3 種磷酸鹽對白鰱魚肌原纖維蛋白磷酸化的影響

摘 要：為改善低鹽（1 g/100 mL NaCl）環境中肌原纖維蛋白的功能特性，研究不同添加量的焦磷酸鈉（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）、六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHMP）對白鰱魚肌原纖維蛋白結構和功能特性的影響。結果表明：低鹽條件下，隨著磷酸鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白的溶解度、表面疏水性、乳化性均呈上升趨勢；3 種磷酸鹽均使肌原纖維蛋白引入磷酸基團；添加0.2～0.5 g/100 mL STPP能夠降低肌原纖維蛋白熱解速率，提升蛋白質熱穩定性，其中0.4 g/100 mL STPP修飾的蛋白質磷酸化程度最大，此時大量的磷酸根基團與肌原纖維蛋白結合；TSPP和STPP更有利于蛋白質的聚集，而SHMP磷酸化的蛋白質更穩定。綜上，0.4 g/100 mL STPP對低鹽條件下肌原纖維蛋白功能特性具有更好的改善作用。

關鍵詞：磷酸化；肌原纖維蛋白；低鹽；溶解度；原子力顯微鏡

Effect of Three Phosphates on the Phosphorylation of Myofibrillar Proteins from Silver Carp

XIA Lizhi1， LU Yufeng1， LI Qiang1， LIU Songkun1， LIN Lin1，2，3， LU Jianfeng1，2，3，*

（1. College of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230601， China;

2. Anhui Provincial Key Laboratory for Agriculture Products Modern Processing， Hefei 230601， China;

3. Engineering Research Center of Bio-Process， Ministry of Education， Hefei 230601， China）

Abstract： This study investigated the effects of adding different levels of tetrasodium pyrophosphate （TSPP）， sodium tripolyphosphate （STPP） or sodium hexametaphosphate （SHMP） on the structural and functional properties of myofibrillar proteins from silver carp in a low-salt （1 g/100 mL NaCl） environment. The results indicated that under low-salt conditions， the solubility， surface hydrophobicity， and emulsification properties of increased with increasing addition of phosphate. All three phosphates introduced phosphate groups into myofibrillar proteins. The pyrolysis rate of myofibrillar proteins was reduced by the addition of 0.2–0.5 g/100 mL STPP， indicating improved thermal stability. The protein was most significantly phosphorylated by the addition of 0.4 g/100 mL STPP， resulting in binding of a large number of phosphate groups to the protein. TSPP and STPP led to protein aggregation， while proteins phosphorylated by SHMP were more stable. In conclusion， the addition of 0.4 g/100 mL STPP improved the functional properties of myofibrillar proteins to a greater extent under low-salt conditions.

Keywords： phosphorylation; myofibrillar proteins; low-salt; solubility; atomic force microscope

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240122-026

中圖分類號：TS254.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）01-0010-09

引文格式：

夏立志， 魯玉鳳， 李強， 等. 3 種磷酸鹽對白鰱魚肌原纖維蛋白磷酸化的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（1）： 10-18. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240122-026. " "http：//www.rlyj.net.cn

XIA Lizhi， LU Yufeng， LI Qiang， et al. Effect of three phosphates on the phosphorylation of myofibrillar proteins from silver carp[J]. Meat Research， 2024， 38（1）： 10-18. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240122-026.

http：//www.rlyj.net.cn

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）在魚類肌肉蛋白中的含量為60%～80%，其結構和功能性質決定了魚糜制品的品質。MP是鹽溶性蛋白，可以溶于較高離子強度溶液中，在低離子強度溶液中的溶解度和穩定性較差[1]。在食品工業中，肉制品通常會添加2%～3%的鹽，以提供足夠的蛋白質溶解度，獲得良好的質地并增強風味。然而，人體攝入過量食鹽可能會出現高血壓和心血管病等健康問題[2]。近年來，為減少加工食品中的鹽分，并彌補低鹽對肉制品加工帶來的不利影響，對蛋白質定向修飾以改善其功能性質的研究日益受到關注。研究表明，通過使用微波[3]、超聲波[4]、超高壓[5]、糖基化[6]和磷酸化[7]等方法均可以顯著提升低鹽肉制品的品質。

磷酸鹽可以對蛋白質分子進行磷酸化，磷酸根離子和MP相互作用導致肌動球蛋白解離，改善蛋白質的功能和凝膠特性[8]。焦磷酸鈉（tetrasodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）和六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHMP）是肉制品加工中常用的品質改良劑[9]。蛋白質磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的技術手段之一，能夠改變蛋白質的功能特性，如溶解性、乳化性和凝膠性等[10]。戚亭等[11]研究發現，使用STPP磷酸化能夠明顯改善南極磷蝦蛋白的溶解性、吸油性和乳化性。周景麗等[12]采用STPP對蝦蛄鹽溶蛋白進行磷酸化修飾，能夠顯著改善蝦蛄鹽溶性蛋白的功能性質。Cen Shijie等[13]研究發現，TSPP磷酸化能夠增加魚明膠的靜電斥力，顯著改善魚明膠的凝膠性能、乳化性能和表觀黏度。Zhu Yajun等[14]研究發現，當STPP的添加量為0.6%（m/m）時，蛋白質的磷酸化程度最高，魚糜蟹肉混合凝膠的凝膠性能最佳。Kaewruang等[15]發現，在pH 9時使用0.25% STPP磷酸化明膠具有最佳的凝膠強度和致密的網狀結構。

隨著日益增長的低鹽飲食健康需求，魚糜制品中鈉鹽含量較高的問題受到廣泛關注。目前，關于低鹽條件下的磷酸鹽種類對磷酸化修飾白鰱魚MP的結構和功能特性研究不足。因此，本研究采用3 種不同的磷酸鹽（TSPP、STPP和SHMP）對白鰱魚MP進行磷酸化修飾，并對MP磷酸化程度進行表征，分析磷酸化MP的溶解度、表面疏水性、乳化特性、微觀結構和熱穩定性等的變化。旨在提供一種化學磷酸化方法用于改善低鹽狀態下MP的理化性質，為低鹽肉制品的高品質開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱魚（體質量約2 kg/條） 合肥二十里埠菜市場。

TSPP、STPP、SHMP、1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4） 北京索萊寶科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；Pro-Q Diamond染色劑、Sypro Ruby染色劑 美國Invitrogen有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-21M冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；IKA T8均質機 德國IKA公司；EPOCH酶

標儀 美國BioTek Instruments公司；PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；Amersham Typhoon NIR近紅外熒光掃描成像儀 美國GE公司；Dimension Icon原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM） 德國Bruker公司；TG209F1熱重（thermogravimetric，TG）分析儀 德國Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

參照Wang Qian等[16]的方法提取MP并稍作修改。采集新鮮白鰱肉并攪碎，加入4 倍體積的低鹽緩沖液（含0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4），然后在4 500 r/min下離心15 min后棄上清液。重復3 次上述步驟后收集沉淀物，在4 ℃用4 倍體積的高鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4）溶解，放置4 h后在4 500 r/min下離心15 min。收集上清液后用10 倍體積超純水沉淀30 min，然后在8 000 r/min下離心20 min，所得沉淀即為MP。MP保存在4 ℃冰箱并在48 h內使用，以上所有步驟均在4 ℃下進行。采用Bradford法測定蛋白質量濃度。

1.3.2 磷酸化MP制備

用pH 7.4、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液將MP稀釋為10 mg/mL，MP溶液中分別添加TSPP、STPP、SHMP（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL）和NaCl，具體添加量如表1所示。對照組不添加磷酸鹽，僅添加1 g/100 mL NaCl，確保所有處理組的Na＋濃度均為0.171 mol/L，以消除Na＋對MP的影響，然后在4 ℃下磷酸化反應2 h。2、3 g/100 mL NaCl組不添加磷酸鹽（Na＋濃度分別為0.342、0.513 mol/L），用于表征磷酸化MP的功能特性變化。

1.3.3 溶解度測定

將MP分散液在4 ℃、8 000×g條件下離心15 min，使用Bradford法測定上清液和原始MP分散液中的蛋白質量濃度。蛋白質溶解度按式（1）計算。

（1）

式中：ρ1為上清液蛋白質量濃度/（mg/mL）；ρ2為初始分散液蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 pH值測定

使用pH計測定MP分散液的pH值。

1.3.5 表面疏水性測定

參考王子凌等[17]的方法并稍作修改。將200 μL 1 mg/mL溴酚藍（bromophenol blue，BPB）加入1 mL MP分散液（5 mg/mL）中，室溫避光靜置20 min，然后4 000×g離心15 min。取上清液稀釋10 倍，在595 nm波長處測定上清液的吸光度。使用pH 7.4、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液作為空白對照。表面疏水性用BPB結合量表示，按

式（2）計算。

（2）

式中：A1為對照組離心后上清液的吸光度；A2為樣品離心后上清液的吸光度。

1.3.6 乳化性測定

參考馬婕等[18]的方法并稍作修改。取16 mL MP分散液（用20 mmol/L Tris-HCl稀釋至2 mg/mL）和4 mL大豆油加入離心管中，在10 000 r/min下勻漿2 min，然后立即從離心管底部吸取50 μL乳液于5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，混勻后在500 nm波長處測定吸光度（A0）。10 min后從離心管底部另取50 μL乳液并加入5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液，混勻后在500 nm波長處測定吸光度（A10）。以0.1 g/100 mL SDS溶液進行調零。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）按式（2）～（3）計算。

（3）

（4）

式中：n為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數/%。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）與熒光染色參考方芮等[19]的方法并稍作修改。將MP分散液與5×上樣緩沖液按照體積比4∶1混合，沸水浴加熱5 min，冷卻后離心（12 000×g、3 min），取上清液上樣（MP上樣量為8 μg）。電泳電壓為80 V，直至條帶距底部0.5 cm處時結束電泳。電泳結束后，使用固定液（含體積分數50%甲醇、體積分數10%乙酸）固定12 h，結束后用蒸餾水洗膠3 次，每次10 min，用Pro-Q Diamond染液避光染色1.5 h后，避光使用脫色液（含體積分數20%乙腈、50 mmol/L乙酸鈉）脫色1 h，然后避光條件下用蒸餾水洗膠4 次，每次5 min。用近紅外熒光掃描成像儀進行熒光拍照，參數設置為：激發波長532 nm，發射波長580 nm，電壓500 V。

隨后使用Sypro Ruby染液避光染色14 h，避光條件下使用脫色液（含體積分數40%甲醇、體積分數7%冰乙酸）脫色1 h，結束后用蒸餾水洗膠3 次，每次10 min。再次使用近紅外熒光掃描成像儀進行熒光拍照，參數設置為：激發波長532 nm，發射波長610 nm，電壓470 V。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

將磷酸化后的MP分散液冷凍干燥后研磨成粉末，使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～650 cm－1范圍內測試，分辨率為4 cm－1，掃描4 次。使用PeakFit 4.12軟件計算蛋白質二級結構相對含量。

1.3.9 TG分析

將冷凍干燥后的MP放入樣品盤中，升溫速率為10 ℃/min，升溫范圍30～600 ℃，氮氣作為冷卻氣體，流速50 mL/min。使用TG分析儀對樣品進行TG分析。

1.3.10 AFM觀察

參考Mills等[20]的方法并稍作修改。吸取5 μL MP分散液（1 mg/mL）滴在云母片上，室溫靜置2 min后用超純水沖洗2 次以去除鹽離子，然后用洗耳球吹干云母片表面水分。使用ScanAsyst-Air智能模式成像，掃描面積為2.0 μm×2.0 μm。使用Nanoscope Analysis V1.10軟件分析AFM圖像。

1.4 數據處理

所有實驗均至少重復3 次，數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，當P＜0.05時，差異顯著，當P＞0.05時，差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 MP的溶解度和pH值分析

如圖1所示，1 g/100 mL NaCl組具有最低的溶解度（7.81%），磷酸化改性均能不同程度提高蛋白質的溶解性。隨著磷酸化水平的增加，STPP處理組的溶解度顯著提升，并且0.2～0.5 g/100 mL STPP處理組的溶解度均顯著高于添加2 g/100 mL NaCl組（35.86%）和3 g/100 mL NaCl組（62.81%），0.4 g/100 mL STPP組具有最高的MP溶解度（87.14%）。

經過TSPP和STPP磷酸化后的蛋白質溶液pH值向堿性偏移，分別為8.14～8.77和7.89～8.40，而SHMP磷酸化后的pH值則向酸性偏移（7.53～6.66），這也導致磷酸鹽修飾MP后的溶解度差異[21]。值得注意的是，TSPP和STPP組的pH值較為接近，但溶解度卻有顯著差異，這可能與磷酸鹽的分子結構有關[22]。雖然SHMP修飾的蛋白質溶液pH值呈弱酸性，但在0.5 g/100 mL SHMP處理組與TSPP處理組溶解度無顯著差異（P＞0.05），分別為64.34%和64.07%。隨著MP磷酸化水平的增加，部分磷酸基團附著在蛋白質側鏈上，與水分子形成大量氫鍵；同時磷酸基團增強了蛋白質之間的靜電斥力，從而促進蛋白質在溶液中分散[23]。結果表明，0.2～0.5 g/100 mL STPP修飾的MP溶解度優于TSPP和SHMP處理組。

小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 MP的表面疏水性分析

如圖2所示，1、2、3 g/100 mL NaCl組MP的BPB結合量分別為32.43、35.28、39.13 μg，MP的表面疏水性隨著NaCl添加量的增加而增加[24]，并且3 種磷酸鹽均不同程度增強了MP的表面疏水性。隨著磷酸化水平的增加，TSPP組的MP表面疏水性逐漸降低，而STPP和SHMP組的表面疏水性呈現增加趨勢，且0.4～0.5 g/100 mL STPP更有利于疏水基團的暴露[25]。

當磷酸鹽添加量大于0.3 g/100 mL時，STPP組的表面疏水性顯著高于TSPP和SHMP組（P＜0.05），且當添加0.5 g/100 mL STPP時，MP的表面疏水性達到最大，為52.73 μg。結果表明，高添加量的STPP更容易引起蛋白質構象變化，使蛋白質分子內部的疏水基團暴露于親水環境中，從而提高MP的表面疏水性[26]。

2.3 MP的乳化性分析

如圖3所示，與未磷酸化處理的MP相比，磷酸化MP的EAI和ESI普遍呈現出隨著磷酸鹽添加量增加而逐漸增加的趨勢，TSPP、STPP和SHMP組的EAI均在0.5 g/100 mL添加量下達到最大值，分別為47.09、53.09、43.13 m2/g，表明磷酸化水平較高的MP能夠更快地吸附到油滴表面。

磷酸化MP具有比1 g/100 mL NaCl組更高的ESI，表明磷酸化MP溶解度的提升對乳液的穩定性起重要作用。這是因為隨著MP磷酸化水平的升高，MP攜帶更多的負電荷，靜電斥力增加，促進乳化過程中的蛋白質在油-水界面上的重新排列和擴散，從而有助于MP乳化性能的提升[27]。此外，蛋白質的表面疏水性對乳化性起到重要作用，磷酸化MP具有較高的表面疏水性，可以達到更好的親水親油平衡，從而促進MP乳化性能的提升[28]。

2.4 MP的SDS-PAGE與磷酸化程度分析

使用Pro-Q Diamond染料染色后，MP中磷酸化蛋白條帶如圖4A所示，可以清晰觀察到4 個蛋白質條帶，包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，220 kDa）、肌動蛋白（actin，AC，43 kDa）、原肌球蛋白（tropomyosin，TM，35 kDa）和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC，20～25 kDa）。如圖4B所示，使用SYPRO Ruby染料染色后可以清晰地觀察到MP全蛋白條帶。計算磷蛋白條帶的光密度值（P）與總蛋白條帶的光密度值（T），該條帶的光密度值比（P/T）可以表示蛋白質的磷酸化水平[29]。

采用MP所有條帶P/T之和表示MP的總體磷酸化水平。如表2所示，在STPP和SHMP處理組中，蛋白質整體磷酸化水平呈現先上升后下降的趨勢。所有處理組的總體磷酸化水平均在0.4 g/100 mL添加量下達到最大，TSPP、STPP和SHMP處理組分別為2.46±0.02、3.29±0.03和3.27±0.04。這些結果表明，隨著磷酸鹽添加量的增加，MP中引入了更多帶負電的磷酸基團。STPP和SHMP對MP的磷酸化程度影響較大，這可能是因為磷酸鹽的添加使得磷酸基團與MP特定反應位點的碰撞增加，從而增加MP的磷酸化水平，尚坤等[30]研究多聚磷酸鹽磷酸化蝦蛄MP的最佳工藝條件中也得到了類似的結果。

2.5 MP的傅里葉變換紅外光譜分析

如圖5所示，與1 g/100 mL NaCl組對比，磷酸化MP中出現磷酸基團的特征吸收峰，例如，TSPP組在899 cm－1處的峰，STPP組在890、967 cm－1處的峰和SHMP在877 cm－1處的峰，這些峰被認為歸屬于P—O伸縮振動[31]；TSPP組在1 122 cm－1處的峰，STPP組在1 123、1 224 cm－1處的峰和SHMP組在1 260 cm－1處的峰被認為是由于P＝O伸縮振動[32]。Hu Yangyang等[33]研究表明，—OH和—NH2在中性或堿性條件下表現出較高的活性，由此推斷磷酸化MP可能形成C—N—P鍵或C—O—P鍵。

由表3～5可知，與1 g/100 mL NaCl組相比，磷酸化改性MP的β-折疊相對含量均顯著增加（P＜0.05），TSPP和STPP組α-螺旋相對含量顯著下降（P＜0.05），尤其是STPP組。隨著磷酸鹽添加量的增加，STPP組的無規卷曲和β-轉角相對含量呈現上升趨勢。而TSPP和SHMP組的β-折疊和α-螺旋相對含量變化幅度相近，這也可能是其在0.5 g/100 mL添加量下2 種磷酸化MP溶解度、表面疏水性和乳化性相似的原因。因此，3 種磷酸鹽通過磷酸化修飾MP改變了MP的二級結構，從而導致MP的溶解度、表面疏水性和乳化性改變[34]。

2.6 MP的TG分析

如圖6A～C所示，TSPP和SHMP組的TG曲線與1 g/100 mL NaCl組MP相似，0.1 g/100 mL STPP組的MP在350～600 ℃表現出和1 g/100 mL NaCl組類似的降解曲線，但隨著STPP組磷酸化水平的增加，0.2～0.5 g/100 mL STPP組的MP熱解速率降低。

如圖6D～F所示，在30～600 ℃內，微商熱重（derivative thermogravimetric，DTG）曲線的吸熱峰是蛋白質降解的結果。1 g/100 mL NaCl組的熔融峰溫度為328.77 ℃，STPP組的熔融峰溫度呈現先降低后升高的趨勢，最低為317.9 ℃（0.3 g/100 mL STPP組），最高為335.6 ℃（0.1 g/100 mL STPP組），而TSPP和SHMP組的熔融峰溫度均高于1 g/100 mL NaCl組，最高為333.81、333.77 ℃，對應于TG曲線中的第2次質量損失過程。磷酸化MP與1 g/100 mL NaCl組的熔融峰溫度無顯著差異。總體而言，STPP磷酸化對MP的熱降解行為有明顯影響，意味著磷酸化修飾可提高MP的熱穩定性[35]。

2.7 MP的微觀結構

如圖7所示，在TSPP和STPP處理組中觀察到MP的長絲狀結構，同時3 種磷酸鹽處理的MP均具有較大且不均勻的球狀結構，值得注意的是，SHMP處理組并未發現明顯的MP絲狀結構。Li Liyuan等[36]研究發現，在pH 7.0時，MP呈現纖維狀，pH＞7.0時，MP則呈球形，與本研究結果類似。由表7、8可知，TSPP組的MP直徑和高度隨著磷酸化程度的增加而增大，最大分別為74.91、14.38 nm（0.5 g/100 mL TSPP組）。

與1 g/100 mL NaCl組相比，STPP處理組觀察到邊緣不規則的大顆粒MP，說明STPP導致MP出現聚集現象。與TSPP組類似，隨著STPP添加量的增加，MP直徑呈現變大的趨勢，最大為69.41 nm（0.5 g/100 mL STPP組），這可能是因為TSPP組和STPP組的pH值范圍較為接近，導致MP微觀形貌的變化較為接近[37]。

由表6、7可知，TSPP組的MP直徑為55.03～74.91 nm，高度為10.33～14.38 nm，高于STPP組（直徑為55.42～69.41 nm，高度為7.30～10.24 nm）和SHMP組（直徑為55.51～62.25 nm，高度為5.18～6.79 nm）。與1 g/100 mL NaCl組類似，SHMP組的MP呈現橢圓形。SHMP磷酸化導致MP的展開，可能是因為SHMP組的pH值為7.53～6.66，導致MP顆粒的直徑和高度減小。

3 結 論

研究3 種磷酸鹽及其添加量對白鰱魚MP磷酸化的影響，旨在為降低肉制品中NaCl用量的同時調控食品品質提供理論基礎。電泳結果表明，3 種磷酸鹽均能夠提高MP磷酸化水平，且0.4 g/100 mL STPP組的總體磷酸化水平最高。與1 g/100 mL NaCl組相比，3 種磷酸鹽均能夠提高MP溶解度、表面疏水性、EAI和ESI，且0.4 g/100 mL STPP組具有最高的溶解度和表面疏水性，且0.2～0.5 g/100 mL STPP組的熱解速率下降，增強了MP的熱穩定性，有利于MP在低鹽條件下的加工利用。通過傅里葉變換紅外光譜觀察到，3 種磷酸鹽均能夠改變MP結構，磷酸根基團成功引入到MP，發生磷酸化反應，并且磷酸化MP的二級結構中β-折疊相對含量增加。TSPP和STPP磷酸化對MP微觀結構的影響類似，均使MP的直徑和高度增加，而SHMP磷酸化處理使MP展開更加分散。

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