外周血調節性T細胞及表面共刺激分子對耐多藥肺結核患者療效的預測價值*

王俊力,楊 銘,歐 利,諶香明,劉 藺△

1.三六三醫院呼吸與危重癥醫學科,四川成都 610041;2.成都市公共衛生臨床醫療中心呼吸內科,四川成都 610000;3.三六三醫院呼吸內科,四川成都 610041

耐多藥結核病(MDR-TB)具有傳染性強、治療周期長、復發率高等特點[1-2]。據世界衛生組織(WHO)統計,2016年新發60萬對利福平耐藥的肺結核病例,81.67%為MDR-TB,其中印度、中國與俄羅斯的病例占47%;且2020年世界范圍內MDR-TB平均治愈率僅50%～75%[3-4]。機體免疫狀態與MDR-TB發生關系密切,MDR-TB機體感染結核分枝桿菌后,通過刺激巨噬細胞、遞呈抗原引發特異性免疫應答,調節性T細胞(Treg)在免疫應答過程發揮關鍵作用。已有研究證實,CD4+CD25+Treg細胞參與結核病相關免疫應答,但關于MDR-TB的免疫學針對性研究較少[5-6]。程序性死亡因子-1(PD-1)、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)、可誘導共刺激分子(ICOS)等Treg表面共刺激分子與MDR-TB患者治療預后的關系有待進一步研究[7]。本研究嘗試基于Nomogram預測模型分析外周血Treg及表面共刺激分子在MDR-TB患者治療中的影響,以期為臨床預測預后轉歸提供參考?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年5月至2022年5月三六三醫院(以下簡稱本院)收治的200例MDR-TB患者作為研究對象,其中男133例(66.50%),女67例(33.50%),年齡37～68歲,平均(52.27±7.36)歲,體重指數17～28 kg/m2,平均(23.24±2.28)kg/m2;治療情況:初治121例(60.50%),復治79例(39.50%);合并癥:高血壓42例(21.00%),糖尿病31例(15.50%),高脂血癥19例(9.50%);吸煙史83例(41.50%),飲酒史54例(27.00%)。納入標準:痰結核分枝桿菌陽性;經影像學證實為MDR-TB,結核分枝桿菌藥敏試驗顯示對異煙肼、利福平同時耐藥;近3個月無激素類藥物、免疫增強劑或抑制劑用藥史。排除標準:伴有其他傳染性疾病;伴有血液系統疾病;因其他疾病存在病死風險;存在重要臟器病變;精神異常。剔除標準:失訪、抗結核治療期間連續中斷2個月及以上、自行退出本研究、轉診至其他疾病防控中心。本研究征得三六三醫院倫理委員會同意?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺嫖募?。

1.2方法

1.2.1治療方法 給予入選患者標準化或個體化抗結核化療方案,依據《耐藥結核病化學治療指南(2015)》解讀[8]制訂的治療方案:6Am-Lfx-P-Z-Pto、18Lfx-P-Z-Pto。用藥頻次、劑量等參考指南要求;標準化方案不適用的患者實施個體化方案,依據藥敏結果、病癥治療需求、疾病程度,針對性制訂治療方案,根據疾病治療進程,指導患者定期檢查。

1.2.2預后評估 隨訪時間:自接受標準化治療開始計算,截至療程結束或患者死亡。預后評估標準如下。治愈:完成整個抗結核療程,且符合以下任意一項。(1)在治療后期1年內影像學顯示病灶組織完全吸收,體征及臨床癥狀無明顯加重趨勢,僅有1次痰結核桿菌陽性,而后連續≥3次痰結核桿菌陰性,檢查間隔1個月及以上。(2)在治療后期1年內,連續≥5次痰結核桿菌陰性,檢查間隔1個月及以上。失敗:符合以下任意一項。(1)抗結核療程最后3次痰結核桿菌檢查中有任意一次呈陽性;(2)抗結核療程最后1年內連續5次痰結核桿菌檢查中有≥2次呈陽性;(3)某些原因造成抗結核治療提前中止。死亡:在抗結核治療期間因某些原因死亡。將治愈患者計入預后良好組,治療失敗、死亡患者計入預后不良組。

1.2.3檢測方法 檢測并比較預后良好組、預后不良組Treg細胞、表面共刺激分子(CTLA-4+Treg、ICOS+Treg、PD-1+Treg)及血清白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長因子β1(TGF-β1)水平,具體操作步驟如下。于治療前采集5 mL空腹靜脈血,置于抗凝管離心(Ficoll密度梯度)分離外周血單個核細胞(純度>80%),取7只流式細胞術上樣管,分別測定如下指標:CD4,CD4、CD25,CD4、CD25、CD127,CD4、CD25、ICOS,CD4、CD25、PD-1,CD4、CD25、CLTA-4,CD4、CD25、Foxp3;分別加入anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC、anti-CD27-PE、anti-ICOS-PE、anti-PD-1-PE、anti-CTLA-4-PE熒光抗體各10 μL,另加入Foxp buffer固定破膜,加入Foxp3-PE熒光抗體,避光孵育0.5 h,加入Q-PREP配套溶血素,混勻后檢測。檢測結果以EXPO32ADC軟件進行分析。分別記錄CD4+T細胞中Treg細胞占比,再以CD4+CD25+細胞設門,獲得細胞表面CTLA-4+Treg、PD-1+Treg、ICOS+Treg占比。采集3 mL空腹靜脈血,以3 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min取血清,以雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗法檢測IL-10、TGF-β1。

2 結 果

2.1預后情況及不同預后患者臨床資料比較 200例MDR-TB患者中,預后良好108例(治愈),預后不良92例(治療失敗74例,死亡18例)。預后不良組與預后良好組年齡、治療情況、吸煙、不規則治療、治療前空洞、二線抗結核治療史比較差異有統計學意義(P<0.05),性別、體重指數其他臨床資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 預后不良組與預后良好組臨床資料比較[n(%)或

2.2兩組Treg細胞、表面共刺激分子及TGF-β1、IL-10比較 預后不良組外周血CD4+CD25+Foxp3+、CTLA-4+Treg、PD-1+Treg、CD4+CD25+CD127-、ICOS+Treg細胞比例及血清TGF-β1、IL-10水平高于預后良好組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組Treg細胞、表面共刺激分子及TGF-β1、IL-10比較

2.3Treg細胞與Treg表面共刺激分子、TGF-β1、IL-10的相關性 相關性分析顯示,MDR-TB患者外周血Treg細胞比例與血清TGF-β1水平及CTLA-4+Treg、PD-1+Treg、ICOS+Treg細胞比例呈正相關(P<0.05),與血清IL-10水平無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3 Treg細胞與Treg表面共刺激分子、TGF-β1、IL-10的相關性

2.4預后不良的影響因素分析 以MDR-TB患者預后不良為因變量(賦值:否=0,是=1),將表3中P<0.05的指標年齡(賦值:連續變量,原值代入)、治療情況(賦值:初治=1,復治=2)、吸煙(賦值:否=0,是=1)、不規則治療(賦值:否=0,是=1)、治療前空洞(賦值:無=0,有=1)、二線抗結核治療史(賦值:無=0,有=1)作為自變量,通過Logistic分析顯示,年齡、治療情況、吸煙、不規則治療、治療前空洞、二線抗結核治療史均為MDR-TB患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 預后不良的影響因素分析

2.5預后不良Nomogram預測模型構建 以MDR-TB患者預后不良為目標事件,將外周血Treg、CTLA-4+Treg、PD-1+Treg、ICOS+Treg細胞比例、血清TGF-β1、IL-10水平及年齡、治療情況、吸煙、不規則治療、治療前空洞、二線抗結核治療史作為預測因素,運用R語言構建MDR-TB患者預后不良的Nomogram預測模型,見圖1。在Nomogram預測模型中直接獲取各預測因素對應得分,這些得分之和對應的預測概率即是該患者預后不良的風險概率。

圖1 MDR-TB患者預后不良Nomogram預測模型

2.6預后不良Nomogram預測模型驗證 對Nomogram預測模型進行外部驗證,繪制該模型預測MDR-TB患者預后不良的ROC曲線,結果顯示其預測AUC為0.833,具有良好預測效能,見圖2。繪制該模型預測的校準度曲線,結果顯示其預測結果與實際觀測結果的一致性較好,具有良好校準度,見圖3。

圖2 Nomogram預測模型的ROC曲線

圖3 Nomogram預測模型的校準曲線

3 討 論

臨床研究表明,MDR-TB的發生機制主要在于耐多藥結核桿菌的傳播、長期治療過程中Treg細胞應答的過度激活[9-10]。本研究基于外周血CTLA-4+Treg、PD-1+Treg、CD4+CD25+CD127-、ICOS+Treg、CD4+CD25+Foxp3+細胞比例、血清TGF-β1、IL-10水平及年齡、治療情況、吸煙、不規則治療、治療前空洞、二線抗結核治療史等因素構建MDR-TB患者預后不良的Nomogram預測模型,獲取患者預后不良的風險概率。CD4+CD25+Treg細胞具有免疫抑制性,Foxp3+、CD127-可特異性介導該Treg細胞分化,在外周血中表達水平越高說明Treg細胞免疫抑制作用越強。公維亮等[11]研究發現,MDR-TB患者外周血Treg細胞比例較非耐藥肺結核患者明顯升高,本研究顯示,不同預后MDR-TB患者外周血Treg細胞比例差異明顯,進一步說明外周血Treg細胞參與MDR-TB患者發生及治療過程,可能影響治療效果。

TGF-β1來源于Treg細胞,IL-10由單核/淋巴細胞等產生,均可抑制免疫系統細胞吞噬結核分枝桿菌引起的免疫效應,能直接反映機體免疫狀態[12-13]。李蓓等[14]研究中指出,耐多藥肺結核患者血清TGF-β與抗結核治療轉陰情況有關,趙春娥等[15]報道顯示,肺結核患者IL-10基因多態性可能與抗結核藥物性肝損傷易感性有關。本研究中,預后不良組血清TGF-β1、IL-10水平升高,且相關性分析表明MDR-TB患者外周血Treg細胞比例與血清TGF-β1水平呈正相關,進一步說明部分Treg細胞可通過分泌TGF-β1、IL-10達到免疫抑制作用。

PD-1、CTLA-4、ICOS作為共刺激分子,一方面可精細調控免疫應答網絡,另一方面能介導Treg細胞分化,維持機體免疫抑制功能正常[16-18]。本研究預后不良組外周血CTLA-4+Treg、ICOS+Treg、PD-1+Treg細胞比例高于預后良好組,且MDR-TB患者外周血PD-1+Treg、CTLA-4+Treg、ICOS+Treg細胞比例與CD4+CD25+CD127-、CD4+CD25+Foxp3+細胞比例呈正相關,提示Treg細胞高活化狀態可能抑制MDR-TB患者免疫功能,表面共刺激分子則協同促進MDR-TB發生進展。分析原因在于PD-1、CTLA-4、ICOS可通過不同途徑作用于MDR-TB患者免疫功能,其中PD-1通過阻斷細胞周期對免疫應答發揮負性調節作用,對效應性T細胞轉換為誘導性Treg細胞具有反向促進作用;CTLA-4在免疫應答中通過抑制效應T細胞活化起到負調控效應;ICOS則發揮維持免疫應答、促進Treg細胞增殖的作用[19-21]。

MDR-TB患者免疫力隨年齡增長而降低,且各臟器功能退化、代謝功能減弱、藥物耐受程度低,均可能影響MDR-TB治療效果。MDR-TB患者復治主要是由于治療不徹底、治療依從性差,進而造成預后不良率升高。吸煙對MDR-TB發生、治療效果的影響已得到臨床多項研究證實[22-23]。治療前空洞MDR-TB患者可能由于空洞壁有屏障作用,影響抗結核藥物滲透性,同時空洞四周血供缺乏,抗結核藥物向空洞內滲透的劑量降低,進而導致空洞壁血藥濃度較低,無法達到有效殺菌、抑菌作用,空洞內結核分枝桿菌存活并反復持續排出,延長MDR-PTB患者療程,導致耐藥性、復發率增高,以及治療失敗。由于氟喹諾酮類藥物等二線抗結核藥物具有抗菌活性強、抗菌譜廣、不良反應少等特點在臨床應用較廣,但不合理使用情況較多[24-25]。本研究中,二線抗結核治療史可增加MDR-TB患者預后不良風險,正是由于二線抗結核藥物的不規范使用易引起耐藥,同樣不規則治療也容易增加耐藥風險,進而影響MDR-TB的治療效果。本研究構建的Nomogram預測模型經外部驗證Nomogram模型的預測效能及校準度良好,因此可為臨床預測MDR-TB預后提供參考。

綜上所述,基于外周血CD4+CD25+Foxp3+、PD-1+Treg、CD4+CD25+CD127-、CTLA-4+Treg、ICOS+Treg細胞比例、血清TGF-β1、IL-10水平及年齡、治療情況、吸煙、不規則治療、治療前空洞、二線抗結核治療史等因素構建MDR-TB患者預后不良的Nomogram預測模型,該模型預測效能、校準度良好,有利于患者預后轉歸評估。