基于響應面法優化雙酶同步酶解的全豌豆乳的穩定性及營養特性研究

肖丹虹，李 萍，鄧媛元，劉 光，趙志浩，王佳佳，鐘立煌，廖 娜，張名位,3,*

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070；3.中原食品實驗室，河南漯河 462300）

豌豆（PisumsativumL.）是我國第二大豆類作物，富含碳水化合物、蛋白質、膳食纖維、維生素和礦物質，具有營養價值高、易消化、低致敏性等特點，是良好的植物性食物來源[1-2]。研究表明，日常增加豌豆的攝入有助于預防糖尿病、冠心病與結腸癌等代謝性疾病的發生，并降低飲食相關的死亡率（5%～7%）[3-4]。豌豆蛋白的組成比例較均衡，與世界衛生組織FAO/WHO 推薦的標準模式接近，且富含賴氨酸，生物效價較高（約48%～64%，功效比為0.6～1.2），是一種優質的全價蛋白質[5-6]。此外，豌豆中慢消化淀粉和抗性淀粉的含量較高，且富含不溶性膳食纖維，在延緩糖尿病患者餐后血糖應答、降低罹患結腸癌和脂肪肝的幾率、促進腸道健康等方面表現突出[7-8]。

近年來，植物基飲料越發受到消費者的青睞[9]。植物基乳飲料是指以植物原料和（或）其制品為蛋白質等來源，經加工工藝制成的飲料。其中，全組分乳日益成為國內外的研究熱點，如以大豆或脫皮大豆為原料制備的全豆豆乳等。全組分植物基乳飲料可實現漿渣不分離，最大程度的保留原料中的有益成分，對肥胖癥、糖尿病等慢性疾病有預防作用[10-11]。由于全組分乳體系較為復雜，體系難以保持穩定。因此，不同的制備技術也逐漸應用于提高植物基乳飲料的穩定性。Wang 等[12]以大麻籽為原料，采用高壓均質技術結合pH 調節處理，制備出無乳化劑添加且穩定性良好的大麻籽全組分乳。酶解工藝也被應用于對底物的定向降解，降低乳液體系的粒徑和粘度。纖維素酶可顯著降低全豆豆漿中不可溶性纖維素等物質的粒徑，提升全豆豆漿的穩定性[13]；復合纖維素酶制備的全豆漿體系穩定性更強[14]；葡萄糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的復配酶解工藝也可有效降低燕麥濁汁的離心沉淀率[15]。

盡管全組分植物乳體系越來越受到研究者的關注，但目前關于高淀粉含量的植物乳液體系穩定性的研究報道相對較少。部分有關濃稠體系的谷物乳研究也大多通過外源添加增稠劑、乳化劑等保持體系穩定。豌豆作為一種營養價值高，低致敏性的豆類，逐漸受到研究者的青睞，基于豌豆的乳類飲品也逐漸被開發。然而，目前基于豌豆原料的全豆乳體系研究依舊比較缺乏。因此，本課題以脫皮豌豆為原料，通過高壓均質耦合生物酶解調質加工技術，對比處理前后豌豆乳體系的離心沉淀率等指標，探究酶解工藝對全豌豆乳穩定性的影響，明確全豌豆乳體系的最佳工藝制備條件，并探討最優工藝制備全豆乳的穩定性及營養特性變化，以期為高淀粉和高膳食纖維的全組分植物乳的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫皮豌豆 吉林省一禾農商貿易有限公司；中溫α-淀粉酶（10000 U/g）、纖維素酶（11000 U/g）夏盛生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

SHP-60 高壓均質機 上海科司大均質機電設備有限公司；LS-50LD 立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司；AR1500EX 流變儀 美國TA 儀器有限公司；zetasizer Nano ZS 90 馬爾文激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Turbiscan Lab穩定性分析儀 北京朗迪森科技有限公司；Infinite M200pro 酶標儀 奧地利TECAN 公司；Allegra64R高速冷凍臺式離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 全豌豆乳的制備工藝 挑選籽粒飽滿有光澤、無蟲害及霉變的脫皮豌豆，加入3 倍體積的碳酸氫鈉（0.5% NaHCO3，w/v）溶液于4 ℃浸泡10 h，100 ℃蒸煮6 min，冷卻洗凈后添加蒸餾水，補齊料水比（1:8，w:w），粗磨制漿4 min 后使用膠體磨細研10 min。調節研磨漿液的pH 至6.00，加入一定量的酶溶液（中溫α-淀粉酶或纖維素酶，按豌豆的干基重量計算酶添加量）后在65 ℃下酶解60 min，煮沸5 min 后滅酶，采用冰水快速冷卻至室溫后調節pH 至7.00。將漿液于30 MPa 下均質處理2 次后裝瓶，置于115 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，制得全豌豆乳體系。

1.2.2 不同酶解工藝制備全豌豆乳體系 按照1.2.1 調整其中的酶解工藝，具體如下：樣品1（傳統過濾）：加入5 U/g 的中溫α-淀粉酶酶解后采用200 目的紗布過濾，棄濾渣得漿液；樣品2（中溫α-淀粉酶單一酶解）：加入5 U/g 的中溫α-淀粉酶酶解；樣品3（雙酶分步酶解），加入5 U/g 的中溫α-淀粉酶酶解60 min 后滅酶，再加入5 U/g 的纖維素酶酶解60 min 后滅酶；樣品4（雙酶分步酶解）：加入5 U/g的纖維素酶酶解60 min 后滅酶，再加入5 U/g 中溫α-淀粉酶酶解60 min 后滅酶；樣品5（雙酶同步酶解），同時加入5 U/g 的中溫α-淀粉酶和5 U/g 的纖維素酶酶解60 min 后滅酶；樣品6（纖維素酶單獨酶解）：加入5 U/g 的纖維素酶酶解，但因該體系熱處理過程中淀粉糊化后樣品黏度過大，樣品的可參照性不強，因此未對該樣品的乳液特性進行評估。

1.2.3 全豌豆乳體系的穩定性研究

1.2.3.1 表觀穩定性 將全豌豆乳置于常溫下（25 ℃）靜置，觀察并分析其析水、沉淀、絮凝的變化。

1.2.3.2 粒徑分布 使用Mastersizer 3000 激光粒度分析儀對全豌豆乳液體系的平均粒徑進行測定，以D（3,2）表示。用滴管將樣品緩慢滴加于進樣口，當折光率穩定在10.00%±2.00%時，開始檢測分析。設置折射率為1.57，吸收率為0.001，分散劑為去離子水（折射率為1.33）[16]。

1.2.3.3 zeta 電位 準確移取0.10 mL 的全豌豆乳用蒸餾水稀釋100 倍，取0.80 mL 稀釋液加入U 形管上機測定。設置折射率為1.673，吸收率為0.001[17]。

1.2.3.4 表觀粘度 準確移取1.30 mL 全豌豆乳于流變儀樣品臺上，使用直徑40 mm 的夾具進行測定，具體測定參數如下：測量溫度25±1 ℃，板間距1 mm，剪切速率由0.1 s-1升至100 s-1。考察樣品表觀粘度隨剪切速率的變化規律[18]。

1.2.3.5 離心沉淀率 稱取2.00 g 全豌豆乳于離心管中，8000 r/min 下離心5 min，去除上清液，稱取離心管底部的沉淀物重量[19]。離心沉淀率的計算如公式（1）所示：

1.2.3.6 多重光散射TSI 稱取20.00 mL 的全豌豆乳至配套玻璃瓶中，在25 ℃下測定Turbiscan 穩定性指數（Turbiscan stability index，TSI）。設置參數掃描時間30 min，每1 min 掃描1 次。

1.2.4 雙酶同步酶解制備全豌豆乳工藝的單因素實驗設計

1.2.4.1 雙酶添加比例對全豌豆乳穩定性的影響固定雙酶添加總量為9 U/g，雙酶酶解時間60 min，中溫α-淀粉酶和纖維素酶的添加比例（酶活力比，U/g 淀粉）分別為5:1、3:1、1:1、1:3、1:5，按照1.2.1 制備全豌豆乳后測定指標。

1.2.4.2 雙酶添加總量對全豌豆乳穩定性的影響固定雙酶添加比例（酶活力比，U/g 淀粉）為1:1，雙酶酶解時間60 min，添加總量設置為3、6、9、12、15 U/g，按照1.2.1 制備全豌豆乳后測定指標。

1.2.4.3 雙酶酶解時間對全豌豆乳穩定性的影響固定雙酶添加比例（酶活力比，U/g 淀粉）為1:1，雙酶添加總量9 U/g，酶解時間分別為30、45、60、75、90 min，按照1.2.1 制備全豌豆乳后測定指標。

1.2.5 雙酶同步酶解制備全豌豆乳工藝的響應面試驗 雙酶添加總量固定不變，酶活力比即中溫α-淀粉酶與纖維素酶的活力比，隨著中溫α-淀粉酶活力的增多或減少，纖維素酶活力相應減少或增多。因此在響應面試驗中，將雙酶添加比例因素改為中溫α-淀粉酶添加量，通過單因素實驗選取最佳取值范圍，選擇中溫α-淀粉酶添加量（A）、雙酶添加總量（B）、雙酶酶解時間（C）3 個影響因素，每個因素設置3 個水平，以離心沉淀率為響應值，使用Design-Expert 13.0 軟件進行響應面優化并確定最佳制備工藝條件，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface optimization design

1.2.6 全豌豆乳體系的貯藏穩定性 將最優條件制備的全豌豆乳置于25 ℃下避光儲存，間隔1 周觀察并記錄表觀穩定性。

1.2.7 最佳工藝制備的全豌豆乳及復配豌豆乳的穩定性及營養特性比較

1.2.7.1 豌豆乳的制備及穩定性評價 全豌豆乳：參考1.2.5 的最優工藝制備全豌豆乳。復配豌豆乳：根據全豌豆乳的營養組成比例，稱取豌豆淀粉（58.46 g）、豌豆蛋白（24.91 g）、豌豆膳食纖維（7.62 g）、葵花油（0.73 g）、復合礦物質（2.50 g）和復合維生素（1.00 g）等單體營養素，加入適量去離子水調整總質量（900 g），參考1.2.5 的全豌豆乳的最優制備工藝，制得復配豌豆乳，并參照1.2.3 的指標評估全豌豆乳和復配豌豆乳的穩定性。

1.2.7.2 豌豆乳體系中淀粉的體外消化特性 參考Zhang 等[20]的方法稍作修改。稱取10.00 g 豌豆乳于50 mL 的離心管，置于37℃的水浴搖床中（160 r/min）溫育5min，然后加入5 mL 的酶溶液進行反應并計時。分別在固定時間點（0、20、40、60、80、100、120 min）取反應液0.10 mL，加入1.90 mL的無水乙醇終止反應，于4300 r/min 條件下離心5 min。采用葡萄糖氧化酶法（GOPOD）在510 nm下測定水解液的葡萄糖含量，按照下式計算淀粉水解率。

采用一級動力學方程擬合淀粉的水解曲線，得消化速率常數。

式中：t 為消化反應時間（min）；C 為消化反應物濃度；k 為消化速率常數（min-1）。

1.2.7.3 豌豆乳體系中蛋白質的體外消化特性 參考夏明敬[21]的方法稍作修改。稱取10.00 g 豌豆乳于50 mL 離心管中，采用2 mol/L 的HCl 調節pH至3.0，置于37 ℃的水浴搖床中（160 r/min）溫育5 min。加入1.50 U/g 的胃蛋白酶溶液進行胃期模擬消化并計時，分別在固定時間（0、10、30、60、120 min）取樣0.50 mL。隨后用2 mol/L 的NaOH調節pH 至7.0 終止反應。在胃期結束所得的消化液中，加入30.00 U/g 的胰蛋白酶溶液進行腸期模擬消化并計時，分別在固定時間（0、10、30、60、120 min）取樣0.50 mL。

將消化樣品在4 ℃下以8000 r/min 離心10 min。參考Zhang 等[20]的TNBS 方法測量α-氨基釋放量。取10 μL 消化的上清液，加入0.25 mL 的0.10%的TNBS 和0.49 mL 的0.2125 mol/L 磷酸鹽緩沖鹽溶液（pH8.2），在50 ℃下水浴避光反應60 min。冷卻至室溫后，通過加入0.1 mol/L 的HCl 調節pH 于3.7～3.9 之間終止反應。測定340 nm 波長下的吸光度。取2.00 g 未消化的豌豆乳，加入1 倍濃鹽酸酸解處理（110 ℃，24 h）后測定α-氨基基團的總量，并采用相同的TNBS 法測定。使用濃度在0～2.5 mg/mL 之間的L-亮氨酸溶液制備標準曲線（y=0.4747x-0.0004，R2=0.9990）。

式中：A 為取樣時間點在340 nm 下的吸光值。

1.3 數據處理

試驗過程中的樣本實驗重復3 次，結果使用平均值±標準差表示，試驗數據的統計與分析采用SPSS 24.0 軟件中Duncan 檢驗，數據均P<0.05 在統計學上具有顯著性差異，繪圖采用Prism.8.0.2 軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同酶解方式對全豌豆乳體系穩定性的影響

不同酶解處理對全豌豆乳體系的表觀穩定性、粒徑、zeta 電位、表觀粘度、離心沉淀率、TSI 的影響如圖1 所示。由圖1A 可知，不同酶解工藝制備的新鮮全豌豆乳體系（放置0 d）均一且穩定。靜置3 d后，傳統過濾制備的全豌豆乳（樣品1）分層明顯，中溫α-淀粉酶單酶酶解的全豌豆乳（樣品2）上層稀薄，其他全豌豆乳樣品體系則相對穩定。靜置15 d 后，樣品1 分層嚴重，樣品2 出現嚴重的表面析水現象，其他樣品出現部分析水，析水現象由弱到強順序為樣品5（中溫α-淀粉酶和纖維素酶同步酶解）、樣品3（先中溫α-淀粉酶酶解，后纖維素酶酶解）、樣品4（先纖維素酶酶解，后中溫α-淀粉酶酶解）。

圖1 不同酶處理方式對全豌豆乳表觀穩定性（A）、粒徑、zeta 電位（B）、表觀粘度（C）、離心沉淀率（D）和TSI 值（E）的影響Fig.1 Effects of different enzymatic treatment on the apparent stability (A),particle size,zeta potential (B),apparent viscosity (C),centrifugal precipitation rate (D) and TSI values (E) of whole pea milk

進一步探究發現，不同工藝制備的全豌豆乳的粒徑D（3,2）、zeta 電位（圖1B）、表觀粘度（圖1C）、離心沉淀率（圖1D）及TSI 值（圖1E）均存在差異。相較于非過濾工藝制備的全豌豆乳，傳統過濾制備的全豌豆乳（樣品1）的粒徑D（3,2）最小，zeta 電位（-28.73 mV）最大，表觀粘度值最低，說明過濾工藝一定程度降低了體系中大顆粒的纖維及蛋白質等組分，減弱了顆粒之間的粘附和電荷的平衡性，因此造成了體系中顆粒物質的不穩定，與表觀穩定性的結果一致[22]。中溫α-淀粉酶單酶酶解的全豌豆乳（樣品2）的離心沉淀率（31.31%）和TSI 值（0.61）較大，說明體系不穩定，這可能歸因于中溫α-淀粉酶單酶酶解破壞了體系中大顆粒不溶性纖維與淀粉分子間的動態平衡，引起體系失穩[13]。相較于雙酶分步酶解的全豌豆乳（樣品3、樣品4），雙酶同步酶解的全豌豆乳（樣品5）的zeta 電位（-38.27 mV）、離心沉淀率（30.37%）和TSI（0.30）顯著降低（P<0.05），體系更穩定。這可能歸因于中溫α-淀粉酶和纖維素酶在體系中的協同作用，同步將淀粉和不溶性纖維降解成帶負電荷基團的可溶小分子物質[19]，抑制分子間的聚集，提高體系的穩定性[23]。

綜合各指標可知，相較于傳統過濾、中溫α-淀粉酶單酶酶解及雙酶分步酶解法，雙酶（中溫α-淀粉酶和纖維素酶）同步酶解法制備的全豌豆乳體系穩定性相對較優。

2.2 雙酶同步酶解單因素對全豌豆乳體系穩定性的影響

2.2.1 雙酶添加比例對全豌豆乳體系穩定性的影響雙酶添加比例對全豌豆乳體系粒徑、電位、表觀粘度、離心沉淀率、TSI 的影響如圖2 所示。隨著中溫α-淀粉酶與纖維素酶添加比例減小，全豌豆乳的粒徑D（3,2）（圖2A）先減小后增大，電位值則先增加后降低再增加。在中溫α-淀粉酶與纖維素酶的酶活比例為1:1 時，全豌豆乳的粒徑D（3,2）（26.13 μm）和電位值（-30.43 mV）最小，這可能歸因于該比例下中溫α-淀粉酶和纖維素酶對淀粉顆粒及纖維素結構的協同降解作用效果最好，生成帶有更多電荷的水解產物分子[23]。全豌豆乳的表觀粘度（圖2B）隨中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例的減小先增大后減小，在酶比例1:1 時表觀粘度最大，可能是該酶比例下，纖維素酶破壞細胞壁釋放出大量淀粉，同時限量的淀粉酶對其酶解程度有限，所以大量淀粉糊化后體系的粘度較高[24]。隨著中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例減小，全豌豆乳體系的離心沉淀率（圖2C）和TSI 值（圖2D）呈現先減小后增大的趨勢，在中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例1:1 時達到最低（分別為29.21%、0.20），說明該酶比例條件下，全豌豆乳體系最穩定。乳液體系中較小的顆粒粒徑、較高的粘度以及較高靜電排斥作用，可以減緩液滴的沉降速率，降低液滴的運動速率，抑制液滴的聚集[23]。過高或過低的中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例均會導致淀粉或纖維素酶解有限或過度酶解，致使體系失穩。

圖2 雙酶添加比例（中溫α-淀粉酶:纖維素酶）對全豌豆乳體系平均粒徑和電位值（A）、表觀粘度（B）、離心沉淀率（C）、TSI 值（D）的影響Fig.2 Effects of double enzyme ratio (medium temperature α-amylase:cellulase) on the particle size and zeta potential value(A),apparent viscosity (B),centrifugal precipitation rate(C),TSI value (D) of whole pea milk

綜合可知，當中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例為1:1 時，體系凈電位、表觀粘度最大，粒徑、離心沉淀率、TSI 值最小，該體系較其他酶比例具有最優穩定性，因此選擇中溫α-淀粉酶與纖維素酶比例1:1 進行響應面優化試驗研究。

2.2.2 雙酶添加總量對全豌豆乳體系穩定性的影響雙酶添加總量對全豌豆乳體系粒徑、電位、表觀粘度、TSI、離心沉淀率的影響如圖3 所示。隨著雙酶添加總量的增加，全豌豆乳的粒徑D（3,2）呈現先降低后升高的趨勢，在9 U/g 時體系的平均粒徑最小（26.83 μm）。當雙酶添加總量大于9 U/g 時，全豌豆乳的粒徑D（3,2）顯著增大（P<0.05），可能歸因于酶解作用加快，大量釋放出被淀粉、纖維素包裹的蛋白質與多糖等分子，促進其在高壓均質和高溫滅菌后相互作用形成大分子顆粒物質[25-26]。同時，雙酶添加總量為9 U/g 時，全豌豆乳體系的電位值達到最小（-30.30 mV），這可能歸因于該酶總量下淀粉和纖維素的降解會暴露出更多帶電荷基團，其相互斥力增大，不容易聚集[27]。雙酶添加總量小于9 U/g 時，被淀粉、纖維素分子包裹的蛋白質等帶電物質難以暴露于體系中；雙酶添加總量大于9 U/g 時，體系中基團間的吸附作用變大，帶電基團相互結合[27]。隨著雙酶添加總量的增加，全豌豆乳體系的表觀粘度（圖3B）逐漸減小。然而全豌豆乳體系的離心沉淀率、TSI 值先減小后增大，與粒徑、電位趨勢基本一致，且當雙酶添加總量為9 U/g 時，乳液體系的離心沉淀率和TSI 值達到最小（28.44%、0.18）。當雙酶添加總量較高時，全豌豆乳的離心沉淀率、TSI 值增大，可能是更高的酶總量破壞了體系中顆粒穩定下的動態平衡，使得顆粒間發生凝聚，從而導致沉淀物增加[28]。

圖3 雙酶添加總量對全豌豆乳體系平均粒徑和電位（A）、表觀粘度（B）、離心沉淀率（C）、TSI 值（D）的影響Fig.3 Effects of total double enzyme amount on the particle size and zeta potential value (A),apparent viscosity (B),centrifugal precipitation rate (C),TSI value (D) of whole pea milk

綜上可知，雙酶添加總量為9 U/g 時，全豌豆乳體系電位值最小，粘度較大，粒徑、離心沉淀率、TSI 值最小，該雙酶添加總量較其他酶量體系具有最優穩定性。因此綜合考慮，后續選擇雙酶添加總量為9 U/g 進行響應面優化試驗研究。

2.2.3 雙酶酶解時間對全豌豆乳體系穩定性的影響雙酶酶解時間對全豌豆乳體系粒徑、電位、表觀粘度、TSI、離心沉淀率的影響如圖4 所示。隨著雙酶酶解時間的延長，乳液體系的粒徑D（3,2）呈現先增加后減小，然后再增加的趨勢。酶解時間75 min 時，體系的平均粒徑達到最小（25.03 μm）。當酶解時間大于75 min，乳液體系的粒徑增大，可能歸因于體系中的顆粒組分進一步聚集，導致體系的平均粒徑增加。全豌豆乳的電位值均表現為負值，隨著酶解時間的延長，電位值逐漸減小，酶解時間90 min 電位的絕對值達到最大（-33.80 mV）。由圖4B 所示，全豌豆乳的表觀粘度隨酶解時間的延長先減小后增大。在酶解時間45 min 時，乳液體系的粘度達到最低，這可能是65 ℃下酶解過程中淀粉糊化及液化反應同時進行，液化作用強于糊化作用；但隨著時間的延長，糊化淀粉進一步增多，粘度相應增加[24]。隨著酶解時間的延長，全豌豆乳的離心沉淀率（圖4C）、TSI 值（圖4D）先減小后增大，當酶解時間為60 min 達到最小（28.86%、0.27），說明此時淀粉酶和纖維素酶的協同降解作用效果較佳，粒徑和粘度的相互作用提高整體穩定性[12]。

圖4 雙酶酶解時間對全豌豆乳體系平均粒徑和電位（A）、表觀粘度（B）、離心沉淀率（C）、TSI 值（D）的影響Fig.4 Effects of double enzyme hydrolysis time on the particle size and zeta potential value (A),apparent viscosity (B),centrifugal precipitation rate (C),TSI value (D) of whole pea milk

綜上可知，雙酶酶解時間為60 min 時體系穩定性更佳，因此優選雙酶酶解時間60 min 進行響應面優化試驗研究。

2.3 雙酶同步酶解工藝條件的響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結果 綜合單因素實驗結果，采用Design-Expert 13.0 軟件設計試驗條件，測定雙酶同步酶解工藝條件下全豌豆乳的離心沉淀率，試驗設計及結果如表2 所示。

表2 全豌豆乳響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results of whole pea milk

遵循BOX-中心復合設計原理，以離心沉淀率為指標，建立回歸方程預測模型，對響應面試驗結果進行多元線性回歸和二項擬合分析，得到回歸方程為

Y=27.27-1.10A-0.2607B-0.7712C+0.0152AB+0.8064AC-0.2969BC+3.69A2+0.0228B2+2.06C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Regression model variance analysis results

從表3 可知，響應面回歸模型中P<0.0001，失擬項P=0.5747>0.05，回歸系數R2=99.56%>85.00%，校正系數R2Adj=0.9899，表明試驗設計可靠，誤差小，適合實際情況，可用此模型來分析和預測試驗因素對全豌豆乳離心沉淀率的影響。

從表3 中P值可知，一次項中中溫α-淀粉酶添加量（A）、雙酶酶解時間（C），二次項A2、C2對全豌豆乳的離心沉淀率影響極顯著，交互項AC 對全豌豆乳的離心沉淀率影響高度顯著，一次項中雙酶添加總量（B）、交互項BC 對全豌豆乳的離心沉淀率影響顯著，其他因素影響不顯著。由F值可知，3 個因素對全豌豆乳離心沉淀率的影響程度為中溫α-淀粉酶添加量（A）>雙酶酶解時間（C）>雙酶添加總量（B）。

2.3.2 各因素交互作用的響應面分析 中溫α-淀粉酶添加量、雙酶添加總量和雙酶酶解時間的各因素交互作用分別如圖5～圖7 所示。中溫α-淀粉酶添加量與雙酶酶解時間的交互作用（圖6）對全豌豆乳的離心沉淀率影響最大，雙酶添加總量與雙酶酶解時間的交互作用（圖7）對全豌豆乳離心沉淀率的影響次之，中溫α-淀粉酶添加量與雙酶添加總量的交互作用（圖5）對全豌豆乳離心沉淀率的影響不顯著。

圖5 中溫α-淀粉酶添加量與雙酶添加總量對全豌豆乳離心沉淀率的交互影響Fig.5 Interaction effect of medium temperature α-amylase amount and total double enzyme addition on the centrifugation precipitation rate of whole pea milk

圖6 中溫α-淀粉酶添加量與雙酶酶解時間對全豌豆乳離心沉淀率的交互影響Fig.6 Interaction effect of medium temperature α-amylase amount and double enzyme hydrolysis time on the centrifugation precipitation rate of whole pea milk

圖7 雙酶添加總量與雙酶酶解時間對全豌豆乳離心沉淀率的交互影響Fig.7 Interaction effect of total double enzyme addition and double enzyme hydrolysis time on centrifugation precipitation rate of whole pea milk

2.3.3 驗證試驗 采用Design-Expert 13.0 軟件進行方程求解，得到理想的酶解工藝條件為：中溫α-淀粉酶的添加量為44.85%，酶總量12 U/g，酶解時間64.48 min，此條件下預測的全豌豆乳離心沉淀率為27.23%。考慮到工藝條件及實際操作的可能性，將酶解工藝條件調整為雙酶添加比例（酶活力比，U/g 淀粉）為中溫α-淀粉酶:纖維素酶=4.5:5.5（酶活力比，U/g 淀粉），添加總量12 U/g，酶解時間65 min，該條件下測得全豌豆乳的離心沉淀率實際值為27.70%±0.21%，與該模型中的預測值相對誤差為1.72%（<5.00%），說明響應面法得到的該模型對中溫α-淀粉酶和纖維素酶同步酶解制備全豌豆乳工藝條件優化的參數準確可靠，具有一定應用價值。

2.4 全豌豆乳體系的貯藏表觀穩定性

以最優的酶解工藝（中溫α-淀粉酶:纖維素酶=4.5:5.5（酶活力比，U/g 淀粉），添加總量12 U/g，酶解時間65 min）條件制備全豌豆乳，其貯藏表觀穩定性如圖8 所示。貯藏2 周內，全豌豆乳體系呈現均勻的乳濁狀、色澤鮮亮，相對穩定；貯藏2 周后，全豌豆乳體系開始出現失穩，表現出上層稀薄現象；貯藏4 周后，全豌豆乳體系出現輕微的表面析水現象；隨著貯藏時間的延長，全豌豆乳體系的表面析水現象加重，貯藏7 周時出現明顯的表面析水現象，色澤上無差異；貯藏9 周后全豌豆乳體系出現少量的析水現象，無明顯的沉淀現象。根據標準QB/T 4221-2011可知，谷物濃漿在貯藏期間狀態允許有少量析水、沉淀、分層或弱凝膠現象。因此，在不經過濾和不添加穩定劑的情況下，本工藝制備的全豌豆乳在25 ℃下貯藏60 d 內表觀顯示無明顯沉淀分層。

圖8 貯藏時間對全豌豆乳表觀穩定性的影響Fig.8 Effect of storage time on the appearance stability of whole pea milk

2.5 全豌豆乳及復配豌豆乳的穩定性及營養特性比較

2.5.1 豌豆乳的穩定性研究 全豌豆乳及復配豌豆乳體系的粒徑、zeta 電位、表觀粘度、離心沉淀率、多重光散射指標的變化如圖9 所示。復配豌豆乳的粒徑D（3,2）（22.30 μm）和zeta 電位（-31.93 mV）（圖9A）顯著（P<0.05）低于全豌豆乳體系，這可能與豌豆蛋白、豌豆淀粉、豌豆膳食纖維等原料均為經過預加工（提取、干燥等）處理的純化樣品有關。全豌豆乳體系的表觀粘度（圖9B）高于復配豌豆乳，可能是由于全豌豆乳體系中淀粉未被完全降解，高溫加熱時發生糊化導致體系的粘度增大；而復配豌豆乳中淀粉、纖維素等被組織結構包裹的可能性小，暴露較為徹底，中溫α-淀粉酶和纖維素酶的降解效果明顯，因此促進體系粘度的降低[28]。從圖9C 可知，復配豌豆乳的離心沉淀率（24.67%）顯著低于全豌豆乳體系（P<0.05），這與粒徑D（3,2）、zeta 電位結果相一致。從圖9D 可知，全豌豆乳和復配豌豆乳的TSI 值均小于0.30，說明兩者的穩定性相對較好。進一步分析背散射光（圖9E～圖9F）可知，豌豆乳的底部和頂部的背散射光強度變動較大，這可能歸因于顆粒運動后發生絮凝、凝結和沉降等。30 min 內，全豌豆乳底部背散射光為負值（峰值為-0.55%），頂部背散射光為正值（峰值為0.62%），表明儲藏后體系中的乳化液滴上浮，底部乳化液滴濃度減少；而復配豌豆乳不同，其底部背散射光為正值（峰值為0.82%）表明顆粒濃度增大，而頂部散射光減小說明顆粒濃度減小，說明主要歸因于大顆粒物質沉降導致體系失穩。因此綜合可知，全豌豆乳的穩定性顯著高于復配豌豆乳。

圖9 全豌豆乳及復配豆乳體系中平均粒徑和zeta 電位（A）、表觀粘度（B）、離心沉淀率（C）、TSI 值（D）、背散射光（E、F）的變化Fig.9 Variation in average particle size and zeta potential (A),apparent viscosity (B),centrifugal sedimentation rate (C),TSI value(D),backscattered light (E,F) of whole pea milk and mixed pea milk

2.5.2 豌豆乳的營養特性研究

2.5.2.1 豌豆乳中淀粉的消化特性 全豌豆乳及復配豆乳體系的淀粉水解曲線和消化動力學常數分別如圖10A 和圖10B 所示。由圖10A 可知，0 min 的豌豆乳體系中均存在一定量的葡萄糖，這可能歸因于豌豆乳的酶解制備工藝過程中，中溫α-淀粉酶和纖維素酶共同作用促進豌豆乳中淀粉降解成葡萄糖。在0～60 min 內，全豌豆乳與復配豌豆乳的淀粉水解特性差異不顯著，但90 min 以后，全豌豆乳的淀粉水解率顯著低于復配豌豆乳，120 min 時，全豌豆乳的淀粉水解率顯著低于復配豌豆乳（降低12.74%）。通過一級動力學方程擬合消化曲線得到消化速率常數和消化程度發現，全豌豆乳體系中的淀粉的消化速率和消化程度（0.38 min-1、47.63%）顯著（P<0.05）低于復配豌豆乳體系（0.44 min-1、55.68%），這可能歸因于復配豌豆乳均是采用單體營養素混合，其中豌豆淀粉在提取、干燥等過程中可能一定程度的破壞淀粉的顆粒結構，從而暴露出更多酶作用位點，表現出更高的淀粉水解率。研究表明，深加工會嚴重破壞淀粉結構并引起食物餐后血糖應答指數的增加[29]。此外，全豌豆乳體系中的蛋白質，不溶性膳食纖維及其他多酚等小分子物質，也可能不同程度的降低淀粉水解速率。因此，相對于復配豌豆乳，以整豌豆為原料制備的全豌豆乳具有較慢的葡萄糖釋放速率，更有利于減緩人體攝入后的餐后血糖的波動。

圖10 豌豆乳的淀粉水解曲線（A）、消化速率及消化程度（B）的變化Fig.10 Variation in the starch hydrolysis curve (A),digestion rate and digestion extent (B) of pea milk

2.5.2.2 全豌豆乳的蛋白質消化特性 全豌豆乳及復配豆乳體系的蛋白質的體外消化特性如圖11 所示。在胃消化期（0～120 min），酶作用于蛋白質釋放α-氨基的速率較為緩慢；在腸消化期（120～240 min），兩種豌豆乳的α-氨基釋放量急劇升高后趨于平緩；消化4 h 時全豌豆乳的α-氨基釋放量（71.92%）顯著（P<0.05）高于復配豌豆乳（61.78%），相對于復配豌豆乳，全豌豆乳的蛋白質水解率提高了16.41%。全豌豆乳的豌豆蛋白未經過其他工藝處理，溶解度較好且結構破壞程度較小。全豌豆乳的制備過程中，豌豆蛋白的熱變性可以改善其體外胃腸的消化率，同時熱處理可以降低酶抑制劑等抗營養因子的活性，進一步提高蛋白質的消化利用程度[30]。復配豌豆乳的蛋白質由于是單體營養素復配，單體營養素在提取時經過了pH 調節、離子強度變換、洗滌、濃縮、干燥等過程，可能影響蛋白質的結構并降低其溶解度，從而一定程度抑制了蛋白質消化[31]。這個結果與之前關于市售豌豆蛋白粉體外消化特性的研究一致，不同加工方式會導致豌豆蛋白結構和溶解度的差異，從而影響酶對其敏感性[32]。因此，相較于單體營養素調配的豌豆乳，以全豆為原料制備的全豌豆乳蛋白質整體水解程度較高。

圖11 不同豌豆乳體外模擬消化過程中蛋白質的α-氨基釋放量Fig.11 α-Amino release of proteins in different pea milk during the in vitro digestion process

3 結論

本研究以豌豆為原料，探究并優化了不同酶解條件對全豌豆乳體系穩定性的影響，明確了雙酶（中溫α-淀粉酶和纖維素酶）同步酶解較其他酶解工藝（傳統過濾、單一酶解、雙酶分步酶解）制備的全豌豆乳穩定性更好。通過響應面分析明確了雙酶同步酶解工藝制備全豌豆乳的最佳條件為：中溫α-淀粉酶:纖維素酶為4.5:5.5（酶活力比，U/g 淀粉），添加總量為12 U/g，酶解時間為65 min，該條件下測得全豌豆乳的離心沉淀率實際值為27.70%，穩定性更優。此外，相較于同等營養含量下的組分復配豌豆乳，全豌豆乳的穩定性高于復配豌豆乳，淀粉消化程度降低12.74%，蛋白質利用程度提高16.41%。該研究結果為高淀粉和膳食纖維類的植物乳體系的開發提供一定的技術參考和理論指導。

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