非小細胞肺癌患者血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p表達與病理特征的關系*

曾義迦,趙 燕,易 婕

1.四川大學華西醫院健康管理中心,四川成都 610041;2.四川省人民醫院腫瘤科,四川成都 610000

肺癌是中國乃至全球最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率也居各種惡性腫瘤首位[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型,超過所有類型肺癌的85%[2]。NSCLC生存率與分期密切相關,Ⅰ期患者術后5年生存率可達77%～92%,但臨床中75%的患者在初診時處于晚期,即使是可接受手術切除的ⅢA～ⅣA期,5年生存率也僅有10%～36%[3]。因此早期診斷尤為重要。有研究表明,非編碼RNA在NSCLC發生發展中扮演重要角色,影響著NSCLC發生、增殖、遷移、侵襲、分化和凋亡等過程[4]。外泌體是一種直徑30～150 nm的囊泡,能攜帶多種非編碼RNA參與NSCLC過程,循環外泌體中非編碼RNA異常表達已被證明是NSCLC診斷的重要標志物[5]。長鏈非編碼核糖核酸母系表達基因8(lncRNA MEG8)和微小核糖核酸(miRNA)-363-3p是新近發現的非編碼RNA,有研究發現lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC組織中異常表達,并影響其惡性進程[6-7]。然而,血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC中是否異常表達及其潛在的臨床意義尚不清楚,本研究旨在探討血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2023年5月四川大學華西醫院收治的93例NSCLC患者作為NSCLC組,其中女39例、男54例;年齡25～72歲,平均(60.28±7.43)歲。納入標準:(1)年齡≥18歲;(2)初次確診;(3)經病理檢查確診為NSCLC[8];排除標準:(1)伴有感染、免疫性疾病;(2)復發性肺癌;(3)入院前已接受任何抗腫瘤治療;(4)合并其他部位的惡性腫瘤;(5)臨床資料不全。另選取同期43例健康志愿者作為對照組,女18例、男25例;年齡18～73歲,平均(60.12±7.24)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。所有研究對象或家屬簽署書面知情同意文件。

1.2方法 采集所有研究對象體檢或入院時空腹靜脈血3 mL,1 500×g離心5 min,留取400 μL血清標本,加入外泌體提取試劑(北京博邁斯科技發展有限公司,貨號:EXOQ5A-1)100 μL混勻,再次1 500×g離心5 min,得到的沉淀即為外泌體。使用日立高新技術公司生產的透射電子顯微鏡(型號:HT7800)觀察分離所得血清外泌體(直徑30～150 nm類圓形雙層膜囊泡)。取200 μL血清外泌體,使用Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技,貨號:15596026)提取總RNA,分光度計測定純度合格后(A260/A280比值1.8～2.0),使用Takara逆轉錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)將其逆轉錄為互補DNA。使用ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)系統和相應試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號:P505)進行擴增。反應體系共25 μL:模板DNA 5 μL,qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,正、反向引物各0.4 μL,加無核酸酶水至總體積為25 μL。擴增程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,共循環40次。lncRNA MEG8表達檢測以GAPDH為內參,miR-363-3p表達檢測以U6為內參,采用2-ΔΔCt法計算血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1兩組血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較 NSCLC組血清外泌體lncRNA MEG8水平高于對照組,miR-363-3p水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較

2.2NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8與miR-363-3p水平的相關性 經StarBase數據庫預測,lncRNA MEG8與miR-363-3p存在互補序列。Pearson相關性分析顯示,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8與miR-363-3p水平呈負相關(r=-0.730,P<0.001)。見圖1。

圖1 lncRNA MEG8與miR-363-3p水平的相關性分析

2.3血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平與NSCLC病理特征的關系 不同分化程度(低分化/中高分化)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴結轉移(有/無)NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較有差異(P<0.05),不同性別(男/女)、年齡(≥60歲/<60歲)、病理類型(腺癌/其他)吸煙(有/無)、腫瘤最大徑(≥3 cm/<3 cm)NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平與NSCLC病理特征的關系

2.4血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價值 繪制血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平診斷NSCLC的ROC曲線,并計算AUC。結果顯示,血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平聯合診斷NSCLC的AUC為0.965,大于血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平單獨診斷的0.908、0.904(Z=2.667、2.572,P=0.008、0.010)。見表4和圖2。

圖2 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平診斷NSCLC的ROC曲線

表4 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價值

3 討 論

NSCLC是除小細胞肺癌外所有肺癌的集合體,其發病可能與吸煙、二手煙或環境油煙吸入史、慢性肺部疾病史、一二級親屬肺癌家族史、個人腫瘤史、職業致癌物質暴露史等有關,面對人口老齡化加劇、空氣污染、吸煙人數增加等嚴峻形勢,近年來我國NSCLC發病率和死亡率呈持續增加趨勢[2-3]。早期診斷和干預是改善NSCLC患者預后,延長其生存期的重要措施。目前臨床常用的肺癌腫瘤標志物如鱗狀上皮細胞癌抗原、胃泌素釋放肽前體、細胞角蛋白片段19、神經元特異性烯醇化酶、癌胚抗原等對NSCLC診斷的靈敏度和特異度均不高[9]。低劑量螺旋計算機斷層掃描雖然有助于NSCLC早期診斷,但操作復雜、價格昂貴,且無法區分結節良惡性,易給患者造成恐懼心理和負擔[10]。因此迫切需要尋找新的有價值非入侵標志物,以提升NSCLC診斷水平。

外泌體是廣泛存在各種體液中的一類含有代謝產物、蛋白質和非編碼RNA等的囊泡樣脂質雙層膜結構,在病理生理和細胞間通訊調節中發揮重要作用,不同來源的外泌體能保存親代細胞特有遺傳物質,能通過轉移腫瘤生長所需蛋白質和RNA等機制促進腫瘤細胞增殖、分化、侵襲、血管生成和存活,因此腫瘤來源的外泌體有利于腫瘤的早期診斷[11-12]。lncRNA作為新興的關鍵生物調節因子,在NSCLC進展過程中發揮至關重要的作用[13]。lncRNA MEG8定位于人染色體14q32.2,參與了多種惡性腫瘤過程,例如,lncRNA MEG8能靶向miR-181a-5p抑制腦膠質瘤細胞增殖和轉移能力[14],靶向miR-495-3p/G3BP應力顆粒裝配因子1促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲[15],靶向p53蛋白抑制食管鱗癌細胞增殖和促進其凋亡[16]。然而,關于血清外泌體lncRNA MEG8與NSCLC的關系尚未可知。本研究結果顯示,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8水平升高,與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關,這符合LIU等[6]報道的結果。其原因可能與lncRNA MEG8能上調細胞分裂蛋白激酶6和磷酸絲氨酸氨基轉移酶1表達有關。細胞分裂蛋白激酶6是調控細胞分裂的關鍵因子,其異常升高會導致腫瘤細胞持續分裂,促進其增殖、遷移和侵襲[17]。磷酸絲氨酸氨基轉移酶1是調控細胞代謝的重要途徑,其異常升高能通過代謝催化糖酵解、一碳代謝等為腫瘤細胞提供更多的能量支持,促進其增殖、遷移和侵襲[18]。lncRNA MEG8升高會導致細胞分裂蛋白激酶6和磷酸絲氨酸氨基轉移酶1上調,通過紊亂細胞分裂周期和通過代謝催化為腫瘤細胞提供更多能量支持,促進NSCLC細胞增殖、分化、遷移和侵襲[6,19]。

miRNA是一種短而小的非編碼RNA,通過調控mRNA翻譯和降解參與NSCLC發生發展[20]。miR-363-3p定位于人染色體Xq26.2,也參考了多種惡性腫瘤過程,如miR-363-3p能靶向鞘氨醇激酶2抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和上皮間充質轉化[21];miR-363-3p能靶向Y染色體性別決定區-盒轉錄因子4抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲[22];miR-363-3p能靶向白細胞介素-6抑制血管瘤細胞增殖、遷移和侵襲[23]。然而,關于血清外泌體miR-363-3p與NSCLC的關系尚未可知。本研究結果顯示,NSCLC患者血清外泌體miR-363-3p水平降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關,說明外泌體miR-363-3p水平降低參與NSCLC發生發展,這與既往研究報道相符[7]。這可能與miR-363-3p能下調扭曲家族bHLH轉錄因子1和磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位有關。扭曲家族bHLH轉錄因子1是重要的轉錄因子,能通過調控多條信號通路誘導上皮間質轉化,促進腫瘤進展[24]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位是參與磷脂酰肌醇激酶3催化合成的關鍵亞基,在致癌信號通路PI3K/蛋白激酶B中發揮關鍵作用[25]。miR-363-3p水平降低會導致扭曲家族bHLH轉錄因子1、磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位上調,增強上皮-間質轉化和磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B信號轉導,增強NSCLC細胞遷移和侵襲能力,促進其惡性進展[7,26]。

本研究中,在線網站預測發現lncRNA MEG8與miR-363-3p存在互補序列,進一步行相關性分析發現二者在NSCLC患者血清外泌體中表達呈負相關,提示lncRNA MEG8與miR-363-3p可能共同參與NSCLC過程。林燕明等[27]通過雙熒光素酶報告基因證實,lncRNA MEG8過表達能靶向下調miR-363-3p促進NSCLC細胞增殖、遷移和抑制凋亡,進一步佐證了本研究結果。為確定血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價值,繪制ROC曲線,結果顯示血清外泌體lncRNA MEG8診斷NSCLC的AUC為0.908,miR-363-3p診斷NSCLC的AUC為0.904,二者聯合診斷NSCLC的AUC為0.965,大于血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p單獨診斷。說明血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC具有診斷價值,可能成為NSCLC的輔助診斷指標,而且聯合檢測血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平能進一步提升NSCLC的診斷價值。考慮原因可能是二者共同參與NSCLC進程,聯合檢測血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平可以更好地解釋NSCLC發病機制,因此診斷價值更高。

綜上所述,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8水平升高和miR-363-3p水平降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關,lncRNA MEG8與miR-363-3p可能共同參與NSCLC發生發展,而且血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平聯合對NSCLC具有較高的診斷價值。