稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的四大誤區(qū)

張艷娟　陳兆亮　郭建坤

稀釋涂布平板法是一種常見(jiàn)的微生物計(jì)數(shù)方法，該方法通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)推測(cè)樣品中活菌個(gè)數(shù)，其原理是將待測(cè)樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使樣品中的微生物細(xì)胞分散開(kāi)，再取一定量的稀釋液均勻涂布到固體培養(yǎng)基表面，讓分散開(kāi)的單個(gè)細(xì)胞繁殖得到一個(gè)菌落，這樣就可以通過(guò)肉眼可見(jiàn)的菌落數(shù)推理肉眼不可見(jiàn)的微生物細(xì)胞數(shù)。稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的計(jì)算公式為每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）xM，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數(shù)。學(xué)生對(duì)該公式的理解存在多種認(rèn)知誤區(qū)，導(dǎo)致此類問(wèn)題得分率低，現(xiàn)結(jié)合典型試題進(jìn)行分析。

誤區(qū)一 對(duì)平均菌落數(shù)的理解

公式中的C不一定是所有實(shí)驗(yàn)所得菌落數(shù)的平均值，為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說(shuō)服力和減小實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)是將未涂布菌液的培養(yǎng)基放置在相同條件下培養(yǎng)，其目的是排除培養(yǎng)基污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。若空白對(duì)照組平板出現(xiàn)菌落，則說(shuō)明空白對(duì)照組的平板被污染，進(jìn)而推測(cè)實(shí)驗(yàn)組平板也可能被污染，這種情況不能直接將實(shí)驗(yàn)組平板的菌落數(shù)取平均值，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只有空白培養(yǎng)基沒(méi)有出現(xiàn)菌落，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才可信，此實(shí)驗(yàn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個(gè)平板（一般設(shè)置3-5個(gè)平板），選擇菌落數(shù)在30-300的平板計(jì)算平均菌落數(shù)。若重復(fù)實(shí)驗(yàn)中某個(gè)平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn)，如四個(gè)平板的菌落數(shù)分別為42、200、256、234，菌落數(shù)42與其他數(shù)值差異過(guò)大，說(shuō)明該平板操作過(guò)程有誤，則該菌落數(shù)應(yīng)舍棄，若舍棄后不足三個(gè)平板，不能用菌落數(shù)相近的兩個(gè)平板取平均值，應(yīng)找到原因并重做實(shí)驗(yàn)。若計(jì)算每克樣品中的某種菌株數(shù)，則C應(yīng)代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的符合該菌菌落特征的菌落數(shù)的平均值，培養(yǎng)基上其他菌種形成的菌落數(shù)不能一并計(jì)算在內(nèi)。如檢測(cè)1L待測(cè)水樣中的大腸桿菌數(shù)目只統(tǒng)計(jì)大腸桿菌菌落數(shù)的平均值。

例1 在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、150、160、170和591，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為_(kāi)___個(gè)。

解析 應(yīng)選擇菌落數(shù)在30-300的平板計(jì)算平均菌落數(shù)，舍棄菌落數(shù)為13和591的平板，所以平均菌落數(shù)為（150+160+170）÷3=160，每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）xM=160÷0.1x105=1.6x108個(gè)。

誤區(qū)二 對(duì)稀釋倍數(shù)的判定

平板中菌落數(shù)過(guò)少會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差過(guò)大，菌落數(shù)過(guò)多又會(huì)造成計(jì)數(shù)困難，為確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定，應(yīng)合理設(shè)定稀釋倍數(shù)。待測(cè)樣品中微生物數(shù)量越多，所需稀釋倍數(shù)越大，而微生物數(shù)量越少，所需稀釋倍數(shù)越小，如測(cè)定土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用104、105和106倍稀釋；測(cè)定放線菌數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋；測(cè)定真菌數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋；測(cè)定自來(lái)水中大腸桿菌數(shù)量，一般不稀釋，直接進(jìn)行涂布培養(yǎng)。人教版高中生物教材給出的樣品稀釋的流程示范是將10g土樣加入到90mL無(wú)菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1mL加入到9mL無(wú)菌水中得到稀釋100倍的樣液，依次類推（圖1）。若取6g土樣配制成稀釋10倍的土壤溶液，則土壤占混合液的10%，土壤溶液總量為60mL，應(yīng)添加54mL的無(wú)菌水。若取Ig土樣配制成稀釋100倍的土壤溶液，則土壤占混合液的1%，土壤溶液總量為100mL，應(yīng)添加99mL的無(wú)菌水。

例2 佩戴口罩是預(yù)防病原體感染的有效措施之一。使用過(guò)的口罩，如果沒(méi)有妥善處理會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅，某科研團(tuán)隊(duì)欲從不同環(huán)境的土壤中篩選出能高效降解一次性口罩（主要成分是聚丙烯纖維）的細(xì)菌，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）運(yùn)用圖2所示方法對(duì)土樣中的細(xì)菌計(jì)數(shù)，分別在3個(gè)平板上滴加0.1mL稀釋液，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上菌落數(shù)分別是65、66和67，則1g土壤中的活菌數(shù)約為_(kāi)___個(gè)。

解析 本題的關(guān)鍵是根據(jù)圖示判斷稀釋倍數(shù)，將1g土樣加入到99mL無(wú)菌水中，相當(dāng)于直接將土樣稀釋了100倍，再?gòu)南♂?00倍的樣液中取1mL加入到9mL無(wú)菌水中得到稀釋1000倍的樣液，到圖中的第四個(gè)試管，土樣已經(jīng)被稀釋106倍，則每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M=（65+66+67）÷3÷0.1×106=6.6×108個(gè)。

誤區(qū)三 對(duì)體積與質(zhì)量的單位換算

微生物計(jì)算公式中的V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積，通常為0.1mL，但若待測(cè)樣品中微生物數(shù)目較少，接種0.1mL經(jīng)培養(yǎng)后平板上菌落數(shù)達(dá)不到30，可增大接種量（如接種1mL）。試題中經(jīng)常改變涂布平板時(shí)所用的稀釋液和所求樣品的體積和質(zhì)量，要注意做好單位換算，如1cm3=103μL=1mL=10-3L體積和質(zhì)量的換算公式是體積=質(zhì)量÷密度（v=m/ρ），水的密度是1g/cm3，則質(zhì)量為1g的水的體積是1cm3即1mL。

例3 牛、羊等反芻動(dòng)物具有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。圖3是研究人員從瘤胃提取物中獲得尿素分解菌的流程。

（1）實(shí)驗(yàn)中初步估測(cè)甲瓶中細(xì)菌數(shù)為3×106個(gè)/mL，若要在每個(gè)平板上涂布100μL稀釋后的菌液，且保證每個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)不超過(guò)300個(gè)，則至少應(yīng)將甲瓶的菌液稀釋____倍。

解析 1μL等于10-3mL，涂布100μL菌液則涂布0.1mL.設(shè)至少應(yīng)將甲瓶的菌液稀釋X倍，則300÷0.1x10x=3×106，計(jì)算可得X=3，即至少應(yīng)將甲瓶的菌液稀釋103倍。

誤區(qū)四 對(duì)統(tǒng)計(jì)誤差的分析

從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的原理分析，運(yùn)用該方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)日低，因?yàn)闃悠芬话悴灰淄耆稚⒊蓡蝹€(gè)細(xì)胞，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)活細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落，從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的過(guò)程分析，稀釋倍數(shù)是否合適、涂布是否均勻、培養(yǎng)環(huán)境是否能保證微生物正常生長(zhǎng)、計(jì)數(shù)是否存在漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)等情況都會(huì)影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。除此之外，還要考慮培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落數(shù)目的影響，菌落數(shù)目需要每隔一段時(shí)間統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時(shí)間不足遺漏菌落的數(shù)目。

例4 中國(guó)科學(xué)家運(yùn)用合成生物學(xué)方法構(gòu)建了一株嗜鹽單胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵生產(chǎn)PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價(jià)值，工藝流程如圖4，請(qǐng)回答問(wèn)題。

（1）為提高菌株H對(duì)蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液體培養(yǎng)基中將蔗糖作為_(kāi)___，并不斷提高其濃度，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)（指培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新配的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)）以獲得目標(biāo)菌株。培養(yǎng)過(guò)程中宜采用____法對(duì)樣品中的活菌進(jìn)行接種和計(jì)數(shù)，以評(píng)估菌株增殖狀況。若某次取樣中，對(duì)菌液稀釋了105倍后，在每個(gè)平板上涂布菌液的體積為0.1mL，平板上的平均菌落數(shù)為220個(gè)，則菌液中H菌的細(xì)胞數(shù)為_(kāi)___個(gè)/L.菌落數(shù)目需要每隔一段時(shí)間統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣做的目的是____。

解析 該研究的目的是提高菌株H對(duì)蔗糖的耐受能力和利用效率，結(jié)合微生物的代謝需求，其液體培養(yǎng)基應(yīng)該以蔗糖作為唯一碳源。稀釋涂布平板法可以用于統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)目，菌液中H菌的細(xì)胞數(shù)=（C÷V）×M=220÷0.1×105=2.2×108個(gè)/mL=2.2×1011個(gè)/L.選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果是為了防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落數(shù)目，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

基金項(xiàng)目：河北省教育科學(xué)“十四五”規(guī)劃課題“基于核心素養(yǎng)的高中生物學(xué)深度學(xué)習(xí)研究”階段性成果，No。2103372）

（收稿H期：2024-02-03）