高效液相色譜法在醬油食品添加劑含量測定中的應用

摘 要：為驗證醬油中食品添加劑是否符合國家標準限量要求，本文建立了高效液相色譜法測定市售醬油中安賽蜜、苯甲酸、檸檬黃、山梨酸、糖精鈉、莧菜紅、咖啡因和日落黃等8種食品添加劑的含量。結果表明，8種食品添加劑在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數均大于等于0.999 0；平均加標回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%；5種醬油中8種食品添加劑含量均符合國家限量要求。本方法操作簡單、反應速度較快，且準確性較高，可用于食品添加劑快速篩查。

關鍵詞：高效液相色譜法；醬油；食品添加劑；含量測定

Application of High Performance Liquid Chromatography in the Determination of Soy Sauce Food Additives

ZHAO Qianru

（Weishan County Inspection and Testing Center， Jining 277600， China）

Abstract： In order to verify whether food additives in soy sauce meet the national standard limit requirements， a HPLC method was established to determine the contents of 8 food additives in soy sauce， such as acesulfame， benzoic acid， lemon yellow， sorbic acid， saccharin sodium， amaranth red， caffeine and sunset yellow. The results showed that the 8 food additives had good linear relationships in their linear ranges， and the correlation coefficients were all greater than or equal to 0.999 0; the average recoveries were 93.58%～98.27%， RSD＜2%; the contents of 8 food additives in 5 kinds of soy sauce all meet the national limit requirements. This method has the advantages of simple operation， fast reaction speed and high accuracy， and can be used for rapid screening of food additives.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; food additives; content determination

醬油也叫豉油，是由小麥、大豆、食用鹽等原料經過發酵等工序制作而成的一種調味品，因其獨特的風味、色澤以及豐富的營養價值，已成為人們飲食制作中極為重要的調味品之一。醬油以咸味為主，有提香、提鮮等作用，成分比較復雜，包括食用鹽、氨基酸、糖類和各種有機酸類、色素等，用以改變菜肴色澤、提升菜肴味道[1-2]。

近些年，由于人們對食品安全問題關注度的提升，食品中添加劑的使用也已經成為人們關注的熱點問題之一，《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中針對食品添加劑的使用種類、條件等進行了明確規定，且為保證人們的身體健康，相關標準對各種食品添加劑的最大允許使用量也進行確切要求，一旦食品添加劑含量超過國家標準要求，則很有可能引發食品安全問題。例如，苯甲酸防腐劑有抑制細菌、真菌和霉菌生長等作用，但當其含量超標時，會影響人體對維生素、鈣的吸收，并引發腎功能異常、肝臟代謝功能紊亂等，對人體骨骼生長產生不良影響。

目前，常采用氣相色譜法、液相色譜法、紫外-可見分光光度法、液相色譜-質譜法以及氣質聯用法等進行食品添加劑測定，其中高效液相色譜法不僅操作簡單方便，還具有分析速度快、質譜靈敏度較高、分離效率較高等優點[3-4]。鑒于此，本文通過建立高效液相色譜法，對醬油中8種食品添加劑含量進行測定，旨在保證市場醬油食品安全和品質提供技術保障和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨、山梨酸和苯甲酸（國藥集團化學試劑有限公司）；安賽蜜、苯甲酸、檸檬黃、山梨酸、糖精鈉、莧菜紅、咖啡因和日落黃（上海源葉生物科技有限公司）；市售5種醬油；實驗室自制超純水。

1.2 儀器與設備

1100 series高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；5510OE-DTH超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）；3-18KS高速臺式冷凍離心機（德國Sigma公司）；TE612-L電子天平（賽多利斯公司，感量0.01 g）；TU-1810PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技發展有限公司）；PALL Cascada LS型超純水系統（美國PALL公司）；PHS-3C精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）；CW-2000超聲波協同萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 配制標準溶液

分別稱取10 mg苯甲酸、落日黃和山梨酸，20 mg莧菜紅、安賽蜜和咖啡因，100 mg糖精鈉，60 mg檸檬黃，經超純水溶解后，定容至100 mL容量瓶，于4 ℃環境貯存備用，配制質量濃度為1 000 μg·mL-1的混合標準儲備溶液各40 μL。

分別對標準儲備液進行逐級稀釋，配制成20.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1和1.25 μg·mL-1的混合標準使用液，于4 ℃環境貯存備用。根據譜圖中的保留時間對其進行定性分析，通過峰面積對其進行定量分析，每個稀釋梯度各測定3次，取平均值，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

分別取各醬油樣品2 mL，將其添加到10 mL容量瓶內，使用95%乙醇進行定容，搖勻后靜置10 min，將各樣品醬油中的添加劑進行振蕩提取10 min、超聲提取10 min，使用濾紙過濾。各取5 mL過濾液，放置于10 mL容量瓶內，向其中加入超純水進行稀釋定容，使用0.45 μm濾膜進行過濾，留存待測。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Diamon?sil Plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1，pH=7.0）；檢測波長：230 nm；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

2 結果與分析

2.1 條件優化

2.1.1 波長確定

根據HPLC檢測結果發現，HPLC紫外檢測波長為230 nm時，8種食品添加劑出峰效果理想，且能夠完全分離；波長為220 nm、250 nm時，苯甲酸、糖精鈉和安賽蜜有重疊情況，分離度比較差，故本文選擇230 nm作為檢測波長。

2.1.2 確定色譜柱和柱溫

為驗證最佳色譜條件，本實驗對比了Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）和HC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量均為5 μL，配備紫外檢測器，分別進行HPLC測定。結果發現，采用Diamonsil PIus-C18柱時，8種食品添加劑可呈對稱峰型，能夠完全分離，且保存時間理想，其他色譜柱存在色譜峰拖尾、峰型不對稱、保留時間較長等現象，故本文選擇Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為實驗色譜柱。

本文對比柱溫分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃時對檢測效果的影響。發現柱溫為30 ℃時，峰型良好，食品添加劑可完全分離，無拖尾現象，其余柱溫下分離效果較差、有峰重疊、保留時間較短、基線漂移以及噪音增大等現象，故選擇30 ℃作為實驗柱溫。

2.1.3 確定流動相

考察流動相分別為甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1）、甲醇-磷酸二氫鉀（20 mmol·L-1）、乙腈-乙酸銨（20 mmol·L-1）、乙腈-磷酸二氫鉀（20 mmol·L-1）時對分離效果的影響。結果表明，甲醇-乙酸銨作為流動相時，峰型較好、分離速度較快，其余分離效果不理想，物質保留時間較短，有峰重疊，故本文選擇甲醇-乙酸銨作為流動相。

2.1.4 確定洗脫方式

實驗發現，由于流動相中甲醇體積分數的增加，物質保留時間有所下降，當采用等度洗脫方式時，山梨酸、糖精鈉無法被有效分離[5]，而當降低甲醇體積分數時，雖然能夠將二者分離，但洗脫時間超過60 min。因此，本文選用梯度洗脫方式，洗脫程序見表1。

2.1.5 確定緩沖溶液pH值

配制濃度為20 mmol·L-1的磷酸二氫鉀和乙酸銨緩沖溶液，在不同pH（4.5、5.5、6.0、6.6和7.0）緩沖液下進行實驗[6]。pH值為7.0時，8種食品添加劑分離效果理想，峰型較好，無拖尾現象。故本文選擇pH值為7.0。

2.1.6 確定流速

考察流速為0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1時對分離效果的影響，結果發現當進樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1時分離效果較為理想，因此本次試驗最終選擇的流速為1.0 mL·min-1。

2.2 線性關系、檢出限、定量限

為避免和減小誤差，在最佳色譜條件下，重復多次進樣，計算8種食品添加劑的檢出限、定量限和線性范圍，得出各食品添加劑的線性方程和相關系數（表2）。其中，方法檢出限和定量限根據國家標準《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中相關要求，采用信噪比法進行確定，測定10次，取平均值，檢出限平均測定結果信噪比（S/N）均＞3，定量限平均測定結果信噪比（S/N）均＞10。由表2可知，8種食品添加劑在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數均≥0.999 0。

2.3 加樣回收實驗

根據1.3.3處理，采用外標法定量，計算加標回收率。由表3可知，8種食品添加劑的加標回收率在93.58%～98.27%，RSD在0.8%～1.3%，說明該檢測方法準確性較高，穩定性理想，可用于醬油中食品添加劑含量的日常測定工作。

2.4 樣品測定結果

采用上述方法對5種醬油樣品中的8種食品添加劑含量進行測定，測定結果見表4。根據我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中關于食品添加限量要求，5種醬油樣品中食品添加劑的含量均在國標允許范圍內，未出現超標的現象。

3 結論

本文采用高效液相色譜法測定醬油中8種食品添加劑含量，其最佳測定條件為Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流動相為甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1，pH=7.0），檢測波長230 nm。該條件下各添加劑在各自的線性范圍內線性關系良好，平均加標回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%，且5種醬油樣品中食品添加劑含量均符合國家標準要求，未發現超標情況。說明高效液相色譜法可用于多種食品添加劑測定，操作簡單、準確性較高。

參考文獻

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[2]朱青，曹美萍，張繼春.液相色譜法和液質聯用法應用于醬油中三氯蔗糖測定能力驗證的結果與分析[J].食品與發酵科技，2023，59（6）：155-160.

[3]國陽，張鶴之.淺析高效液相色譜及液相色譜-質譜聯用技術在食品檢測中的應用[J].現代食品，2023，29（22）：80-82.

[4]王春蕾，戴麗，李冰冰，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定現制茶飲中7種食品添加劑[J].江蘇預防醫學，2023，34（5）：521-523.

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[6]李曉芹，金尉，袁小美.GC-MS內標法測定發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量[J].中國調味品，2017，42（6）：135-138.

作者簡介：趙倩薷（1990—），女，山東微山人，本科，助理工程師。研究方向：食品檢測。