發酵乳和乳飲料中乳酸菌活菌數ATP檢測方法的開發與應用

摘 要：乳酸菌活菌數作為發酵乳和乳酸菌飲料的產品質量屬性，同時作為國家風險抽檢項目，目前的檢測方法存在操作煩瑣、檢測周期長、結果滯后等缺點，無法滿足企業產品賣點宣稱及質量控制，故針對發酵乳和乳飲料中乳酸菌活菌數的快速檢測方法進行開發、研究，旨在提高檢測結果準確性、穩定性及縮短檢測周期。每種微生物中的腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）含量都是基本恒定的，而ATP的相對發光單位（Relative Luminescence Unit，RLU）與ATP含量呈線性關系，通過建立產品中乳酸菌數量與ATP的RLU（相對發光單位）的相關關系開發乳酸菌快速檢測方法。通過試驗證實該方法與國家標準檢測方法具有一致性，能夠快速、準確地檢測產品中乳酸菌數活菌數，為生產銷售流通中的質量監測提供一種快捷方便的方法。

關鍵詞：乳酸菌總數；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）；發酵乳；發酵乳飲料；快速檢測

Development and Application of ATP Detection Method for Lactobacillus Viable Count in Fermented Milk and Milk Beverage

WANG Hui1， WEI Liming2， LIU Chao2， YU Dongwei3， LU Gang3*

（1.Mengniu Hi-Tech Dairy Products （Beijing） Co.， Ltd.， Beijing 101100， China; 2.Mengniu Dairy （Tianjin） Co.， Ltd.， Tianjin 301700， China; 3.Inner Mongolia Mengniu Dairy （Group） Co.， Ltd.， Hohhot 011500， China）

Abstract： As the product quality attribute of fermented milk and lactic acid bacteria beverage， and as a national risk sampling project， the current detection method has the shortcomings of cumbersome operation， long detection cycle and lagging results， which cannot meet the selling point claim and quality control of enterprises， so the rapid detection method for the number of live lactic acid bacteria in fermented milk and milk beverage is developed and studied， aiming to improve the accuracy， stability and shortening of the detection cycle. The research data showed that the ATP content in each microorganism was basically constant， and the RLU （relative luminescence unit） of ATP was linearly related to the ATP content. Develop a rapid detection method for lactic acid bacteria by establishing a correlation between the number of lactic acid bacteria in the product and the relative luminescence unit （RLU） of ATP. The test proves that the method is consistent with the national standard detection method， which can quickly and accurately detect the number of lactic acid bacteria and the number of viable bacteria in the product， and provide a fast and convenient method for quality monitoring.

Keywords： total number of lactic acid bacteria; adenosine triphosphate（ATP）; fermented milk; fermented milk drink; quick detection

目前，發酵乳及乳飲料中乳酸菌活菌數的檢測均依據食品安全國家標準方法開展，該類方法檢測過程煩瑣、檢測周期較長、關鍵指標結果出具時間滯后，對生產過程質量控制帶來極大的不便，同時檢測結果受人員操作、培養時間、培養溫度等因素的影響較多，結果準確性和穩定性差。為降低上述缺陷帶來的質量風險，需要建立一種快速檢測乳酸菌活菌數的方法并應用于產品質量控制[1]。

本研究引入腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）檢測系統，通過測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數。隨著ATP濃度的增加，相對發光單位（Relative Luminescence Unit，RLU）越來越高，ATP濃度與RLU存在線性關系[2]。該方法操作簡單、結果準確、檢測周期短，單個樣品檢測僅需10 min。ATP生物發光法有望發展為方便、快速、經濟的微生物檢測方法，在食品工業上將展示出廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與試劑

1.1.1 樣品

蒙牛優益C乳酸菌飲料、蒙牛冠益乳、大果粒發酵乳，以及蒙牛杯酸發酵乳。

1.1.2 儀器

EPIC熒光儀（LUM-EPIC）；恒溫培養箱：（36±1）℃；天平：感量0.01 g。

1.1.3 試劑

儀器配套的檢測試劑、日常清洗試劑盒（EPIC-CLEAN）、日常監控試劑盒（EPIC-CTRL）、96孔微孔板（EPIC-MP-96-50）、無菌生理鹽水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

無菌生理鹽水（0.85%）：稱取氯化鈉8.5 g加入1 000 mL的蒸餾水中，加熱溶解，分裝后121 ℃高壓滅菌15～20 min。

1.2.2 樣品制備

取產品將其充分搖勻后，無菌操作稱取樣品25 g放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分振搖，制成1∶10的樣品勻液。吸取10倍樣品稀釋液50 μL轉移至微孔中。

1.2.3 樣品檢測

產品經過前處理后，置于無菌容器中混勻，移取50 μL樣品到微孔板微孔中。使用EPIC熒光儀檢測。

1.2.4 結果計算

所有待測樣品孔檢測完成后，輸出PDF版本樣品RLU值結果，各樣品依據閾值進行判定即可。

2 結果與分析

2.1 ATP檢測方法在發酵乳中的應用

2.1.1 ATP信號值與乳酸菌濃度的相關性分析

為了確定ATP熒光信號強度與發酵乳中乳酸菌含量的關系，根據微生物的生長規律，選擇0 h、

24 h和48 h的樣品數據進行相關性分析，標準曲線、線性方程、相關系數見圖1、圖2、圖3。由圖1、圖2、圖3可知，產品生產后0 h、24 h、48 h，所有樣品的ATP信號值（RLU）與乳酸菌總數均有良好的相關性，其R2均＞0.99。

2.1.2 發酵乳閾值的設定

使用發酵乳樣品上機檢測，選擇10批次發酵乳產品，依據1.2的步驟處理后上機檢測，每個樣品重復檢測8次，根據檢測結果設定閾值。由表1可知，所有樣品的RLU值范圍為294～3 480，大于294的樣品乳酸菌數都大于1.0×107 cfu·g-1，《食品安全國家標準 發酵乳》（GB 19302—2010）要求為≥1.0×106 cfu·g-1，能夠滿足國家標準要求，故可以采用熒光值大于294作為放行標準，但是需要結合工廠實際品項及風險考慮（實際產品活菌數多處于108～109 cfu·g-1），應加嚴快檢方法的閾值設定，即采用較高的ATP（RLU）為放行標準，這樣既滿足國家標準要求，也能在滿足高效檢測的基礎上降低產品不合格放行風險，所以對于發酵乳制品根據目前數據可以ATP（RLU）值大于3 000 RLU為放行標準。

2.1.3 發酵乳ATP測定法與國家標準方法結果比對

以發酵乳產品為試驗對象，通過兩種方法測定乳酸菌活菌數試驗結果見表2。說明ATP檢測方法與國家標準檢測方法在結果判定上具有一致性。

2.2 ATP檢測方法在乳酸菌飲料中的應用

2.2.1 ATP信號值與乳酸菌濃度的相關性分析

為了確定ATP熒光信號強度與乳酸菌飲料中乳酸菌含量的關系，根據微生物的生長規律選擇0 h、24 h和48 h的樣品的數據進行相關性分析，結果見圖4、圖5和圖6。所有樣品的ATP信號值（RLU）與乳酸菌總數均有良好的相關性，其R2均＞0.99。

2.2.2 乳酸菌飲料閾值的設定

使用乳酸菌飲料樣品上機檢測，選擇10批次乳酸菌飲料產品，依據1.2步驟處理后上機檢測，根據檢測結果設定閾值。由表3可見，20種RLU值的范圍為8 918～20 345，大于8 918 RLU的樣品乳酸菌數都大于7.6×108 cfu·g-1，目前依據《食品安全國家標準 發酵乳》（GB 19302—2010）要求為≥1.0×106 cfu·g-1，能夠滿足國家標準要求，可以采用熒光值大于8 918 RLU作為放行標準，考慮實際產品活菌數多處于108～109 cfu·g-1范圍（其10倍生理鹽水稀釋液熒光值處于10 000以上），故可以加嚴快檢方法的閾值設定，采用較高的ATP（RLU）為放行標準，在滿足高效檢測的基礎上降低產品不合格放行風險，所以對于乳酸菌飲料產品根據目前數據可以ATP（RLU）值大于8 000 RLU為放行標準[3]。

表3可以看出，最低值8 918時產品乳酸菌數已達到108 cfu·g-1，滿足蒙牛乳制品（天津）有限責任公司的質量要求及產品宣稱，故定8 000即可[4]。

2.2.3 乳酸菌飲料ATP測定法與國家標準方法結果比對

以乳酸菌飲料產品為試驗對象，根據兩種方法測定乳酸菌活菌數試驗結果見表4。說明ATP檢測方法與國家標準檢測方法在結果判定上具備一致性。

2.3 影響因素分析

2.3.1 檢測時間對乳酸菌數的影響分析

將發酵乳、乳酸菌飲料按類型各自抽取3批產品分別在0 h、24 h、48 h進行檢測，分析檢測時間對乳酸菌數的影響，結果見表5。0 h與24 h的乳酸菌數t值（t=0.294＜t0.05，2=4.303），24 h與48 h的乳酸菌數t值（t=0.825＜t0.05，2=4.303），0 h與48 h的乳酸菌數t值（t=0.313＜t0.05，2=4.303），兩兩之間的t值均小于t0.05，2，說明不同檢測時間下乳酸菌數之間無顯著差異。由此證明檢測時間對乳酸菌總數無明顯影響，48 h內檢測均能保證結果的準確性[5-6]。

2.3.2 游離ATP對實驗結果的影響

食品中的ATP包括游離ATP和微生物ATP，首先通過ATP降解酶酶解微生物細胞外的游離ATP，之后裂解微生物活細胞，釋放出微生物活細胞內的ATP，游離ATP經過處理后上機檢測，分析游離ATP對實驗結果的影響程度。由表6可知，t=0.481＜t0.05，5=2.571，說明游離ATP經預處理后的檢測結果與正常程序獲得的檢測結果之間無顯著差異，游離ATP對檢測結果無顯著影響，無需對游離ATP進行處理。

3 結論

本文對發酵食品中乳酸菌快速檢測技術-ATP生物發光法進行技術可行性研究，通過與國家標準方法進行比對、檢測時間和游離ATP對檢測結果準確性影響因素等各方面充分進行分析論證，證明本方法具有結果準確、快速、操作簡單等優點，適用于發酵食品中乳酸菌總數的快速分析檢測。但目前本試驗只針對高含量活菌產品的準確性和適用性進行了驗證，其他類型的產品或含菌量低、菌株復雜的產品在準確度方面仍面臨挑戰。使用過程應關注以下幾個方面。①樣品若被多種菌屬污染，如同時含大腸菌群、致病菌等，該方法無法區分，統一計數為活菌數，易造成結果偏差或產品不合格誤判為合格，需同步驗證其他微生物生長情況。②該方法靈敏度高，可持續開發應用于食品生產線、食品器件的清潔度評價，以及微生物檢測領域消毒滅菌效果驗證。③該方法可嘗試用于滅菌乳、罐頭食品的商業無菌檢測，也可開發用于生乳驗收過程菌落總數的測定。

參考文獻

[1]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗：GB 4789.35—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[2]王麗蕓，李新，楊佳生，等.基于ATP生物發光法的微生物數量快速檢測技術的研究進展[J].微生物學通報，2022，49（8）：3451-3468.

[3]中華人民共和國衛生部.食品安全國家標準 發酵乳：GB 19302—2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

[4]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控制規范 食品微生物檢測：GB/T 27405—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.中國國家標準化管理委員會.含乳飲料：GB/T 21732—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[6]中華人民共和國農業部.發酵型含乳飲料：NY/T 799—2004[S].北京：中國農業出版社，2004.

基金項目：2021—2024年呼和浩特市科技計劃項目（重大科技專項），乳制品食品安全風險識別及品質控制技術研究（2021-農-重-1）。

作者簡介：王慧（1982—），女，天津人，本科，副高級工程師。研究方向：乳品檢驗分析、乳品質量控制。

通信作者：逯剛（1978—），男，吉林長春人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全與風險研究。E-mail： lugang@mengniu.cn。