一種有效采集核酸氣溶膠的方法

孫世雄，焉 鑫，孫翔翔，孫明軍，高玉斌，孫 靜，張培培，王毓秀，孫淑芳

（中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266114）

經過新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染和非洲豬瘟疫情，不管是醫院、疾病預防控制部門，還是規模養殖場、動物疫病預防控制部門，其核酸檢測實驗室的數量都快速增長[1]。作為核酸檢測實驗室的必備技術，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）具有極高的靈敏度。這也意味著，微量的核酸污染即可導致假陽性結果出現[2]。核酸氣溶膠便是常見的污染之一，也是核酸檢測實驗室必須預防和控制的一個問題。因此，實驗室在開展核酸檢測之前，首先要做的便是判斷室內是否存在核酸氣溶膠污染，而判斷結果的準確性取決于核酸氣溶膠采樣方法的有效性。

對于核酸氣溶膠的采樣，實驗室常用空氣沉降法[3]。將裝有超純水的離心管開蓋置于實驗室不同區域，靜置一段時間后，不經核酸提取，直接加入擴增反應體系進行檢測[4-5]。該方法是在靜止狀態下，用水被動溶解核酸氣溶膠，其最大的缺陷在于偶然性，只有當環境中的核酸氣溶膠擴散并接觸到離心管內的超純水時，才能被采集。為此，本試驗引入氣體采樣泵和過濾吸頭，變靜態采樣為動態采樣，變被動溶入為主動吸附，能夠顯著提高目標核酸的檢出率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 噴霧瓶（廣州名創優品有限責任公司，50 mL）、氣體采樣泵（河南省保時安電子科技有限公司，吸氣流量500 mL/min）、生物安全柜（力康生物醫療科技控股有限公司，HFsafe-1200LC）、 熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，QuantStudio 5）。

1.1.2 試劑耗材 pBR322 質粒DNA（上海生工生物工程股份有限公司，質量濃度為0.5 mg/mL，由E. coli菌株抽提得到）、布魯氏菌核酸（羊種3型，質量濃度為15.7 ng/μL，由中國動物衛生與流行病學中心國家動物布魯氏菌病專業實驗室保存）、超純水（取自德國默克密理博Milli-Q Integral 3 超純水機）、過濾吸頭（BBI 生命科學有限公司，規格為200 μL，滅菌，無DNA 酶、RNA 酶，盒裝）、一次性乳膠管（河南省保時安電子科技有限公司，內徑3 mm，長10 cm）、離心管（BBI 生命科學有限公司，1.5 mL，滅菌，無DNA 酶、RNA 酶）、八連管（德國Greiner 公司，規格為200 μL）、2×酶預混液（湖南艾科瑞生物工程有限公司，ProTaqHS Premix Probe qPCR Kit）、滅菌雙蒸水（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 模擬核酸氣溶膠污染

選取一間體積為23 m3的房間，靠墻放置一張桌子。房間內無定向氣流，每天開窗通風。吸取100 μL pBR322 質粒DNA，加入盛有50 mL 超純水的噴霧瓶內，混勻后均勻噴灑于房間內，靜置30 min。

1.3 樣品采集

在房間內選取6 個采樣點，采樣點1、2 和3均勻分布于桌面，采樣點4、5 和6 均勻分布于地面。在噴灑后0 d（即噴灑當天）、5 d 時，對每個點同時用對照組和試驗組方法采樣。

對照組：取6 個1.5 mL 離心管，均加入500 μL超純水，然后開口靜置于房間內30 min，以管內溶液為核酸檢測模板。

試驗組：取6 個氣體采樣泵，在進氣端連接一次性乳膠管。過濾吸頭剪半后，將帶濾芯的一半插入乳膠管的另一端，確保連接處不漏氣（圖1）。打開采樣泵，置于房間內30 min 后，將過濾吸頭取下放入盛有500 μL 超純水的離心管中，振蕩、離心后，以管內溶液為核酸檢測模板。

圖1 采樣裝置示意圖

1.4 樣品實時熒光定量PCR 檢測

根據pBR322質粒DNA序列，設計上游引物（pBR322-F：5'-TCCAACCCGGTAAGACACGA-3'）、下游引物（pBR322-R：5'-AGAACTCTGTAGCACCGCCT-3'）和探針（pBR322-P：5'-FAM-TATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以滅菌雙蒸水為陰性對照，pBR322質粒DNA（10 ng/μL）為陽性對照，進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系25.0 μL：2×酶預混液10.0 μL、pBR322-F（10 μmol/L）0.6 μL、pBR322-R（10 μmol/L）0.6 μL、pBR322-P（10 μmol/L）0.6 μL、模板5.0 μL、滅菌雙蒸水8.2 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s（收集熒光），40 個循環。

1.5 日常監測應用

1.5.1 核酸氣溶膠采樣 選取一間布魯氏菌分子生物學實驗室，在桌面設置3 個采樣點，對每個采樣點同時用上述兩種方法進行布魯氏菌核酸氣溶膠采樣。每周采樣檢測1 次，直至出現陽性結果。

1.5.2 核酸氣溶膠檢測 布魯氏菌核酸實時熒光定量PCR 檢測所用引物、探針參照動物布魯氏菌實時熒光PCR 檢測方法（T/CVMA 20—2020）合成，分別為上游引物（Bru-F：5'-CGCTCGCGCGGTGGAT-3'）、下游引物（Bru-R：5'-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3'）和 探 針（Bru-P：5'-FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系25.0 μL：2×酶預混液10.0 μL、Bru-F（10 μmol/L）0.6 μL、Bru-R（10 μmol/L）0.6 μL、Bru-P（10 μmol/L）0.6 μL、DNA 模板5.0 μL、滅菌雙蒸水8.2 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s（收集熒光），40 個循環。以無菌無核酸酶水為陰性對照，布魯氏菌核酸為陽性對照。

2 結果

2.1 pBR322 質粒DNA 實時熒光定量PCR 檢測

結果（圖2）顯示，陽性對照Ct 值為7.734，且有特征性擴增曲線，陰性對照無Ct 值且無特征性擴增曲線，試驗成立。噴灑后0 d 采樣檢測時，試驗組在5 個采樣點的擴增曲線起峰均早于對照組；噴灑后5 d 采樣檢測時，試驗組在全部6 個采樣點的擴增曲線起峰均早于對照組。

圖2 pBR322 質粒實時熒光定量PCR 擴增結果

結果（表1）顯示：噴灑后0 d 采樣檢測時，試驗組6 個采樣點的Ct 平均值為22.732，低于對照組的25.027；噴灑后5 d 采樣檢測時，對照組只有3 個采樣點能檢測到Ct 值，且皆高于相應試驗組數值。

表1 pBR322 質粒實時熒光定量PCR 檢測Ct 值

2.2 日常監測結果

日常監測中，共連續采樣6 次。前5 次采樣后，對照組和試驗組皆未檢測到布魯氏菌核酸，說明在這段時間內該實驗室不存在布魯氏菌核酸氣溶膠污染。第6 次采樣后，對照組在3 個采樣點皆未檢測到布魯氏菌核酸，而試驗組皆可檢測到，且Ct 值均為34（圖3、表2）。結果表明，在第6 周時該實驗室已受到布魯氏菌核酸氣溶膠污染，應該暫停相關試驗活動，及時清除核酸污染。

表2 布魯氏菌核酸實時熒光定量PCR 檢測Ct 值

圖3 布魯氏菌核酸氣溶膠實時熒光定量PCR 擴增結果

3 討論

本研究創新采用氣體采樣泵與過濾吸頭相結合的方式，發明了一個有效采集核酸氣溶膠的裝置。該裝置具有以下特點：一是高效，試驗組方法所用氣體采樣泵的吸氣流量為500 mL/min，在30 min內有1.5 L 室內空氣通過吸頭濾芯，核酸氣溶膠在濾芯部位富集；二是輕巧便攜，采樣泵作為裝置的主體，僅有手掌大小，使用時連接吸頭即可；三是可防交叉污染，采樣泵通過一次性塑料管與一次性過濾吸頭連接，一用一換，能夠有效防止不同采樣過程之間交叉污染。

當空間內核酸氣溶膠的濃度較高時，試驗組和對照組Ct 值均小于30，且都出現了特征性擴增曲線。此時，使用兩種方法均能檢測到核酸氣溶膠污染的存在。但是試驗組在6 個采樣點的平均Ct值較小。結果提示，使用試驗組方法采集到了更多的核酸氣溶膠。當空間內核酸氣溶膠濃度較低時，對照組僅在一半采樣點檢測到Ct 值，且出現特征性擴增曲線。而試驗組在全部采樣點均檢測到Ct值，且出現特征性擴增曲線。結果提示，使用試驗組方法采集到了更多的核酸氣溶膠，且在污染較輕的情況下優勢更明顯，能夠避免假陰性結果出現。

采樣的科學性對于環境監測至關重要。如果不能有效采集樣本，得到的可能會是“假陰性”結果[6-7]。例如，本試驗對照組在噴灑后5 d 采樣時，一半采樣點的檢測結果為陰性，表明使用對照組方法在這3 個點上未能采集到目標核酸。優化樣本采集，除了開發應用新技術，還可以采取以下措施：一是延長裝水離心管在空間內的放置時間，二是在空間內設置多個采樣點。若任一采樣點核酸檢測結果為陽性，均應暫停實驗室運行，并采取相應措施加強實驗室清潔、消毒和除核酸，直至環境監測結果全部合格[8]。

在判斷實驗室是否存在核酸氣溶膠污染的問題上，采樣方法各異。周志圖[9]在其發明專利中，為驗證所發明的核酸氣溶膠清除劑的效果，在實驗室中軸線上、中、下3 個方位，分別放置濾膜，用于采集并回收空氣中的核酸氣溶膠。在對潔凈工作臺或生物安全柜進行空氣采樣時，馬祥等[10]建議打開風機，將用水浸潤過的多層紗布置于排風口，在5～10 min 后洗脫紗布上捕獲的核酸。受此啟發，可以將用水潤濕的紗布置于實驗室排風口處，用于對整個實驗室環境進行監測。北京大學第三醫院的袁曉寧等[11]在評價武漢市某定點醫院SARSCoV-2 污染情況時，采用北京鼎藍科技有限公司生產的便攜式生物氣溶膠采樣器WA-15 對病區環境中可能存在的病毒進行采樣，效果顯著。該設備是一款旋風式生物氣溶膠采樣器，可與凍存管結合使用，將空氣中的顆粒物直接采集到液體中。它不僅可以采集細菌、真菌、病毒等微生物，還可以采集懸浮在氣體介質中的核酸氣溶膠[12]。類似的氣溶膠采集儀器價格昂貴，難以在基層實驗室推廣使用。除上述直接對空氣進行采樣的方法，羅冰科等[13]在應用核酸清潔劑清除法醫DNA 實驗室核酸污染的研究中，參照干濕兩步法，采用棉簽擦拭試驗臺面、移液器、金屬浴、離心機的表面，間接采集實驗室氣溶膠，據此驗證清潔劑對氣溶膠的去除效果。與上述方法相比，本文發明的采樣裝置簡單易用，變被動溶入為主動吸附，直接采集氣溶膠，能夠提高目標核酸的檢出率。