三種馬鮫魚快速檢測方法的建立及應用

摘 要：為了準確快速鑒定馬鮫魚樣品，本研究分別以線粒體Cytb和D-loop為靶基因，篩選出康氏馬鮫、藍點馬鮫與斑點馬鮫的特異性PCR擴增引物，建立了3種馬鮫魚的快速檢測方法，并對檢測方法的特異性、重復性和靈敏性進行了驗證，隨后運用該方法對市售馬鮫魚及其加工制品進行檢測。結果表明，馬鮫魚的快速檢測方法具有良好的特異性和重復性，靈敏性檢測限低于2.000 ng·μL-1 DNA，運用該方法能快速檢測出原料及加工產品中的馬鮫魚成分，整個過程最短用時2 h。本研究建立的3種馬鮫魚PCR快速檢測方法，可實現馬鮫魚物種鑒定，滿足日常檢測需求，對防止水產品摻假、維護消費者權益、規(guī)范市場秩序具有重要意義。

關鍵詞：聚合酶鏈式反應（PCR）；馬鮫魚；快速檢測；物種鑒定

The Establishment and Application of Rapid Detection Methods for Three Species of Mackerel

YANG Jianqi1，2， LI Ang2， LIU Shufang2*

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China; 2.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： To accurately and swiftly identify samples of Scomberomorus species， this study utilized mitochondrial Cytb and D-loop as target genes to screen specific PCR primers for Scomberomorus commerson， Scomberomorus niphonius， Scomberomorus guttatus， the rapid detection methods for three types of Scomberomorus were established， and the specificity， repeatability， and sensitivity of the detection methods were validated， subsequently， this method was used to detect commercially available Scomberomorus and its processed products. The results indicate that the rapid detection method for Scomberomorus exhibits excellent specificity and repeatability， the sensitivity detection limit is below 2.000 ng·μL-1 of DNA， using this method allows for the rapid detection of Scomberomorus components in raw materials and processed products， with the entire process taking a minimum of 2 h. The three rapid PCR detection methods for Scomberomorus established in this study enable the identification of Scomberomorus species， meeting the requirements for routine testing， this is of significant importance in preventing adulteration in aquatic products， safeguarding consumer rights and interests， and regulating market order.

Keywords： polymerase chain reaction（PCR）; mackerel; rapid detection; species identification

馬鮫魚（Scomberomorus）為脊椎動物門（Vertebrata）硬骨魚綱（Osteichthyes）鱸形目（Perciformes）鯖科（Scombrida）鲅屬魚類總稱，別名鲅魚，是世界范圍內重要的海洋經濟魚類。我國有康氏馬鮫（Scomberomorus commerson）、藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius）、斑點馬鮫（Scomberomorus guttatus）、中華馬鮫（Scomberomorus sinensis）和朝鮮馬鮫（Scomberomorus koreanus）5個種，廣泛分布在渤海、黃海、東海和南海地區(qū)。其中，康氏馬鮫、藍點馬鮫和斑點馬鮫的產量較高，是我國近海主要經濟物種。馬鮫魚的典型形態(tài)特征是體呈紡錘形或長紡錘形，體背側藍黑色，腹側銀白色，體側有多列黑色圓斑[1-2]。因種間形態(tài)學差異較小，給物種鑒定帶來一定困難。且市場上的馬鮫魚多以鮮食烹制、速凍整魚或切片、煙熏、魚糜制品等形式銷售[3-4]，通過形態(tài)學方法鑒別物種比較困難。一些不法商販為牟取更大的利潤，常用形態(tài)相似、低價值的鮐、圓鮀鰹等魚類替代高價值馬鮫魚售賣。因此，迫切需要建立一種快速特異的檢測手段對馬鮫魚進行有效鑒別。

基于聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術的分子生物檢測方法具有特異性強、靈敏度高、不受組織類別限制等優(yōu)點，更適合魚類及其冷凍切片產品或深加工制品的物種鑒別[5-9]。為有效區(qū)分和鑒定馬鮫魚，本研究擬針對每個物種設計特異性引物，根據瓊脂糖凝膠電泳圖的條帶有無和PCR產物長度即可實現物種的準確快速分類和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

康氏馬鮫（S. commerson）、斑點馬鮫（S. guttatus）、藍點馬鮫（S. niphonius）各3條，取自國家海洋漁業(yè)生物種質資源庫的漁業(yè)生物DNA條形碼憑證標本庫，用于建立3種魚類的特異性檢測方法。同時，從購物平臺采購了不同產地馬鮫魚的魚片、魚丸、魚泥、魚干和魚罐頭等制品，如表1所示，用于馬鮫魚快速檢測方法的驗證。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

本實驗采用天根生物科技有限公司的海洋生物組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。將提取好的DNA置于-20 ℃保存，待后續(xù)PCR擴增使用。

1.2.2 PCR引物設計

通過NCBI數據庫搜索并下載康氏馬鮫、斑點馬鮫、藍點馬鮫、圓鮀鰹和鮐的線粒體基因序列，如表2所示，使用MEGA7.0軟件進行序列比對，找出Cytb和D-loop序列的變異區(qū)域。

使用Primer Premier 5.0軟件在種間高度變異而種內高度保守的區(qū)域設計12對特異性引物。先在NCBI數據庫中使用primer-BLAST工具進行引物特異性篩選，獲得3對特異性高的引物。然后使用康氏馬鮫、藍點馬鮫和斑點馬鮫憑證標本對引物的特異性進行檢驗。最終篩選出的特異性引物序列如表3所示。引物由青島華大基因公司合成。

1.2.3 PCR反應體系和條件

PCR反應體系為25 μL，包含Taq混合液（2×）12.5 μL，DNA模板3 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。

康氏馬鮫的PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；59 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。藍點馬鮫和斑點馬鮫的反應條件與康氏馬鮫的PCR反應條件相同，僅退火溫度不同。藍點馬鮫退火溫度設定為61 ℃，斑點馬鮫退火溫度設定為58 ℃。

1.2.4 PCR擴增產物電泳檢測

使用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，電壓為120 V，電泳10～15 min。根據電泳條帶的有無和擴增產物片段大小，判斷待樣品是否為目標魚類。

1.2.5 特異性檢測

為驗證3種馬鮫魚引物特異性，分別以目標魚類為試驗組，其他近緣物種為陰性對照組，以無菌雙蒸水為模板作空白對照，進行3個平行的PCR試驗。由于生物體往往存在個體差異性，將目標物種進行

3個不同個體的生物學重復檢測，每組以其中一種馬鮫魚的3個不同個體為陽性對照，其余兩種馬鮫魚、圓鮀鰹及鮐的3個不同個體為陰性對照，以無菌雙蒸水作為空白對照。

1.2.6 靈敏度檢測

將提取的康氏馬鮫、斑點馬鮫、藍點馬鮫DNA進行10倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋后的濃度分別為20.000 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.200 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1、0.002 ng·μL-1，依次進行各濃度DNA樣品的PCR試驗，以考察所建立方法的檢測靈敏度。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的特異性和重復性

藍點馬鮫特異性引物檢測結果如圖1所示，本研究設計的特異性引物僅能夠擴增出藍點馬鮫的基因片段，擴增長度符合目標片段長度，在其他物種中未出現非特異性擴增。因此，本研究設計的特異引物對藍點馬鮫具有特異性。

泳道：01為藍點馬鮫；02為斑點馬鮫；03為康氏馬鮫；04為圓鮀鰹；05為鮐；06～07為空白；08為Marker。

藍點馬鮫特異性引物重復檢測結果如圖2所示，01～03為藍點馬鮫陽性結果，基于藍點馬鮫D-loop基因設計的特異性引物能夠擴增出3個藍點馬鮫樣品的D-loop基因片段，擴增長度均符合目標片段長度，不出現其他非特異性擴增片段。

斑點馬鮫特異性引物檢測結果如圖3所示，02為斑點馬鮫陽性結果，基于斑點馬鮫D-loop基因設計的特異性引物能夠擴增斑點馬鮫的D-loop基因片段，擴增長度符合目標片段長度，不出現其他非特異性擴增片段。因此，本研究設計的斑點馬鮫特異引物對斑點馬鮫具有特異性。

斑點馬鮫特異性引物重復檢測結果如圖4所示，04～06為斑點馬鮫陽性結果，基于斑點馬鮫D-loop基因設計的特異性引物能夠擴增出3個斑點馬鮫樣品的D-loop基因片段，擴增長度均符合目標片段長度，不出現其他非特異性擴增片段。

泳道：01～03為藍點馬鮫；04～06為斑點馬鮫；07～09為康氏馬鮫；10～12為圓鮀鰹；13～15為鮐；16為空白；17為Marker。

康氏馬鮫特異性引物檢測結果如圖5所示，03為康氏馬鮫陽性結果，基于康氏馬鮫Cytb基因設計的特異性引物能夠擴增康氏馬鮫的Cytb基因片段，擴增長度符合目標片段長度，不出現其他非特異性擴增片段。因此，本研究設計的康氏馬鮫特異引物對康氏馬鮫具有特異性。

康氏馬鮫特異性引物重復檢測結果如圖6所示，01～03為康氏馬鮫陽性結果，基于康氏馬鮫Cytb基因設計的特異性引物能夠擴增出3個康氏馬鮫樣品的Cytb基因片段，擴增長度均符合目標片段長度，不出現其他非特異性擴增片段。

泳道：01～03為康氏馬鮫；04～06為斑點馬鮫；07～09為藍點馬鮫；10～12為圓鮀鰹；13為鮐；16為空白；17為Marker。

2.2 檢測方法的靈敏度

由圖7可知，將康氏馬鮫、藍點馬鮫、斑點馬鮫的DNA進行10倍連續(xù)梯度稀釋，分別進行各濃度DNA樣品的PCR試驗，PCR擴增反應能夠檢測到目的基因的最小值結果依次為0.200 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1，說明本實驗建立的快速檢測方法對康氏馬鮫、藍點馬鮫和斑點馬鮫的檢測靈敏度分別為0.200 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1。

2.3 檢測方法在市售馬鮫魚加工制品中的應用

從市場購買11份馬鮫魚產品，使用本研究建立的PCR方法進行檢測，市售馬鮫魚加工制品檢測結果如表4和圖8所示。編號2樣品魚丸、編號10樣品速凍整魚檢測結果含有斑點馬鮫成分；編號3、編號4、編號5樣品魚丸、魚泥，編號7、編號8樣品咸魚干檢測結果含有藍點馬鮫成分；編號9樣品切片、編號11樣品速凍整魚檢測結果含有康氏馬鮫成分，編號1樣品罐頭、編號6樣品魚泥未檢測出3種馬鮫魚成分。深加工制品罐頭及1份魚泥未檢測出馬鮫魚，可能是因為這兩個產品不是馬鮫魚，也可能是加工過程中DNA降解嚴重，從而導致未檢出。

3 結論與討論

水產品的摻雜使假一直是影響其質量與安全的主要問題之一，基于特異性引物的PCR方法可以快速準確地檢測動物源性成分[10-12]，因此，國內外已廣泛使用特異性PCR方法快速開展水產品的物種鑒定及其成分檢測[13-25]。本文通過設計3種馬鮫魚的特異性引物，根據PCR產物的有無及其長度，便可實現馬鮫魚物種的精準鑒定。本研究建立的3種馬鮫魚快速檢測方法特異性強、重復性好，檢測限≤2.000 ng·μL-1，整個過程最短用時2 h。該方法克服了傳統形態(tài)學方法的不足，解決了缺乏專業(yè)知識儲備和鑒定人員等問題，有效縮短了鑒定時間，操作簡單、快速，對樣品DNA的純度要求低，鑒定結果更為準確可靠，可滿足水產品市場監(jiān)管和檢驗的適用性要求，具有較大的推廣價值和應用前景，對維持水產品市場健康發(fā)展及維護廣大消費者利益具有積極意義。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2019YFC1604702）；國家自然科學基金項目（32102768和42076132）；中國水產科學研究院黃海水產研究所基本科研業(yè)務費項目（20603022022024）。

作者簡介：楊健琪（1997—），女，山西忻州人，碩士。研究方向：漁業(yè)資源分子生態(tài)學。

通信作者：柳淑芳（1967—），女，山東青島人，博士，研究員。研究方向：漁業(yè)資源分子生態(tài)學。E-mail： liusf@ysfri.ac.cn。