高效液相色譜法測定花生中β-谷甾醇的含量

摘 要：目的：建立超聲波輔助萃取-高效液相色譜法快速檢測花生中β-谷甾醇的分析方法，并應用該方法對遼寧、山東和河南3個花生種植大省不同品種花生中β-谷甾醇的含量進行分析測定。方法：樣品經85%乙醇溶液（乙醇∶水=85∶15，V∶V）超聲提取，離心，中性氧化鋁去色素和雜質后，經Agilient ZORBAX SB-C18色譜柱分離，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。結果：β-谷甾醇在1.0～100.0 mg·L-1范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為y=10.070x+2.348（r=0.999 9）；平均加標回收率為88.5%～106.9%，相對標準偏差為2.31%～4.73%（n=6），檢出限為0.5 mg/100 g。運用該方法對30個花生樣品進行檢測，不同品種花生β-谷甾醇含量在31.6～77.0 mg/100 g。結論：該方法簡單快捷、重復性好、準確度和靈敏度較高，適用于花生中β-谷甾醇的快速檢測。

關鍵詞：花生；β-谷甾醇；超聲波輔助萃取；高效液相色譜法（HPLC）

Determination of β-Sitosterol in Peanuts by High Performance Liquid Chromatography

YAN Chaojie1， ZHANG Cheng1， ZHANG Xudong1， WANG Shiqi1， SUN Xiaodong2*

（1.Comprehensive Technical Service Center of Jinzhou Customs， Jinzhou 121013， China; 2.College of Environment and Bioresources， Dalian Minzu University， Dalian 116600， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid analytical method for the determination of β-sitosterol in peanuts by ultrasonic-assisted extraction-high performance liquid chromatography （HPLC）.The method was applied to determine the contents of β-sitosterol in different peanut varieties from Liaoning， Shandong and Henan province. Method： The samples were extracted with 85% ethanol （ethanol∶water=85∶15， V∶V） by ultrasonic， after centrifugation and removing pigments and impurities with neutral alumina， separated by Agilient ZORBAX SB-C18 column， and then detected by diode array detector， and quantitated by external standard method. Result： β-sitosterol showed a good linear relationship with peak area in the range of 1.0～100.0 mg·L-1， and the regression equation was y=10.070x+2.348 （r=0.999 9）. The average recoveries were 88.5%～106.9%， with RSD of 2.31%～4.73%， and the limit of detection was 0.5 mg/100 g. The method was used to detect 30 peanut samples， the content of the content of β-sitosterol in different peanuts ranged from 31.6 mg/100 g to 77.0 mg/100 g. Conclusion： The method has the advantages of simple， convenient， good repeatability， high accuracy and sensitivity， which can meet the requirements of rapid analysis of β-sitosterol in peanuts.

Keywords： peanut; β-sitosterol; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography （HPLC）

花生是我國重要的油料和經濟作物[1]，目前我國花生種植面積排全球第二位，年總產量居世界首位[2-3]。在我國，花生常被人們稱為長壽果，其不僅是一種具有很高營養價值的食品，也是一味可以入藥的保健良品。花生中除了含有人體所必需的油酸、亞油酸等多種脂肪酸及亮氨酸、色氨酸等氨基酸外[4]，還含有豐富的維生素、微量元素、糖類、多酚類、膽堿、膳食纖維和植物甾醇等營養成分[5-6]，其中植物甾醇為食品中公認的抗癌抗腫瘤營養成分。花生中含有的植物甾醇以β-谷甾醇含量最高，已有研究證明β-谷甾醇在降低血液膽固醇含量、抑制乳腺增生、抑制腫瘤、防治前列腺增生和調節免疫方面都有重要作用[7-9]。2004年歐盟就已經批準允許在特定食品中使用植物甾醇，2010年我國原衛生部也批準并認證植物甾醇為新資源食品[10]，由此可見β-谷甾醇具有很高的應用價值。因此，花生作為β-谷甾醇含量較高的經濟作物種類，應在高甾醇品種培育和深加工提取方面予以重點關注、研究和推廣。

目前，現已報道的用液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇的樣品前處理方法普遍較為復雜。例如，張建書等[11]用高效液相色譜法對山東、廣東、河南3個地區共45個花生品種中植物甾醇的組成及含量進行分析測定時，采用正己烷浸提萃取花生油，再對花生油皂化回流進行植物甾醇提取；張志舟等[12]用反向高效液相色譜法測定花生中β-谷甾醇時，采取花生樣品先皂化回流，再用正己烷液液萃取，最后再進行過濾和定容。以上前處理方法中，花生樣品需要經過浸提、皂化、萃取、過濾和定容等多個環節才能進行液相色譜上機檢測，相對費時費力，整個過程消耗的有機試劑量較大，也會導致分析物的回收率相對較低。因此，本研究建立了超聲波輔助提取，結合高效液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇含量的方法，擬為我國篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供技術支持，也為快速檢測花生中β-谷甾醇含量提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生樣品由錦州海關綜合技術服務中心收集，供試的30個花生樣品（編號為P1～P30）來自遼寧、河南、山東3個省份。所有花生樣品均產于2022年。

β-谷甾醇標準品（純度≥98.9%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、中性氧化鋁（分析純，天津市光復精細化工研究所）；甲醇、乙腈（色譜純，美國J.T.Baker公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器、ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）（美國安捷倫公司）；B-400粉碎機（德國BUCHI公司）；BS 323 S千分之一天平、BSA 224 S萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；KH7200DE型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；T 25均質分散器、MS 3 digital旋渦混合器（德國IKA公司）；3-15臺式大容量離心機（德國Sigma公司）；0.22 μm有機系濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 花生中β-谷甾醇的提取

將收集的花生樣品，去殼，選取成熟飽滿、大小均一、無腐敗損傷的花生仁用高速粉碎機粉碎。稱取花生粉末5 g（精確至0.001 g）于100 mL具塞聚乙烯離心管中，加入30 mL 85%乙醇溶液，用均質分散器（轉速18 000 r·min-1）均質100 s后，放于25 ℃水浴中超聲30 min；4 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入另一個干凈離心管中，再以少量85%乙醇溶液洗滌殘渣，4 000 r·min-1 離心5 min后合并濾液，并向濾液中加入5 g中性氧化鋁，混勻振蕩2 min后，4 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉移至50 mL具塞玻璃管中定容，用微量移液器取1 mL過0.22 μm濾膜后進行高效液相色譜檢測分析。如提取后的樣品不能及時上機檢測，需要放到4 ℃條件下避光冷藏保存。

1.3.2 標準溶液的配制

（1）β-谷甾醇標準儲備液。精密稱取β-谷甾醇標準品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容，配制成1 000 mg·L-1的標準儲備液，-20 ℃避光保存，有效期2個月。

（2）β-谷甾醇標準工作液。用無水乙醇將

1 000 mg·L-1 β-谷甾醇標準儲備液稀釋成濃度分別為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的標準工作液，4 ℃避光冷藏備用。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶乙腈（40∶60，V∶V）；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長設定為210 nm；柱溫箱溫度為30 ℃；樣品進樣量為30 μL。

1.3.4 測定

取30 μL樣品溶液進行高效液相色譜測定，在上述色譜條件下測定試樣中β-谷甾醇的峰面積。由標準工作曲線的線性回歸方程計算花生樣品溶液中β-谷甾醇的濃度。

1.3.5 結果計算

花生樣品中β-谷甾醇含量的計算公式為

式中：X為樣品中β-谷甾醇的含量，mg/100 g；ρ為花生樣品溶液中β-谷甾醇的濃度，mg·L-1；V為試樣最終定容體積，mL；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

目前，食品和藥物中β-谷甾醇檢測的前處理方法主要有皂化回流提取法、萃取提取法、超聲波輔助萃取法、吸附法和絡合法等[13-14]，但大多數前處理方法的提取過程都比較煩瑣、步驟繁多。同時，由于植物甾醇通常存在于復雜的植物基質中，樣品溶液中有多種潛在干擾物，花生中蛋白質和脂肪含量又較高，所以本研究既要縮短前處理時間，簡化操作步驟，還要去除提取溶液中的干擾成分，最終選用提取效率較高同時又操作簡便的超聲波輔助提取法。從圖1中可以看出均質后的花生樣品經過超聲波提取再高速離心，加入中性氧化鋁可以去除樣品溶液中的大量色素和部分雜質，不僅在花生樣品的提取溶液中保留了β-谷甾醇成分，還可以防止基質中蛋白質和脂肪等成分的干擾。實驗結果表明，應用超聲波-離心前處理法提取效率高，速度快，適用于花生中β-谷甾醇的快速提取檢測。

2.2 流動相的選擇

高效液相色譜法檢測β-谷甾醇常用的流動相有乙腈[11]、乙腈/異丙醇[12]、甲醇[15-16]、甲醇/水[17-18]、甲醇/0.1%磷酸[19]、甲醇/0.15%甲酸[20]等。本研究分別采用色譜實驗室常用的100%甲醇、甲醇/水和甲醇/乙腈體系分離花生樣品提取溶液中的β-谷甾醇。其中以100%甲醇為流動相時，β-谷甾醇出峰時間較早，保留時間在7 min左右，但分離度較低，使β-谷甾醇的色譜峰與后面緊鄰的其他植物甾醇色譜峰基線不能實現有效分離；以不同比例的甲醇/水為流動相時，β-谷甾醇色譜峰的峰形不佳。最終采用甲醇∶乙腈=40∶60為流動相時，β-谷甾醇色譜峰的峰形較好，分離度能夠到達檢測需求，出峰時間也較適宜。這是由于反相色譜柱中溶劑的洗脫能力隨樣品極性的增強而減弱，甲醇的極性強于乙腈，故在流動相中加入洗脫能力更強的乙腈更有利于β-谷甾醇的分離。

2.3 線性范圍和方法檢出限

用無水乙醇將β-谷甾醇標準儲備液稀釋成質量濃度為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的系列標準工作液，上機測定，以β-谷甾醇標準溶液質量濃度（x，mg·L-1）為橫坐標，相應的色譜峰面積（y）為縱坐標，得到的線性方程為y=10.070x+2.348，相關系數r=0.999 9，由此可見，β-谷甾醇在1.0～100.0 mg·L-1范圍內線性關系良好。以3倍信噪比計算檢出限，最終確定該方法β-谷甾醇的檢出限為0.5 mg/100 g。

2.4 重復性實驗

取P18號花生樣品，按1.3.1前處理方法平行制備6份供試樣品溶液，按1.3.3色譜條件測定。該樣品中β-谷甾醇平均含量為31.6 mg/100 g，RSD為1.35%（n=6），結果表明該方法的重復性良好。

2.5 回收率測定

稱取已知β-谷甾醇含量的花生樣品5 g（精確至0.001 g），在花生樣品中分別添加低濃度（5 mg/100 g）、中濃度（25 mg/100 g）、高濃度（50 mg/100 g）3個水平的β-谷甾醇標準樣品，按照1.3.1和1.3.4進行6平行樣品前處理和上機檢測，不同添加濃度的加標回收率保持在88.5%～106.9%，相對標準偏差為2.31%～4.73%。由表1可見，該方法具有較好的精密度和回收率，滿足實驗要求。

2.6 花生樣品β-谷甾醇含量的檢測結果

采用本研究建立的方法對遼寧、山東和河南3個省份2022年新產的30份花生樣品的β-谷甾醇含量分別進行檢測分析，每個樣品做3個平行。結果如表2所示，花生樣品β-谷甾醇的含量在31.6～77.0 mg/100 g。由此可見，不同產地不同花生樣品中β-谷甾醇含量差異較大。

3 結論與討論

目前，我國尚未發布適用于花生中β-谷甾醇檢測的國家標準或行業標準方法，氣相色譜法常用于檢測植物甾醇，但樣品提取需要經過衍生化處理，比較煩瑣，液相色譜-質譜/質譜儀也因價格昂貴，不適用于尚未配備該儀器的基層實驗室。此外，現已公開發表的液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇時，花生樣品需要經過浸提、皂化、萃取、過濾和定容等多個環節才能上機檢測，相對費時費力。因此，本研究通過優化前處理條件，建立了超聲波輔助-離心快速提取，高效液相色譜法檢測花生仁中β-谷甾醇含量的方法。該方法具有前處理簡單、檢測速度快、特異性強、成本低等優點，該方法的檢出限為0.5 mg/100 g，因花生中含有豐富的植物甾醇成分，所以可以滿足花生中β-谷甾醇定量分析的要求。通過實際檢測，不同濃度β-谷甾醇添加量的加標回收率為88.5%～106.9%，相對標準偏差為2.31%～4.73%，表明本方法快速實用、準確可靠，解決了現有方法提取步驟煩瑣、檢測時限長的問題。

本研究通過對遼寧、山東、河南3個地區共30個花生樣品的β-谷甾醇含量進行測定，結果表明花生仁中β-谷甾醇含量在31.6～77.0 mg/100 g，不同花生品種β-谷甾醇的含量差異較大。本研究結果可為花生和其他堅果中β-谷甾醇的快速檢測提供新的選擇，也為篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供了方法支持。

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基金項目：遼寧省自然科學基金項目（2022-MS-455）。

作者簡介：閆超杰（1979—），女，遼寧錦州人，碩士，高級農藝師。研究方向：食品安全檢測分析。

通信作者：孫曉東（1979—），女，遼寧丹東人，博士，副教授。研究方向：食品安全檢測及功能微生物應用。E-mail：sxd@dlnu.edu.cn。