布比卡因通過PI3K/AKT/mTOR通路對膀胱癌細胞凋亡和鐵死亡的影響*

錢 靜,李向南,袁從虎,吳曉麗,潘高健,盛如意,高 群

南京醫科大學附屬鹽城市第三人民醫院麻醉科,江蘇鹽城 224005

膀胱癌是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一,目前其臨床總體治愈率仍不理想[1]。研究表明,應用局部麻醉藥可能具有殺傷或抑制腫瘤細胞的作用,預防癌癥患者術后復發[2]。布比卡因作為臨床常用局部麻醉藥,通過其鈉通道阻滯特性用于局部浸潤、硬膜外和鞘內麻醉[3]。研究發現,布比卡因通過消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)誘導神經母細胞瘤、卵巢癌和前列腺癌細胞凋亡,減少胃癌的發生[4-5],但其對膀胱癌的作用尚鮮見報道。鐵死亡是近年發現的由脂質過氧化作用驅動的非凋亡性細胞死亡模式[6],多種藥物可通過誘導鐵死亡抑制腫瘤細胞的生長[7]。然而,麻醉藥介導的腫瘤抑制作用與鐵死亡之間的關系仍需探索。本研究觀察布比卡因對膀胱癌細胞凋亡、鐵死亡和氧化應激的影響,同時探討磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號通路在其中的調控機制。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌細胞(T24和5637)和人尿路上皮細胞(SV-HUC-1)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。試劑:鹽酸布比卡因注射液(貨號:H20056442)購自上海朝暉藥業有限公司;MTT檢測試劑盒(貨號:M1020)購自索萊寶科技有限公司;丙二醛(MDA,貨號:675067)和鐵測定(貨號:P8374)試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司;谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(貨號:ab138881)購自美國Abcam公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號:C1062L)購自碧云天生物科技有限公司;xCT(貨號:ab175186)、GPX4(貨號:ab40993)、Bcl-2(貨號:ab117115)、Bax(貨號:ab3191)、細胞色素C(貨號:ab13354)和β-actin抗體(貨號:ab8224)購自美國Abcam公司;PI3K(貨號:4292)、p-PI3K p85α(貨號:17366)、AKT(貨號:9272)、p-AKT Thr308(貨號:13038)、p-AKT Ser473(貨號:4060)、mTOR(貨號:2972)和p-mTOR Ser2448抗體(貨號:5536)購自美國CST公司。儀器:Cytation3多功能酶標儀(美國BioTek公司);Chemi Doc XRS化學發光凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司);160HR高速冷凍離心機(美國賽默飛公司);倒置式生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養和分組 所有細胞均在37 ℃和5% CO2環境下,置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養基中培養。當細胞達80%～90%融合度時,選擇僅對癌細胞具有毒性的適當濃度,分為對照組(0 mmol/L布比卡因)、布比卡因組(0.25、0.5和1 mmol/L)、布比卡因(1 mmol/L)+鐵死亡激動劑(Erastin,10 μmmol/L)組、布比卡因(1 mmol/L)+鐵死亡抑制劑(Fer-1,10 μmmol/L)組和布比卡因(1 mmol/L)+PI3K激動劑(740Y-P,25 nmmol/L)組。對照組僅給予等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)處理。

1.2.2MTT實驗檢測細胞活性 將T24和5637細胞按照每孔5×103個接種到96孔板中。24 h后,分別加入布比卡因(0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L)再處理24 h。每孔加入20 μL MTT試劑,繼續培養4 h。棄上清,每孔加入DMSO 200 μL。振蕩30 s,采用酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組處理后細胞,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒,上流式細胞儀檢測1 h內細胞凋亡率。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲 將各組細胞重懸至100 μL無血清培養基,加入Transwell小室中,并放至加有500 μL完全培養基的下室中繼續培養24 h。4%多聚甲醛固定膜表面細胞,吉姆薩染色,顯微鏡下觀察統計細胞穿膜數目。

1.2.5Fe2+濃度測定 收集各組細胞并用RIPA裂解液裂解,離心收集上清。96孔板中每孔加入50 μL上清液和50 μL鹽酸(0.1 mmol/L),孵育30 min。隨后,每孔加入鐵探針100 μL,繼續孵育60 min。采用酶標儀檢測562 nm波長處吸光度。

1.2.6DEFH-DA法檢測活性氧(ROS) 將各組細胞接種于6孔板中(1×105個/孔),24 h后棄去培養基,每孔加入DCFH-DA 50 μmol/L,37 ℃反應30 min,棄上清。熒光顯微鏡和酶標儀檢測熒光強度,激發波長488 nm,檢測波長525 nm。

1.2.7細胞MDA和GSH水平測定 收集各組細胞,利用MDA和GSH檢測試劑盒測定細胞上清液中MDA和GSH水平,步驟參照試劑盒說明書進行。

1.2.8Western blot檢測凋亡和PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達 各組細胞經RIPA裂解后,離心獲得總蛋白。BCA蛋白測定試劑盒定量濃度。以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白50 μg,電濕轉將蛋白轉移至PVDF膜上,室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日,二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h,然后將ECL化學發光液加至PVDF膜上,滴加顯影液和定影液曝光,并在凝膠圖像分析系統上拍照。利用Image J根據灰度值計算目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1同濃度布比卡因對膀胱癌細胞活性的影響 MTT結果顯示,布比卡因在0～0.1 mmol/L濃度范圍內對T24和5637細胞活力無影響,但在0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L濃度下對T24和5637細胞活性均有明顯抑制作用(P<0.05);而僅當布比卡因濃度≥8 mmol/L時,SV-HUC-1細胞活性顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注:與對照組比較,①P<0.05,②P<0.01,③P<0.001。

2.2布比卡因對膀胱癌細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示,0、0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因處理24 h后T24細胞凋亡率分別為2.16%±0.32%、11.80%±1.12%、16.10%±1.76%和18.50%±2.34%,5637細胞凋亡率分別為2.05%±0.28%、2.45%±0.31%、12.00%±1.36%和17.60%±2.23%。與對照組T24和5637細胞比較,布比卡因處理細胞的凋亡率隨濃度增加逐漸升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 布比卡因對膀胱癌細胞凋亡的影響

2.3布比卡因對膀胱癌細胞鐵死亡的影響 與對照組T24和5637細胞比較,布比卡因(0.25、0.5和1 mmol/L)可隨濃度升高逐漸增加細胞中Fe2+、ROS和MDA水平,并降低GSH水平(P<0.001)。與1 mmol/L布比卡因組比較,布比卡因+Erastin組T24和5637細胞Fe2+水平均明顯升高;而布比卡因+Fer-1組細胞Fe2+水平較布比卡因組顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注:A和B為細胞中Fe2+水平比較;C為DCFH-DA探針檢測細胞內ROS水平;D為ROS水平統計圖;E為細胞中GSH相對表達水平比較;F為細胞中MDA相對表達水平比較;與對照組相比,①P<0.05,②P<0.01;與1.0 mmol/L布比卡因處理細胞相比,③P<0.05。

2.4布比卡因對膀胱癌細胞凋亡和鐵死亡相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示,與對照組T24和5637細胞比較,布比卡因0.25、0.5和1 mmol/L處理可隨濃度增加顯著降低膀胱癌細胞xCT、GPX4蛋白表達和Bax/Bcl-2,并增加細胞色素C蛋白表達(均P<0.05),見圖4。

注:A為Western blot檢測各組細胞Bax/Bcl-2、細胞色素C、xCT和GPX4蛋白表達;B～E為xCT和GPX4相對表達水平統計圖;與對照組相比,①P<0.05,②P<0.01。

2.5布比卡因對膀胱癌細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路活性的影響 與對照組T24和5637細胞比較,布比卡因(0.25、0.5和1 mmol/L)可隨濃度升高顯著降低膀胱癌細胞PI3K p85α/PI3K、p-AKT(Thr308)/AKT、p-AKT(Ser473)/AKT和p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值(P<0.05)。見圖5。

注:A為Western blot檢測代表圖;B為蛋白相對表達水平統計圖;與對照組比較,①P<0.05,②P<0.01。

2.6抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路對布比卡因誘導膀胱癌細胞鐵死亡的影響 與對照組比較,布比卡因+740Y-P組細胞活力和GSH水平明顯升高,Fe2+水平和細胞色素C蛋白表達顯著減少,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖6。

注:A為MTT實驗檢測細胞活力;B為細胞內Fe2+比較;C為細胞內GSH相對表達水平比較;D為Western blot檢測細胞色素C蛋白表達;E為細胞色素C相對表達水平統計圖;與對照組比較,①P<0.05,②P<0.01。

3 討 論

布比卡因作為臨床常用酰胺衍生物局部麻醉藥,最近的一些研究關注其潛在的腫瘤細胞毒性,例如,布比卡因在一定濃度范圍內可誘導卵巢癌和前列腺癌細胞死亡,并抑制結腸癌和胰腺癌細胞增殖,進而抑制腫瘤進展[5]。但布比卡因對膀胱癌細胞的作用鮮有報道。張振翼等[3]的研究發現,布比卡因可通過降低肝癌HepG2細胞中miR-191表達,促進KLF6表達,從而抑制細胞增殖和侵襲并促進其凋亡。這表明布比卡因具有抗癌作用,可能有效抑制癌細胞活性。本研究結果顯示,布比卡因處理可呈劑量依賴關系(0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L)抑制T24和5637細胞的增殖活性,但只有當布比卡因濃度≥8 mmol/L時可對SV-HUC-1細胞產生毒性。這與上述研究結果一致,提示本文選擇的4種劑量(0、0.25、0.5、1 mmol/L)布比卡因對正常細胞無影響,而對膀胱癌癌細胞有明顯毒性影響。

目前抗癌藥抑制腫瘤細胞增殖的主要機制是誘導其凋亡[8]。CHAPMAN等[9]在體外研究中發現,隨著布比卡因濃度和接觸時間的增加,軟骨腫瘤細胞凋亡數量顯著增多。布比卡因通過線粒體損傷和絲裂原活化蛋白激酶的激活對乳腺癌和甲狀腺癌細胞亦表現出顯著的促凋亡作用,抑制腫瘤細胞活力和克隆形成[10]。這表明布比卡因可能通過促進細胞凋亡,發揮抗腫瘤作用。本研究結果顯示,布比卡因處理膀胱癌細胞后,Bax/Bcl-2較對照組降低,細胞凋亡率升高。這與CHANG等[10]的研究結論類似。上述結果提示布比卡因對膀胱癌細胞具有促凋亡作用。

鐵死亡是近年來新發現的一種新型程序性細胞死亡形式,與其他經典的非凋亡性細胞死亡程序不同,其特征為大量鐵依賴性脂質過氧化產物積累,在多種腫瘤相關疾病中發揮作用[6]。此外,當機體鐵平衡遭到破壞時,過量游離Fe2+與過氧化氫作用,產生羥基自由基,促進脂質過氧化,誘導細胞死亡[11]。據報道,膀胱癌細胞的鐵依賴性促使其對臨床誘導鐵死亡及鐵螯合劑藥物的應用非常敏感,因此產生了一種可用于臨床的代謝敏感性[12]。研究發現,Erastin可通過抑制谷胱甘肽的合成降低GPX4活性,導致脂質過氧化代謝受阻,從而誘導細胞鐵死亡[13]。JIN等[14]發現,茄堿可提高肝癌細胞ROS水平,抑制GPX4的表達,促進癌細胞鐵死亡,而鐵死亡抑制劑能逆轉茄堿對肝癌細胞的保護作用。這些研究表明誘導鐵死亡可用于抗癌治療。細胞內抗氧化劑GSH和脂質過氧化產物MDA在細胞鐵死亡中亦發揮重要作用,被定義為鐵死亡的標記物。鐵死亡的細胞毒性也依賴于ROS的產生,研究發現,布比卡因可顯著降低SH-SY5Y細胞中GSH水平并增加MDA水平,加劇ROS氧化損傷介導的細胞凋亡[15]。本研究檢測布比卡因處理后膀胱癌細胞脂質過氧化產物和抗氧化酶的水平,與預期一致,布比卡因可增加膀胱癌細胞的Fe2+濃度,降低xCT和GSH4的表達及GSH水平,并升高ROS和MDA水平。基于這些結果,推測布比卡因引起的膀胱癌細胞抑制可能與鐵死亡有關。為驗證這一假設,本研究使用鐵死亡抑制劑Fer-1和激動劑Erastin可分別抑制和促進布比卡因引起的Fe2+產生,結果提示布比卡因引起的膀胱癌細胞抑制至少部分是通過誘導鐵死亡來實現的。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是通過感知細胞代謝狀態來調節細胞功能的關鍵調節通路,包括細胞凋亡和鐵死亡[16]。KWAKYE等[17]研究表明,布比卡因可誘導乳腺癌細胞凋亡和PI3K/AKT/mTOR途徑失活。此外,PI3K/AKT/mTOR激活可通過調節SREBP1介導的脂肪生成,促進肝癌細胞鐵死亡和氧化應激,而PI3K抑制劑能夠阻斷該作用[18]。本研究結果發現,布比卡因處理可抑制膀胱癌細胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化,而且PI3K抑制劑可逆轉布比卡因對膀胱癌細胞活性、Fe2+、GSH水平和細胞色素C表達的作用,提示布比卡因對膀胱癌細胞凋亡和鐵死亡的促進作用可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活來實現的。由于本研究僅進行了細胞層面的研究,未在動物模型和人體標本中進行驗證,故布比卡因在臨床的應用前景有待進一步研究。

布比卡因可誘導膀胱癌細胞凋亡和鐵死亡,其機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活有關,這為布比卡因用于膀胱癌治療提供了理論基礎和實驗依據。