重癥監護病房新生兒重癥聯合免疫缺陷病篩查結果及致病基因突變分析*

楊 曉,朱麗娜,馬 寧,李 昊,楊茹萊

1.中國人民解放軍總醫院兒科醫學部/中國人民解放軍總醫院第七醫學中心兒科研究所/出生缺陷防控關鍵技術國家工程實驗室,北京 100700;2.浙江大學醫學院附屬兒童醫院遺傳與代謝科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/國家兒童區域醫療中心,浙江杭州 310052

重癥聯合免疫缺陷病(SCID)是由一系列基因突變導致細胞免疫和體液免疫同時受累的X-連鎖/常染色體隱性遺傳罕見病,是導致兒童生長發育障礙甚至死亡的嚴重遺傳性出生缺陷[1-2]。SCID在活產新生兒中的發病率為1/50 000～1/30 000[3],大部分SCID 患者在出生時缺乏明顯特異性表現,由于自身存在嚴重的免疫功能障礙,常因接種卡介苗、脊髓灰質炎病毒疫苗等活疫苗而出現致死性不良結局,如不及時糾正免疫缺陷和采取干預措施,大部分患者在1～2 歲內死亡[4]。由于SCID患兒多存在T細胞數減少或缺乏,實時熒光定量PCR檢測干血斑T細胞受體切除環(TREC)拷貝數的方法可用來進行新生兒SCID篩查。TREC是T細胞在胸腺發育過程中編碼T細胞受體(TCR)基因重組時產生的小片段游離環狀DNA,穩定存在于細胞內,不隨T細胞分裂而復制,可反映胸腺輸出初始T淋巴細胞數量。TREC拷貝數水平越低,表明體內新生成的T細胞數量越少,患SCID的可能性越大[5],這種檢測TREC拷貝數的方法具有較高的靈敏度和特異度。一項涉及美國11個州320萬新生兒的篩查數據顯示,SCID的發病率為1/56 000[6],瑞典相關研究報道的SCID發病率為1/42 700[7-8]。研究顯示,浙江省新生兒疾病篩查中心對浙江地區61 479例新生兒進行了SCID、X-連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)和脊髓性肌萎縮癥(SMA)3種遺傳性疾病的聯合篩查,在篩查陽性新生兒中經血生化及基因檢測確診1例SCID患兒[9]。各國報道的SCID發病率雖然有一定差異,但由于我國人口基數較大,每年新生人口多,預計每年新增SCID患兒可達百例。

SCID篩查通常是在普通新生兒中開展的,目前尚鮮見研究針對NICU新生兒這一特殊群體開展此項篩查,本研究回顧性地檢測227例NICU新生兒的干血斑TREC拷貝數,并通過全外顯子測序對疑似陽性的新生兒進行分子遺傳學診斷,探討在NICU新生兒中進行SCID疾病早篩查、早診斷的意義,分析新生兒性別、胎齡、出生體重及感染情況對TREC拷貝數檢測結果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年11月16日至2020年6月9日在解放軍總醫院第七醫療中心新生兒重癥監護室(NICU)住院的227例新生兒作為研究對象,按性別分為男性組(137例)、女性組(90例)。同時,按胎齡分為7組[10]:超早產兒組(<28周)、極早產兒組(28～31+6周)、中期早產兒組(32～33+6周)、晚期早產兒組(34～36+6周)、早期足月兒組(37～38+6周)、完全足月兒組(39～40+6周)、晚期足月兒組(41～41+6周);按出生體重分為7組[10]:超低出生體重兒組(<1 000 g)、極低出生體重兒組(1 000～<1 500 g)、低出生體重兒組(1 500～<2 500 g)、正常出生體重兒組1(2 500～<3 000 g)、正常出生體重兒組2(3 000～3 500 g)、正常出生體重兒組3(3 500～<4 000 g)、巨大兒組(≥4 000 g)。為驗證NICU病房中患感染性疾病的足月兒是否多于早產兒,按胎齡將所有新生兒分為足月兒組(≥37周)和早產兒組(<37周),根據是否患感染性疾病,分為感染組和非感染組。

本研究已獲得中國人民解放軍總醫院第七醫學中心倫理委員會的批準(倫理編號:2023-11)。納入的研究對象不再重新采集干血斑樣本,僅對其在實驗室留存的已用于遺傳代謝篩查的剩余干血斑樣本進行TREC拷貝數檢測。

1.2儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀(Quant Studio-6);全自動核酸檢測反應體系構建系統(Neostation);高通量測序儀(Illumina Nextseq 2000);血液基因組DNA提取試劑盒(Tiangen);NeoMDxTMkit 試劑盒(Wallac Oy);全外顯子基因捕獲探針V4.0(GenCap?)。

1.3方法

1.3.1SCID篩查方法 (1)血斑DNA提取:將樣本和質控卡片常溫放置至少30 min后開始打孔,根據布板要求進行樣本和質控品的打孔(使用直徑3.2 mm打孔沖頭),每塊微孔板必須有兩組質控(BL、C1、C2、C3),分別位于第一個樣本之前和最后一個樣本之后。按血斑DNA提取操作SOP進行DNA提取,提取后進行PCR儀器設置或封口儲存。(2)多重實時熒光定量PCR檢測:通過多重實時熒光定量PCR擴增技術,檢測干血斑DNA樣本中的2個靶標序列TREC和RPP30,其中RPP30作為監測樣本擴增過程的內部對照.此外,2個濃度質控-低濃度TREC和高濃度TREC則作為整個檢測過程的對照。完成擴增后,導出每個樣本(包括質控)的Ct值,進行數據分析和結果解讀,篩查陽性結果以每105個細胞TREC拷貝數≤326為cut-off值。

1.3.2全外顯子測序及數據分析 篩查陽性的新生兒,從干血濾紙片提取DNA。使用標準文庫構建試劑盒進行基因組文庫構建。質檢合格后采用全外顯子基因捕獲探針,對富集文庫進行高通量測序,獲得原始測序數據,通過生物信息分析,篩選可能與SCID相關的基因突變位點。

1.4統計學處理 采用SPSS26.0 軟件包對研究數據進行統計學分析和處理。不符合正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示,兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗,多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗;計數資料以例數或百分率表示,采用χ2檢驗。胎齡和體重與TREC拷貝數的相關性分析采用Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同性別組TREC拷貝數比較 男性組新生兒TREC拷貝數為1 270(711,1 926),女性組新生兒TREC拷貝數為1 478(798,2 054)。兩組TREC拷貝數比較,差異無統計學意義(Z=-0.805,P=0.421)。

2.2不同胎齡組TREC拷貝數比較 相關性分析結果顯示,胎齡與TREC拷貝數無相關性(r=-0.033,P=0.618);7組不同胎齡新生兒TREC拷貝數比較,差異無統計學意義(H=8.611,P=0.197);見表1。但繪圖發現,TREC拷貝數隨著胎齡的增加有增加趨勢,見圖1。

圖1 TREC拷貝數隨著胎齡增加的變化趨勢

表1 不同胎齡組TREC拷貝數比較

2.3不同出生體重組TREC拷貝數比較 相關性分析結果顯示,體重與TREC拷貝數無相關性(r=0.008,P=0.902)。7組不同出生體重新生兒TREC拷貝數比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表2。但TREC拷貝數隨著出生體重的增加有增加趨勢,見圖2。

圖2 TREC拷貝數隨著出生體重增加的變化趨勢

表2 不同出生體重組TREC拷貝數比較

2.4足月兒組和早產兒組重癥感染性疾病的發生情況分析 220例新生兒中,足月兒組140例,患感染性疾病的新生兒114例;早產兒組87例,患感染性疾病的新生兒52例。χ2檢驗結果顯示,足月兒中感染性疾病患兒比例顯著多于早產兒,差異有統計學意義(χ2=12.808,P<0.05)。見表3。

表3 足月兒組和早產兒組重癥感染性疾病發生情況[n(%)]

2.5感染組和非感染組TREC拷貝數比較 感染組與非感染組TREC拷貝數分別為1 397±888、1 811±1 095,感染組TREC拷貝數顯著低于非感染組,差異有統計學意義(t=3.996,P=0.004)。

2.6全外顯子測序結果 全外顯子測序及數據分析發現,篩查陽性的16例新生兒均檢測出至少2個常見的ADA突變位點,見表4。根據ACMG的基因突變命名規則,ADA基因上的突變位點可描述為:NM_000022.4(ADA)C.95+165A>G;NM_000022.4(ADA)C.36G>A(p.Val12);NM_000022.4 (ADA)C.363-165T>C。存在ADA純合突變或復合雜合突變是SCID的診斷標準之一。因此,這16例篩查陽性新生兒均可確診為SCID患兒。

表4 16例篩查陽性新生兒全外顯子測序結果

3 討 論

SCID是原發性免疫缺陷病(PID)中最嚴重的類型,而且80%以上的患者都在嬰兒期發病,如未能及時進行免疫重建,大多數患兒會死亡。NICU是集中治療危重新生兒的病室,NICU新生兒通常患有肺炎、化膿性感染、各種腦炎、敗血癥等較為嚴重的感染性疾病,同時由于新生兒本身器官及免疫功能發育不健全,加上病情危重,侵入性操作多,也更易發生院內感染,甚至是多重耐藥菌感染。AMATUNI等[7]對新生兒SCID的篩查結果分析發現,562例新生兒檢測結果為陽性,其中有53%(298例)篩查結果陽性的新生兒來自于NICU,對初篩陽性新生兒進行外周血流式細胞術分析后,最終有6例確診為SCID,真陽性率高達2%。所以,NICU新生兒可能是罹患SCID的高危人群。同時,造血干細胞移植(HSCT)是目前治療SCID最成熟和有效的方法[8,11],而重度感染不僅是導致SCID患兒死亡的主要原因,也是SCID患兒失去HSCT治療機會的主要原因。陳靜[12]研究報道指出,由于就診時間晚、移植時感染重,5 例 SCID 患兒經HSCT 治療后僅1例(20%)患兒存活。因此,NICU新生兒應該作為開展SCID篩查的重點人群,以到達早篩查、早診斷、早治療的目的。

本研究結果發現,不同性別的NICU新生兒TREC拷貝數無明顯差異,目前尚缺乏新生兒性別是否影響TREC拷貝數的相關報道,然而,有多項研究通過流式細胞術對外周血淋巴細胞進行精確分型,測定總淋巴細胞和淋巴細胞各亞群[總T細胞(CD3+)、輔助T細胞(CD4+)、細胞毒T細胞(CD8+)、B淋巴細胞(CD19+)等]的絕對/相對計數來探討男性與女性新生兒之間的外周血淋巴細胞亞群是否存在差異。在性別是否影響外周血淋巴細胞亞群這一問題上,這些研究結果未達成一致。AMATUNI等[13]研究認為,不同種族/民族背景、不同性別的新生兒(包括早產兒和足月兒)在總淋巴細胞和淋巴細胞亞群計數上無明顯區別;王文第等[14]研究顯示,男性和女性新生兒CD3+細胞百分比無明顯差異,但是CD4+、CD8+細胞比例及CD4+/CD8+比值差異均有統計學意義(P<0.05);而詹文麗等[15]的研究指出,0歲至學齡前兒童不同性別CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+細胞比例和CD4+/CD8+比值差異均有統計學意義(P<0.05)。因此,TREC作為胸腺輸出的T淋巴細胞的生物學標志物,性別是否會影響其拷貝數的檢測結果仍有待繼續探討。

通過檢測TREC拷貝數來進行新生兒SCID篩查雖然具有高度的敏感性和特異性,但是也有諸多因素可以導致假陰性和假陽性結果。Digeorge綜合征、21-三體綜合征、Ataxia綜合征等多種綜合征可使TREC拷貝數偏低,從而導致假陽性結果[16];而由于TCR 重排之后的相關基因(IL-2Rγ、CD40L、ZAP70、DOCK8、MHC-Ⅱ等)突變導致的SCID,其胸腺結構和功能正常,還有泄漏性SCID(leaky SCID)以及由RAG1/2基因亞型突變(多為錯義突變)導致的Omenn綜合征,可保留部分蛋白質功能,均會使篩查出現假陰性結果[17]。此外,還有研究指出,早產兒和低出生體重兒可導致淋巴細胞減少癥(TCL),從而使TREC拷貝數水平降低,這種TCL隨著胎齡和體重的增加可以得到糾正[7]。

本研究結果顯示,雖然NICU新生兒胎齡和出生體重與TREC拷貝數無相關性,但是隨著二者的增加,TREC拷貝數呈增加的趨勢。在按胎齡分組對TREC拷貝數進行統計學分析時,極早產兒組、晚期早產兒組TREC拷貝數均高于超早產兒組,差異有統計學意義,說明早產兒的胎齡增加,TREC拷貝數水平也增加;而不同出生體重新生兒的TREC拷貝數差異無統計學意義,可能原因是低出生體重兒,尤其是超低和極低出生體重兒的樣本量小。

本研究還發現,早產兒4個組的TREC拷貝數均高于足月兒3組,低出生體重兒4個組的TREC拷貝數也均高于正常出生體重兒3個組,差異無統計學意義(P>0.05)。隨后,本課題組分析了所有新生兒的病歷資料,140例足月兒(幾乎也都是正常體重兒)中,有114例(81.40%)患感染性疾病,并且是患有新生兒敗血癥、新生兒重癥肺炎、新生兒化膿性腦膜炎等嚴重的感染性疾病,而40.20%的早產兒(幾乎也都是低出生體重兒)則是由于單純的早產、低出生體重或呼吸窘迫而入院治療的,統計學結果也顯示,患感染性疾病的足月新生兒多于早產兒,差異有統計學意義(P<0.05)。同時,感染組和非感染組TREC拷貝數比較發現,感染組TREC拷貝數顯著低于非感染組,差異有統計學意義(P<0.05)。嚴重的感染導致的中性粒細胞數量激升,淋巴細胞數量相應減少,應該是TREC拷貝數顯著降低的原因。這也提示,當SCID篩查結果出現陽性時,要考慮新生兒的實際情況,避免假陽性結果的發生。這一結果,也可以解釋為什么早產兒各組或低出生體重兒各組的TREC拷貝數要高于足月兒各組或正常出生體重兒各組。

在227例NICU新生兒中,檢測發現每105個細胞TREC拷貝數<326的新生兒有16例,即SCID篩查疑似陽性的新生兒16例,對這16例新生兒的全外顯子測序結果分析發現,每例新生兒都攜帶2個常見的腺苷脫氨酶(ADA)基因突變,可確診為ADA-SCID。ADA-SCID是最常見的常染色體隱性遺傳SCID,約占SCID總病例數的15%,約占常染色體隱性遺傳SCID的50%,屬于T-B-NK-SCID[18],據統計,該病發病率在1/1 00萬～1/20萬活產兒之間[19]。

ADA基因位于20q13-qter,編碼一條含363個氨基酸殘基的多肽鏈,目前已報道超過65種 ADA 基因突變,其中近 70%為錯義突變,其余為無義突變及剪接突變[20]。ADA 是一種嘌呤回收酶,參與嘌呤核苷的代謝,幾乎在人體所有組織細胞中都有表達,因淋巴細胞分裂迅速,其在淋巴樣組織,特別是胸腺中具有非常高的活性。ADA 缺乏引起的嘌呤代謝障礙,使底物腺苷(Ado)、脫氧腺苷(dAdo)及脫氧腺苷核苷酸(dAXP)等在血漿、紅細胞及淋巴組織中積聚,從而通過不同機制損害淋巴細胞的發育,導致成熟T、B淋巴細胞的嚴重不足,引發SCID。ADA-SCID可導致患者感音神經性聽力損失、骨骼缺陷和神經發育缺陷,但其免疫學表現可能危及生命,因此,以早發性及致死性嬰兒期發病最為常見。在本研究中,這16例 NICU新生兒均在新生兒期死亡,也符合ADA-SCID的臨床特點。

多重熒光定量PCR檢測TREC拷貝數為SCID的早期篩查提供了技術支持,應用全外顯子測序技術可篩選SCID致病基因,并明確診斷篩查疑似陽性新生兒為SCID患兒。在NICU這一特殊群體中實施SCID早期篩查,早期診斷,并盡早對確診患兒開展治療,對于改善SCID患兒的生存質量,提高SCID患兒生存率,進而降低新生兒的死亡率都有重要意義。本研究結果發現感染可能導致SCID篩查結果出現假陽性,在解釋結果時應充分考慮新生兒的感染狀況。雖然本研究僅發現新生兒的胎齡與TREC的拷貝數測量結果相關,但這可能是由于研究對象數量較少導致的,所以,性別、胎齡和出生體重與TREC拷貝數的關系仍需在擴大樣本量后深入研究和驗證。