重構枯草芽孢桿菌的木糖代謝通路生產(chǎn)乙醇酸

摘 要：本研究旨在獲得一株可利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸的食品安全菌。通過同時過表達xdh和yjhG，構建了基因工程菌XDH-YjhG，該菌株能夠利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸，產(chǎn)量為3.15 g·L-1。本研究首次證明了可利用麩皮作為碳源生產(chǎn)乙醇酸，為乙醇酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；麩皮；乙醇酸

Reconstructing the Xylose Metabolic Pathway of Bacillus subtilis to Produce Glycolic Acid

JI Minghua

（Kinry Food Ingredients Co.， Ltd.， Shanghai 200000， China）

Abstract： This study aims to obtain a food-safe bacterium capable of utilizing wheat bran to produce acetic acid. By co-overexpressing xdh and yjhG， a genetically engineered strain XDH-YjhG was constructed， which could use wheat bran to produce acetic acid with a yield of 3.15 g·L-1. This study is the first to demonstrate the use of wheat bran as a carbon source for the production of acetic acid， laying the foundation for the cost-effective industrial production of acetic acid.

Keywords： Bacillus subtilis; wheat bran; acetic acid

乙醇酸（HOCH2COOH）是最簡單的α-羥基酸，別名羥基乙酸或甘醇酸，可廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領域。近年來，全生物法合成乙醇酸因其安全無毒、條件溫和等特點而廣受關注，具有較好的前景。利用代謝工程手段，改造菌株的D-木酮糖-1-磷酸途徑、Dahms途徑或乙醛酸旁路途徑等，可以實現(xiàn)乙醇酸的全生物合成[1]。

枯草芽孢桿菌已獲得“GRAS”和“QPS”雙料認證，菌株安全。本研究以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌，通過木糖脫氫酶編碼基因xdh和木糖酸脫水酶編碼基因yjhG的異源表達，構建了一株食品安全菌。實驗證明該菌株可利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸，該研究對于以廉價生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇酸具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒

實驗所用菌株164T7P為實驗室保存，T7P-YjhG、XDH、XDH-YjhG為本文構建；質(zhì)粒pMK4-PxylA-yjhG、pMK4-T7、pUC57-xdh和pMD19T-aea為實驗室保存，pMK4-T7-yjhG為本文構建。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

細胞培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基。添加1%木糖為誘導培養(yǎng)基；添加1%木糖和1%木糖酸為木糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基；添加2%木聚糖為木聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基；添加6%麩皮為麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 質(zhì)粒構建

采用Simple Cloning的方式在枯草芽孢桿菌中進行質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG的構建[2]，使用引物見表1。在添加氯霉素的LB抗性固體板上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒測序驗證。

1.2.3 基因表達盒的構建

用于敲入xdh基因的基因表達盒xdh cassette通過融合PCR方法構建得到，PCR擴增過程參考文獻[3]。所用的引物序列（5’→3’）見表2。

1.2.4 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化及菌種構建

菌株構建方法參考文獻[3]。質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于氯霉素抗性平板篩選，得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為T7P-YjhG；基因表達盒xdh cassette轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于紅霉素抗性平板篩選，得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為XDH；進一步地，質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌XDH，涂布于氯霉素抗性平板篩選，所得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為XDH-YjhG。

1.2.5 發(fā)酵實驗

研究采用搖瓶發(fā)酵實驗。在LB中接種，37 ℃、200 r·min-1隔夜培養(yǎng)；然后將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至搖

瓶，培養(yǎng)基分別為木糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基、木糖發(fā)酵培養(yǎng)基、木聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基或麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基，于搖床中37 ℃、200 r·min-1進行培養(yǎng)。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測與分析

發(fā)酵液樣品處理：取1 mL發(fā)酵液于12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行檢測。液相條件：色譜柱型號為Aminex HPX-87H column，使用硫酸溶液（0.005 mmol·L-1）作為流動相，設置流速為0.6 mL·min-1，柱溫為65 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 在枯草芽孢桿菌中過表達yjhG

枯草芽孢桿菌中缺乏乙醇酸生產(chǎn)的關鍵酶，不能經(jīng)由木糖酸生成乙醇酸。本實驗室前期研究證明，只需過表達yjhG，后續(xù)借助枯草芽孢桿菌內(nèi)源性酶，即可使枯草芽孢桿菌將木糖酸最終轉(zhuǎn)化為乙醇酸[4]。為了進一步優(yōu)化乙醇酸轉(zhuǎn)化率，本研究從實驗室構建的164T7P出發(fā)，采用更高效的T7啟動子作為表達元件，過表達yjhG基因，構建了菌株T7P-YjhG[圖1（a）]。圖1（b）的曲線為發(fā)酵72 h上清液液相結(jié)果，深色為164T7P發(fā)酵液上清樣品，淺色為T7P-YjhG發(fā)酵液上清樣品，表明乙醇酸合成通路構建成功。發(fā)酵生產(chǎn)乙醇酸的檢測結(jié)果如圖1（c）所示，T7P-Yjh共積累乙醇酸0.93 g·L-1，消耗木糖酸3.85 g·L-1，摩爾轉(zhuǎn)化率為52.74%。前期實驗結(jié)果顯示，在使用PxylA為啟動子時，消耗木糖酸生產(chǎn)乙醇酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為42.54%，這表明采用T7作為表達元件，針對木糖酸的轉(zhuǎn)化率更為高效。

2.2 利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸

枯草芽孢桿菌僅能將木糖磷酸化，使其流向磷酸戊糖途徑，但不能將其轉(zhuǎn)化為木糖酸。為使木糖代謝流向乙醇酸，而不是進入磷酸途徑，本研究首先敲除了xylA-xylB片段[5]，同時將木糖脫氫酶編碼基因xdh通過同源重組的方式，整合到菌株基因組DNA，構建了枯草芽孢桿菌XDH。在木糖培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵評價，研究Xdh蛋白的表達效果。發(fā)現(xiàn)菌株XDH能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木糖酸，120 h木糖完全消耗，積累木糖酸17.51 g·L-1，摩爾轉(zhuǎn)化率為79.12%（數(shù)據(jù)未展示）。

將質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌XDH，構建了XDH-YjhG，評價其對木糖、木聚糖和麩皮的轉(zhuǎn)化能力，見圖2。

在含20 g·L-1木糖的LB培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵評價，研究菌株是否能夠生產(chǎn)乙醇酸，發(fā)酵結(jié)果見圖2（a）。由結(jié)果可知，XDH-YjhG可以生成乙醇酸，最終積累產(chǎn)量為0.99 g·L-1。為探究所構建的XDH-YjhG能夠利用木聚糖生產(chǎn)乙醇酸，本研究在含

20 g·L-1的木聚糖培養(yǎng)基中開展了發(fā)酵研究。由結(jié)果可知，XDH-YjhG可以利用木聚糖生成乙醇酸，最終積累產(chǎn)量為1.20 g·L-1，與木糖相比，其產(chǎn)量增加了21.21%。本研究進一步在麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基中開展研究，由圖2（a）可以看到乙醇酸產(chǎn)量最終最高達到3.15 g·L-1。推測枯草芽孢桿菌可通過內(nèi)源性木聚糖酶，水解出麩皮中的木糖單體，而木糖進一步在Xdh的催化下生成木糖酸，然后經(jīng)由Dahms途徑生成乙醇酸，見圖2（b）。

3 結(jié)論

本研究證明，在枯草芽孢桿菌中僅需表達yjhG基因就可實現(xiàn)木糖酸到乙醇酸的轉(zhuǎn)化；共表達xdh和yjhG，并敲除xylA-xylB片段，可重構枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，使其可利用麩皮產(chǎn)乙醇酸。綜合上述研究結(jié)果，本研究首次證明了使用麩皮發(fā)酵生產(chǎn)乙醇酸的可行性，為食品級生物基的乙醇酸的廉價生產(chǎn)奠定了基礎。

參考文獻

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[2]YOU C，ZHANG X Z，ZHANG Y H P.Simple cloning via direct transformation of PCR product （DNA Multimer） to Escherichia coli and Bacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（5）：1593-1595.

[3]JI M H，LI S J，CHEN A，et al.A wheat bran inducible expression system for the efficient production of α-L-arabinofuranosidase in Bacillus subtilis[J].Enzyme and Microbial Technology，2021，144：109726.

[4]凌翓，紀明華，段海燕，等.木糖酸氧化途徑在枯草芽孢桿菌的構建及轉(zhuǎn)化乙醇酸的研究[J].生物技術通報，2019，35（6）：76-82.

[5]CHEN J Q， ZHU Y M， FU G，et al.High-level intra-and extra-cellular production of D-psicose 3-epimerase via a modified xylose-inducible expression system in Bacillus subtilis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2016，43（11）：1577-1591.

作者簡介：紀明華（1989—），男，河北臨西人，博士，工程師。研究方向：生物化工、食品微生物。