固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定海產(chǎn)品中微囊藻毒素和魚腥藻毒素

摘 要：目的：建立固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定海產(chǎn)品中7種微囊藻毒素和2種魚腥藻毒素的方法。方法：樣品經(jīng)80%乙腈提取，HLB小柱凈化后，采用MRM模式進行分析，外標法定量。結(jié)果：7種微囊藻毒素和2種魚腥藻毒素在0.5～50.0 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.3 μg·kg-1，回收率為75.5%～98.8%，相對標準偏差在1.5%～5.4%。結(jié)論：該方法重現(xiàn)性較好、靈敏度高、成本低，可以實現(xiàn)海產(chǎn)品中的魚腥藻毒素和微囊藻毒素的同時檢測。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；魚腥藻毒素；固相萃?。⊿PE）；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

Simultaneous Determination of Microcystins and Anatoxins in Marine Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Solid Phase Extraction

LYU Xiaojing， JU Guangxiu， QU Xin， WANG Yong， YU Hongwei*

（1.Qingdao Municipal Center For Disease Control amp; Prevention/Qingdao Institute of Preventive Medicine， Qingdao 266033， China; 2.Shimadzu （China） Co.， Ltd.， Beijing Branch， Beijing 100020， China）

Abstract： Objective： A method for simultaneous determination of 7 microcystins （MCs） and 2 Anatoxins （AnTXs） in marine products was achieved by solid phase extraction （SPE）-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Method： The sample was extracted with 80% acetonitrile， purified by HLB small column， analyzed using MRM mode， and quantified using external standard method. Result： The linear ranges for 7 MCs and 2 AnTXs were 0.5～50.0 μg·L-1. The limits of detection were 0.3 μg·kg-1. The recoveries of the 7 MCs and 2 AnTXs spiked in blank marine products ranged from 75.5% to 98.8% with the relative deviations of 1.5%～5.4%. Conclusion： The method has the advantages of good reproducibility， high sensitivity and low cost， and can achieve simultaneous detection of fishy algae toxins and microcystins in seafood.

Keywords： microcystin; anatoxin; solid phase extraction （SPE）; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）和魚腥藻毒素（Anatoxins，AnTXs）是兩種典型的藍細菌毒素[1]。微囊藻毒素是藍藻釋放的次級代謝產(chǎn)物，由環(huán)七肽和特殊的芳香族氨基酸側(cè)鏈-AD-DA構(gòu)成，100多種異構(gòu)體中MC-RR、MC-LR最為常見。鑒于其毒性和危害，世界衛(wèi)生組織在飲用水標準中規(guī)定了MC-LR的限值為1 μg·L-1，2017年被列入2B類致癌物清單[2]。魚腥藻毒素是一類具有神經(jīng)毒性的小分子生物堿，可造成神經(jīng)傳導阻滯[3]。此外，魚腥藻毒素-A（Anatoxin-a，AnTX-a）與常見的微囊藻毒素MC-LR還會產(chǎn)生協(xié)同毒性作用[4-5]。

藍細菌毒素通過各類水生生物特別是水產(chǎn)品進入食物鏈，最終進入人體內(nèi)，從而對人類健康帶來風險。青島地區(qū)海產(chǎn)品食用量大，海產(chǎn)品安全關(guān)系到人們的健康。因此，建立快速、靈敏、準確的藍細菌毒素檢測方法，考察藍細菌毒素在海產(chǎn)品中的含量及分布具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

貝類和魚類等海產(chǎn)品，購于青島大型農(nóng)貿(mào)市場和超市。

標準品（First Standard MC-LY：2.5 μg·mL-1；MC-LW：10 μg·mL-1；MC-YR：10 μg·mL-1；MC-LA：2.5 μg·mL-1；MC-LF：10 μg·mL-1；MC-RR：20 μg·mL-1；壇墨質(zhì)檢MC-LR：10 μg·mL-1；Eurofins Abraxis H-ATx：10 μg·mL-1；Canada ATX：5 μg·mL-1）。乙腈、甲酸均為色譜純；實驗用水為超純水；Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）。

島津LC-MS/MS 8060液質(zhì)聯(lián)用儀；Milli-Q Gradient型超純水器；手動固相萃取儀；氮吹儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

各種微囊藻毒素和魚腥藻毒素用甲醇配成50 ng·mL-1的標準儲備液。再用標準儲備液分別配成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的系列標準溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取及凈化

提?。簩⒑．a(chǎn)品（購于青島大型農(nóng)貿(mào)市場和超市）可食部分用組織搗碎勻漿機勻漿，取樣品5 g置于50 mL離心管中，加入20 mL 80%乙腈溶液，渦旋混勻2 min，超聲提取5 min，5 000 r·min-1離心5 min。取10 mL上清液待凈化。

凈化：按照Oasis HLB固相萃取小柱的操作條件，進行樣品凈化，將收集的洗脫液于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL流動相初始比例復溶殘渣，過0.22 μm濾膜，待上機。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱Shim-pack Scepter C18-120；柱溫：35 ℃；流速：0.35 mL·min-1；流動相組成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈；梯度洗脫：0～4 min，75%A→15%A；4～5 min，15%A；5～5.1 min，15%A→75%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；加熱氣流量：15 L·min-1；干燥氣流量：3 L·min-1；霧化氣流量：3 L·min-1；接口溫度：350 ℃；脫溶劑管線DL溫度：180 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃。掃描模式：多離子反應監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

以乙腈與0.1%的甲酸水溶液作為流動相時目標物響應值最高，適量的甲酸有利于改善峰型且有助于提高離子化效率。分別考察ACQUITY UPLC BEH ? C18、Shim-pack GIST C18和Shim-pack Scepter C18-120 3種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)用Shim-pack Scepter C18-120色譜柱時各化合物峰型較好且干擾較小。因此，實驗選用Shim-pack Scepter C18-120色譜柱。

2.2 提取溶劑及超聲時間的選擇

結(jié)合文獻報道[6]，考察了20%、40%、60%和80%的乙腈溶液的提取效率，結(jié)果顯示，當乙腈為80%時，大部分化合物的相對較高，故選擇80%乙腈溶液為提取溶劑。考察了超聲時間為5 min、10 min、15 min和20 min的提取效率，結(jié)果表明，超聲時間的延長，提取效率未見顯著的提高，所以超聲提取確定為5 min。

2.3 固相萃取柱的選擇

文獻報道顯示[7]，C18固相萃取小柱容易受操作影響，從而導致回收率不穩(wěn)定。實驗中考察了HLB柱的提取效果，結(jié)果顯示該柱能有效地對添加樣品中的兩類毒素進行富集和凈化，故選擇Oasis HLB固相萃取小柱。

2.4 標準曲線、檢出限

配制一系列標準溶液，以目標物的峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性擬合，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，在0.5～50.0 μg·L-1，9種藍細菌毒素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。以3倍信噪比確定各目標化合物的檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.5 回收率與精密度

在陰性樣品花蛤中加入藍細菌毒素混合標準溶液，分別進行0.8 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1加標回收率考察，計算回收率及相對標準偏差。結(jié)果顯示，加標回收率在75.5%～98.8%，相對標準偏差在1.5%～5.4%，精密度和準確度均較好。

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

購買100份海產(chǎn)品（貝類和魚類各50份），按照本方法進行檢測。結(jié)果顯示，在一份花蛤樣品中檢出MC-YR，結(jié)果為0.83 μg·kg-1，在一份貽貝中檢出MC-RR，結(jié)果為0.57 μg·kg-1，未有其他藍細菌毒素的檢出。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了SPE-HPLC-MS/MS方法分析海產(chǎn)品中藍細菌毒素的方法，實現(xiàn)了魚腥藻毒素和微囊藻毒素的同時測定。海產(chǎn)品經(jīng)乙腈提取，HLB小柱凈化，采用MRM測定，該方法靈敏度高，操作簡單、快速，具有良好的精密度和準確度，可以為海產(chǎn)品中魚腥藻毒素和微囊藻毒素等藍細菌毒素的定性和定量檢測提供技術(shù)參考。

參考文獻

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[2]World Health Organization.Guidelines for drinking-water quality， fourth edition[J].Asian Water： Asia’s Journal of Environmental Technology，2011，27（7）：34.

[3]CARMICHAEL W W， GORHAM P R.Anatoxins from clones of Anabaena flos-aquae isolated from lakes of western Canada[J].Sil Commun，1978，21（1）：285-295.

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[5]LI Q，GU P，ZHANG C，et al.Combined toxic effects of anatoxin-a and microcystin-LR on submerged macrophytes and biofilms[J].J Hazard Mater， 2020，389（5）：122053.

[6]徐瀟穎，劉柱，毛思浩，等.全自動在線固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定螺旋藻中8種微囊藻毒素[J].食品科技，2023，48（4）：305-311.

[7]吳潔珊，倪清泉，任永霞，等.HPLC-高分辨飛行時間質(zhì)譜測定水中多種微囊藻毒素[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2020，32（6）：54-57.

作者簡介：呂曉靜（1982—），女，山東青島人，碩士，主管技師。研究方向：理化檢驗。

通信作者：于紅衛(wèi)（1971—），女，山東青島人，本科，副主任技師。研究方向：理化檢驗。E-mail：fish_yhw@126.com。