HLA-G 3′UTR基因多態性及血清可溶性HLA-G水平與兒童諾如病毒感染的相關性研究*

朱明武,李多多,劉向群,王亞南

1.新鄉醫學院第一附屬醫院檢驗科,河南新鄉 453100;2.新鄉醫學院第一附屬醫院兒內科,河南新鄉 453100;3.新鄉醫學院第二附屬醫院營養科,河南新鄉453002

諾如病毒是引起急性非細菌性胃腸炎暴發及散發的主要病毒,具有傳染性強、變異快的特點,常引起暴發流行。隨著輪狀病毒疫苗接種率提高,諾如病毒已經成為兒童病毒性腹瀉的首位病因,在兒童、免疫力低下人群中普遍易感,嚴重者可因脫水或其他嚴重并發癥而死亡[1]。由于缺乏有效的諾如病毒感染致病動物模型,諾如病毒感染引起的胃腸炎的致病機制目前仍然還不是很清楚。有研究表明,免疫抑制機制通過抑制受感染宿主細胞防御病毒感染的能力或抑制免疫效應細胞消滅病毒轉化細胞,在促進病毒感染方面扮演重要角色[1-2]。人類白細胞抗原-G(HLA-G)是一種非經典的組織相容性復合體Ⅰ類分子,是體內重要的免疫耐受分子,在先天免疫和適應性免疫中發揮重要免疫調節作用。作為體內重要的免疫耐受分子,HLA-G的免疫抑制功能主要是抑制自然殺傷(NK)細胞、細胞毒性T淋巴細胞和抗原呈遞細胞的成熟和功能。此外,HLA-G還可以通過調節細胞因子的產生和誘導免疫調節細胞發揮長期耐受性作用,抑制先天免疫和適應性免疫應答,導致病毒感染細胞的免疫逃逸。而HLA-G 3′非翻譯區(3′UTR)基因多態性(SNP)在HLA-G的功能表達中起關鍵作用,它可以在病理條件下影響mRNA的穩定性和表達。近年來,HLA-G已被證明與人類巨細胞病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、甲型流感病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)等病毒易感性相關,被認為是病毒逃避宿主免疫監視的重要易感基因,然而該基因與兒童諾如病毒感染是否具有關聯目前少見報道[3-4]。本課題擬通過研究HLA-G 3′UTR SNP位點及血清可溶性HLA-G(sHLA-G)水平與兒童諾如病毒感染的相關性,為闡明免疫耐受在兒童諾如病毒感染發生和發展中的可能作用提供資料,也為諾如病毒感染患兒的診斷和治療提供新的思路和理論依據,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月因急性胃腸炎于新鄉醫學院第一附屬醫院兒童門診就診的700例患兒作為研究對象。在新鄉醫學院第一附屬醫院檢驗科完善諾如病毒抗原檢測,篩選后留取確診諾如病毒感染患兒346例作為病例組,其中男196例,女150例,并且以“諾如病毒性腸炎”為檢索條件,通過醫院臨床數據平臺和實驗室大數據平臺收集其臨床資料及實驗室檢查結果,以2020年版兒童急性感染性腹瀉為診療規范,病例組按照患兒病情進展程度分為輕型感染組、中型感染組和重型感染組。病例組納入標準:(1)諾如病毒抗原或RNA檢測陽性;(2)在臨床診斷感染性腹瀉基礎上,大便性狀改變(稀水樣或蛋花湯樣)且排便次數增加(24 h排便次數≥3次)或24 h內出現嘔吐≥2次;(3)大便常規檢查結果提示白細胞計數(WBC)及紅細胞計數(RBC)均≤10/HP;(4)病程不超過2周。排除標準:(1)合并輪狀病毒感染;(2)大便常規檢查結果提示WBC及RBC均>10/HP;(3)細菌、寄生蟲、真菌及其他病原菌感染。另選取同期在新鄉醫學院第一附屬醫院門診進行健康體檢的320例兒童作為對照組,其中男182例,女138例。對照組納入標準:(1)1個月內均無感染性疾病病史;(2)均留有血液標本。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經新鄉醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準。兩組性別、各年齡段占比等一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組和對照組一般資料比較[n(%)]

1.2方法

1.2.1血液基因組提取 對照組和病例組各留取2～3 mL全血標本,使用外周血DNA基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA,采用Nano Drop紫外分光光度計測量A值(A260/A280≈1.8)后進行分裝并冷凍儲存于-70 ℃冰箱備用。

1.2.2HLA-G基因擴增與分型 聚合酶鏈反應(PCR)引物序列來源于文獻[5-7],由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR總體系共25.0 μL,包括PCR Master 12.5 μL(大連康為世紀公司),去離子水9.5 μL,正向、反向引物各1.0 μL(正向引物序列:5′-TGTGAAACAGCTGCCCT GTGT-3′;反向引物序列:5′-CTGGTGGGACAAGGTTCTACTG-3),模板DNA1.0 μL。引物序列HLA-G 3′UTR擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,65.5 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸5 min,共32個循環;擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳,以紫外光下顯示是否出現理想條帶來確定擴增產物的有無。送檢測序,采用DNAstar V7.0軟件分析測序結果。

1.2.3ELISA檢測血清sHLA-G水平 留取所有研究對象外周血2～3 mL,3 000 r/min離心10 min,分別收集血清至EP管。將EP管血清分別吸取100 μL至ELISA微孔板進行sHLA-G水平檢測,兩組標本均做復孔,結果取其測量值的平均值,操作流程嚴格按照試劑盒說明書進行,根據標準品的A值采用GraphPad Prism (Version 6.01)擬合曲線軟件繪制標準曲線,病例組和對照組標本A值帶入回歸方程計算sHLA-G水平,試劑盒檢測sHLA-G的靈敏度為0.05 U/mL。

2 結 果

2.1兩組HLA-G 3′UTR SNP位點基因型和等位基因分布頻率比較 HLA-G 3′UTR共發現8個SNP位點,分別是14 bp+/-(rs371194629)、+3003 T/C(rs1707)、+3010 C/G(rs1710)、+3027 A/C(rs17179101)、+3035 C/T(rs17179108)、+3142 C/G(rs1063320)、+3187 A/G (rs9380142)和+3196 C/G(rs1610696)。除14 bp+/-(rs371194629)和+3142 C/G(rs1063320)外,其余SNP位點均不符合Hardy-Weinberg平衡,不具有人群代表性。病例組和對照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組和對照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.2輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較 輕型、中型和重型感染組分別為150、100、96例。輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.3對照組和病例組血清sHLA-G水平比較 對照組血清sHLA-G水平為(19.94±6.81)U/mL,明顯低于病例組的(34.58±10.13)U/mL,差異有統計學意義(P<0.05)。輕型、中型和重型感染組sHLA-G水平分別為(28.76±16.17)、(31.06±20.77)、(33.56±19.06)U/mL,3組sHLA-G水平兩兩比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.4病例組和對照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型和+3142 C/G基因型對應的血清sHLA-G水平比較 病例組和對照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型(14 bp+/14 bp+、14 bp+/14 bp-、14 bp-/14 bp- )對應的血清sHLA-G水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05);病例組和對照組HLA-G 3′UTR+3142 C/G基因型(CC、CG、GG)對應的血清sHLA-G水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 病例組和對照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型和+3142 C/G基因型對應的血清sHLA-G水平比較

3 討 論

病毒逃避機體免疫監視的一個常見機制是經典的HLA-Ⅰa類抗原缺失或下調,以及非經典的HLA-Ⅰb類抗原(如HLA-e、HLA-F和HLA-G)的新表達[5-7]。在病毒感染背景下,作為免疫抑制檢查點分子HLA-G通過抑制免疫細胞(巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞)的效應功能,抑制先天免疫和適應性免疫應答,維持病毒感染的持續性和易感性。本研究檢測了346例諾如病毒感染患兒血清sHLA-G水平,并采用PCR擴增及基因測序分析了HLA-G 3′UTR 8個SNP位點的基因型和等位基因分布頻率,探討HLA-G 3′UTR SNP及血清sHLA-G水平與兒童諾如病毒感染的相關性。位于HLA-G 3′UTR SNP與多種感染性疾病(病毒感染)的相關性已被報道,如HIV、丙型肝炎病毒、HPV、乙型肝炎病毒、新型冠狀病毒等[8]。在女性HIV、HPV感染患者中,3′UTR 14 bp-和3′UTR+3142 C等位基因與HIV易感性相關,如14 bp+/+純合子等位基因人群HPV18高危型病毒感染的風險增加,患者更容易發生宮頸癌變。另一項關于新型冠狀病毒的研究發現,HLA-G分子參與了機體新型冠狀病毒的感染過程,其可作為監測新型冠狀病毒感染患者治療恢復期機體免疫應答的重要指標[9]。雖然HLA-G 3′UTR的SNP可能通過調節HLA-G的表達而影響病毒對機體的感染,但本研究沒有發現HLA-G 3′UTR SNP與兒童諾如病毒感染的易感性相關。有研究表明,病毒感染患者血清sHLA-G水平明顯高于健康者,而在病毒感染消失后,血清sHLA-G水平與健康人相似[9-10],這與本研究結論一致,可能是由于血清sHLA-G水平升高會影響外周血中T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞和NK細胞等不同類型細胞的功能,導致固有免疫應答或針對病毒抗原的特異性免疫應答受損,健康人血清sHLA-G水平有助于在健康受試者中控制免疫效應細胞的遷移。相反,當血清sHLA-G水平升高(病毒感染)時,會導致T淋巴細胞和NK細胞向炎癥反應部位(病毒感染)或腫瘤微環境的遷移減少,這種控制功能的喪失會導致免疫細胞向外周組織異常遷移,加劇病毒持續感染而導致組織損傷,同時還會下調T淋巴細胞和NK細胞上趨化因子受體的表達,抑制免疫效應細胞在腫瘤微環境或病毒感染部位招募,不同程度地影響疾病的嚴重程度及進程。本研究未發現sHLA-G水平在不同嚴重程度諾如病毒感染患兒中有差異,需要進一步研究進行評價。另有研究發現,3′UTR 14 bp+/- SNP會影響HLA-G mRNA的穩定性和表達[11-12],特別是14 bp-等位基因會增強mRNA的穩定性,使sHLA-G水平升高。而+3187 bp位置的腺嘌呤修飾了HLA-G mRNA中富含腺嘌呤-尿嘧啶元件序列,導致其穩定性下降,使HLA-G水平降低。在+3142 bp位置的一個SNP C>G(rs1063320)通過增加該區域對miR-148a、miR-148b和miR-152的親和力來影響HLA-G位點的表達,進而通過mRNA降解和翻譯抑制降低mRNA的可用性。但本研究并未發現血清sHLA-G水平與14 bp+/- SNP和+3142 C/G SNP有關,這可能是由于sHLA-G在不同疾病(病毒感染)進程中潛在的分子機制也各不相同,同時因為本研究樣本量不夠大,未排除藥物治療因素的影響[13-19]。

綜上所述,在病毒感染背景下,作為免疫抑制分子HLA-G可能發揮了重要作用,諾如病毒感染時血清sHLA-G水平升高可能間接影響諾如病毒感染的易感性,而患兒病情嚴重程度及預后的關聯尚需進一步納入更大樣本量進行研究和驗證HLA-G在諾如病毒感染進展中的功能,為進一步了解諾如病毒的發病機制提供理論依據[20-21],以期為諾如病毒的預防和治療提供新思路。