共焦顯微鏡技術及其應用

摘要：共焦顯微測量是一種很有前景的技術，具有非接觸測量和高精度位移識別能力，廣泛應用在芯片加工、高精密儀器制造、生物醫學、材料化學、工業檢測等領域。其沿軸向位置高精度掃描的二維圖像可用于三維重建，然而，掃描的速度限制了圖像的采集速率，為了克服這一局限性，研究人員提出了許多方法對傳統的共聚焦顯微鏡系統進行了改進。例如，基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡、基于數字微鏡裝置的共焦顯微鏡、差分式掃描共焦顯微鏡等。本文主要討論了各種共聚焦顯微鏡的工作原理、物鏡類型、掃描方法、優缺點及應用。隨著光學核心部件的升級和各種準確、高效算法的出現，未來共焦顯微鏡的掃描速度會更快、應用范圍更廣、分辨率更高。

關鍵詞：共焦顯微；三維成像；位移識別；掃描速度

中圖分類號：TH 742 " "文獻標志碼：A

Confocal microscope technology and application

MAO Xiaoxiao，ZHAO Bin，DONG Xiangmei，GAO Xiumin

（School of Optical-electrical and Computer Engineering， University of Shanghai for

Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： Confocal micro-measurement is a promising technology with non-contact measurementand high-precision displacement recognition capabilities， which is widely used in chip processing，high-precision instrument manufacturing， biomedicine， material chemistry， industrial testing andother fields. The two-dimensional images scanned with high accuracy along the axial position canbe used for three-dimensional reconstruction. However， the scanning speed limits the rate of imageacquisition. In order to overcome this limitation， researchers have proposed many methods toimprove the conventional confocal microscope system. For example， it mainly includes scanningconfocal microscope based on scanning galvanometer beam， confocal microscope based on digitalmicro-mirror device， differential scanning confocal microscope， etc. Here， this paper mainlydiscusses the working principle， types of objective lens， scanning methods， advantages anddisadvantages， and applications of various confocal microscopes. We believe that with theupgrading of the core components of the optical system and the emergence of various accurate andefficient peak algorithms， the scanning speed of the confocal microscope will be faster; the rangewill be wider and the resolution will be higher in the future.

Keywords： confocal microscopy；3D imaging；displacement identification；scanning speed

引 言

隨著科學技術、半導體加工、精密制造技術的快速發展，物體表面形貌測量變得越來越重要，表面三維細節的可視化有助于研究人員對物體表面質量進行準確評估，發現新的功能材料，提高器件性能^[1]。由于顯微鏡具有較高的分辨率，且能實現與物體非接觸測量，避免測量時因接觸帶來的損傷和誤差，它被廣泛應用于各種精密的3D測量領域。比如，近場掃描光學顯微鏡^[2]、掃描隧道顯微鏡^[3]、原子力顯微鏡^[4]以及普通光學顯微鏡都可以進行3D表面的高精度測量。但是這些方法之間仍存在許多的問題，它們對環境要求高，實現過程復雜，分辨率以及測量精度較低，在表面輪廓測量領域的應用受到極大的限制。

近年來，由于其獨特的軸向響應能力，特別是在各種高精度的顯微成像應用中，共焦顯微鏡被廣泛用于表征非常小的3D結構并測量表面輪廓^[5-7]，采用共軛技術對物體進行掃描成像，已經成為一種熱門的檢測方法。共焦顯微鏡主要分為激光共聚焦和彩色共聚焦等，激光共聚焦顯微鏡（laser confocal microscope，LCM）測量三維表面形貌時，需要對每個點進行精確的深度掃描，這嚴重降低了測量效率。然而，彩色共聚焦顯微鏡（chromatic confocal microscope，CCM）具有獨特的高分辨率和軸向響應能力，不需要軸向逐點掃描，且對環境要求低、檢測精度能夠達到微米級，克服了LCM的缺陷，被廣泛應用在物體表面的形貌測量和檢測上。

1955年，Marvin"^[8]制造出了第一臺共聚焦顯微鏡。1984年，Molesini等^[9]基于波長位移編碼原理，使用一組專門設計的色差透鏡構建了表面輪廓儀，這是基于激光共焦的另一種新的形貌測量方法^[10]。之后，彩色共焦技術不斷地被研究人員更新及擴展應用。Chun等^[11]提出了一種基于光束橫向掃描的彩色共焦顯微鏡，無需縱向機械移動就可以測量三維表面；Reyes等^[12]提出了一種彩色共焦方法來測量膜的折射率和厚度；Chen等^[13]提出了一種利用新型雙縫彩色共焦顯微鏡的寬帶差分共焦法進行單次顯微3D表面測量。共焦顯微鏡與傳統光學顯微鏡的區別在于共焦顯微鏡能夠克服軸向雜散光的影響，提高了圖像的分辨率。此外，彩色共焦顯微鏡具有層析能力，可以進行三維層析成像，成功擺脫了電子顯微鏡僅在活體樣本中觀察的局限性，已經成為細胞、組織檢查等生物領域的必備儀器^[14]。

本文重點介紹了用于三維表面計量的共焦顯微鏡。闡述了其基本工作原理、優缺點、色散物鏡、光源、共焦針孔、成像方法和重建算法。此外，總結了共聚焦顯微鏡在透明材料、工業集成、生物醫學等方面的應用^[15]。

1 " "共焦顯微鏡

1.1 " "激光共焦顯微鏡

激光共焦顯微鏡是一種高精度非接觸的測量方法，廣泛地應用于顯微成像中。激光共焦顯微鏡是在普通顯微鏡的基礎上引入了“共焦技術”和“激光掃描技術”^[16]。如圖1所示，以激光束為光源，由激光束發射的激光通過照明針孔和準直透鏡形成平行光，然后從分光鏡反射到物鏡并聚焦在樣品上，并在焦平面中對樣品進行逐點X-Y軸掃描，在探測器處獲得二維圖像^[17-18]。由于光路中探測針孔和照明針孔存在共軛關系，只有聚焦在焦平面上的點才可以在探測針孔處成像，因此焦平面外的點不會對成像造成干擾。通過調整聚焦平面在Z軸上的位置，可以在不同位置連續掃描多個二維圖像來獲得一系列光學切片圖像。

1.2 " "彩色共焦顯微鏡

彩色共焦系統采用復色光源，探測器通過接收不同波長的光信號還原出被測表面的三維形貌。如圖2所示，由于色散物鏡的色散作用，進入系統的復色光通過色散物鏡后會聚焦在不同的軸向位置，當光從物體表面原路反射回去時，只有聚焦在焦平面上的光才可以進入探測器，其余的雜散光則被針孔遮擋。探測器輸出的信息即為焦平面處的樣品表面信息，通過不斷改變焦平面位置，可以獲取樣品不同深度的表面信息，即樣品的高度信息。通常，將共焦反射顯微鏡放置在焦平面處，通過驅動三維位移控制器改變物體位置，利用CCD采集一系列不同深度二維圖像，最后將所掃描物體獲得的圖像進行三維重建，恢復樣本的3D形貌。

2 " "共焦顯微系統組成

2.1 " "色散物鏡

色散物鏡是共焦系統中的核心部件，其設計方式主要包括折射式和衍射式。折射式色散物鏡因其光學系統的設計比較成熟，加工簡單，價格經濟合理，便于色散等特點，在早期被廣泛應用^[19]。Olsovsky等^[20]基于色散傳遞原理，利用非球面透鏡設計的物鏡在590～775 nm的波長范圍內實現了157 μm的色散和3 μm的軸向分辨率；王安蘇等^[21]在可見光波段450～700 nm范圍內設計的色散物鏡的軸向色差為120 μm；劉乾等^[22]、王津楠等^[23]采用雙分離的消色差場鏡和非球面透鏡組合的設計使整個系統的測量范圍達到了1.7 mm，平均測量精度可達1.8 μm。梁青等^[24]基于透鏡分離結構組合的方式，設計的色散物鏡的系統軸向測量范圍為1 mm，理論分辨率為5 nm。馬敬等^[25]使用單透鏡結合雙膠合透鏡的設計實現了系統測量精度的提高。如圖3（a）、（b）所示為折射式色散物鏡類型。

衍射光學元件帶來的色散特性和傳統折射光學器件的色散特性相反，色散效果也更加明顯^[26]，因此，為了提高系統的靈敏度、分辨率和線性度，改善成像質量，許多研究者將折射和衍射透鏡組合的方式引入到色散物鏡的設計中如圖3（c）所示。Dobson等^[27]通過40倍顯微物鏡和60倍衍射光學元件的組合，使系統的軸向色散范圍高達55 μm，半峰全寬（full width at half maxima， FWHM）為2.5 μm。

此外，菲涅爾透鏡能夠獲得更優秀的線性度，有利于提高衍射效率和橫向空間分辨率^[28]。Liu等^[29]加工了直徑為11.27 mm、焦距為50 mm的菲涅爾波帶片（Fresnel zone plate，FZP），軸向測量范圍超過16 mm，軸向分辨率達到0.8 μm。波帶片相比于透鏡更加輕便，具有可折疊的優勢，在共焦顯微鏡的小型化上深受人們的關注，如圖3（d）所示，由于FZP存在衍射級次，色差很難克服，在寬波段范圍內成像方面仍需要進一步的探索。

折射型色散物鏡因其優勢被廣泛應用在共焦系統中。但是，其色散性能不穩定、非線性色散等缺點容易對系統造成很大的影響，因此，設計折射式物鏡時需要選用多種玻璃組合來改善其線性度。在利用衍射元件設計色散物鏡時，許多研究人員將傳統多片折射式鏡頭系統簡化為單片衍射鏡頭，可以克服數值孔徑小，加工困難等方面的難題^[30]。

2.2"光源

色散是寬帶光學系統中非常普遍的現象，彩色共焦技術是通過反射光譜的聚焦波長來解碼樣品表面的軸向位移，當白光光源（LED）通過光闌后會有一部分能量損失，這將會影響光譜信號的信噪比，通過增大孔徑的方式會影響到系統的分辨力^[31]。Gharbi等^[32]和Minoni等^[33]采用超連續光譜光源，實現了量程的擴展，但超連續光譜光源價格昂貴，成本較高。Matsukuma等"^[34]提出了一種采用鎖模飛秒激光光源的雙探測器差分色差共焦探針生成了超連續譜光源，它的測量范圍達到了200 μm，對高度為1.8 μm的臺階樣品進行三維表面輪廓測量，存在約8%的偏差。

由于光源和樣品表面的色散特性對反射光譜有很大的影響，導致在許多位移測量中焦點波長發生偏移，利用穩定光源可有效提高彩色共焦測量系統的精度，還利于擴展量程，提高軸向分辨和采樣速度。

2.3"共焦針孔

共焦顯微鏡的照明針孔和探測針孔具有共軛關系，共焦點即為被探測點。來自物鏡焦點的信號只能通過共軛針孔檢測，該針孔在聚焦光通過的同時還抑制了雜散光的干擾，實現了三維空間濾波的目的。因此，可以實現高空間分辨率的光學切片^[35]。共焦針孔的直徑嚴重影響成像的亮度和分辨率，如果針孔尺寸增加過大，系統橫向分辨率將與傳統光學顯微鏡相同，系統的軸向精度降低；針孔尺寸過小會影響光的通過，導致光強度損失，使光探測器接收不到足夠多的能量信號，從而降低測量精度。因此，共焦針孔的大小需要綜合考慮信噪比和光通量。

此外，在不同樣本的共焦成像光路系統中，使用可調節的光圈是不夠的，不僅需要克服不同孔徑針孔尺寸的大小，同時還需保持探測光路的對準。為了實現針孔的快速、準確以及可重復定位，開發了眾多改變針孔尺寸的系統，例如圓形針孔電動線性陣列，通過機動方形或六邊形光圈來改變針孔尺寸^[36]。

3"共焦成像掃描方法

一般來說，要在共焦顯微鏡中重建3D圖像，需要快速掃描樣品獲取一系列連續2D圖像^[37-38]。有多種掃描的方法可以提高共焦顯微鏡的掃描速率，包括基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡、旋轉Nipkow圓盤掃描共焦顯微鏡、基于微透鏡陣列的共焦顯微鏡、基于數字微鏡裝置的共焦顯微鏡、差分式掃描共焦顯微鏡、基于掃描源的彩色共焦顯微鏡。此節介紹了各種掃描方法的工作原理和優缺點。

3.1"基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡

基于掃描振鏡光束掃描型共焦系統使用激光作為點光源，同時在光路中安裝兩個可控制其轉動角度的轉向振鏡，分別用于控制光束對樣品進行X和Y方向的逐點掃描來獲取不同深度的二維圖像，最終實現三維重建，如圖4（a）所示。系統中避免了機械移動，提高了掃描速率，且橫向分辨率是普通顯微鏡的2倍。

但是基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡采用的逐點掃描方式，仍然嚴重降低了測量效率。除此之外，基于掃描振鏡光束掃描型共焦顯微鏡的軸向層析的能力和針孔掩模都減少了散射，較大程度地提高了成像深度，同時，大部分雜散光被抑制。探測器接收到的反射信號非常微弱，因此需要使用靈敏度高的光電倍增管。

3.2nbsp;旋轉 Nipkow 圓盤掃描共焦

彩色共焦技術在表面形貌測量領域備受關注，然而，現有的彩色共焦技術多為單點測量，一定程度上限制了測量效率，為了提高彩色共焦的檢測速度，國外很多學者對共焦系統進行了改良。1884年，德國科學家Nipkow等提出了Nipkow轉盤法。1960年， Hadravsky和Petran等^[44]學者將Nipkow盤取代單個針孔的方式將其應用在了共焦顯微鏡中，提高了檢測速度。

利用旋轉Nipkow圓盤的掃描共焦是基于多光束掃描的方法，可以實時成像，具體原理如圖4（b）所示。光源發出的光穿過被測物體聚焦的共軛平面上的針孔，形成許多點光源照射在樣品表面。最后，反射光在通過分束器之后在CCD上成像，這樣就實現了多點同時成像。同時，配合Nipkow圓盤的高速旋轉以實現快速的二維成像。

旋轉圓盤共焦顯微鏡由區域檢測器獲取2D圖像，能夠形成真實的共焦圖像，進行實時觀察光學切片圖像，數據處理更容易。然而，轉盤旋轉圓盤對針孔的尺寸和位置要求十分嚴格，不能改變系統的分辨率，并且系統比較復雜、昂貴。

3.3"基于微透鏡陣列的共焦顯微鏡

基于微透鏡陣列的顯微成像能夠降低光路中雜散光的影響，提高了三維圖像重構的分辨率，與Nipkow盤相比，基于微透鏡陣列的共焦顯微鏡提高了系統的光能利用率、擴大了視場。2015年，Hillenbrand等^[45]提出了基于針孔陣列的彩色共焦傳感器，通過照明針孔陣列將復色光源換成點光源陣列，用于快速獲取被測物表面高度信息。Tiziani 等^[46]利用微透鏡陣列實現多點測量，進一步提高了測量的效率。基于微透鏡陣列的共焦系統如圖4（c），將針孔陣列放置在分束鏡前，當光源穿過針孔時，形成的光源陣列就可以照明在物體表面，通過使用區域相機CCD來捕捉物體表面反射的針孔圖案。因此，確定相應針孔位置的高度，根據獲得的二維針孔陣列信息可以重建3D表面。

由于存在相鄰針孔的串擾，隨著針孔間距的減小，信噪比和深度分辨率降低，針孔陣列的間距還限制了3D成像的橫向分辨率，降低了系統的信噪比。

3.4" 基于數字微鏡裝置的共焦顯微鏡

數字微鏡裝置（digital micromirror device，DMD）是由一定尺寸的微反射鏡組成的陣列，可以覆蓋具有數百萬個單獨控制像素的2D區域，改善傳統單點彩色共焦技術的低掃描效率問題。其中DMD上由各鏡像原件組成以控制反射角度，將DMD用作光束調制器件，可以獲得可編程針孔陣列，替代反射式共焦系統中的分束鏡，經過光束整型后的平行光通過DMD反射到色散透鏡，最后利用CCD采集圖像信息，原理如圖4（d）所示。Chen等^[47]將DMD技術集成到CCM系統中，以消除垂直和橫向機械掃描結構的必要性。與微透鏡陣列所形成的點光源陣列相比，基于DMD的點陣列光源具有良好的可調制性，能適應不同要求的測量對象。

DMD可以調整采樣點，控制掃描速率。但是，DMD不會對分束后的光產生聚焦作用，進行共焦測量時的縱、橫向分辨率都會比使用微透鏡陣列時下降。

3.5"差分式掃描共焦顯微鏡

20世紀90年代，國外的共焦激光掃描顯微鏡就已經做得相當成熟^[48]，韓國的Ishihara等^[49]提出了一種平行共焦光路，它可以根據實際需要改變微透鏡陣列在光路中的位置，并利用微透鏡的位置生成二維點光源陣列。如圖4（e）所示，從物體表面反射的光束被一分為二，分別聚焦到放置在焦前和焦后的兩個探測器上，對接收的軸向強度響應曲線進行差分計算來獲取變化信息。

在差分共聚焦顯微鏡（differential scanning confocal microscope，DSCM）中通過檢測光學焦點來改進共聚焦顯微鏡的信噪比和軸向分辨率，抑制了常見的噪聲，軸向分辨率得到雙倍提高^[50]，并且不需要橫向掃描，能夠實現樣品表面輪廓的高速測量。

3.6"基于掃描源的彩色共焦顯微鏡

為了提高三維表面輪廓的成像速度，Jeong等"^[43]提出了基于掃描源的彩色共聚焦顯微鏡（swept-source-based chromatic confocal microscopy，SS-CCM）的新概念，并研究了相應成像系統的有效性，如圖4（f）所示。SS-CCM采用波長掃描激光器連續、重復地產生與寬帶光源等效波長的光，所產生的光經過色散物鏡，聚焦在被測物體上，由光電探測器來接收物體表面的發射光。由此可見，系統不再使用光譜儀來接收反射光，因為基本過程與波長無關，而是與時間相關，光電探測器可以根據時間尺度反復獲得反射光的光譜信息，最終通過解碼光譜信息來獲得物體表面信息。

與常規CCM相比，SS-CCM可以提高三維輪廓的檢測速率。系統中使用單個光電探測器從色散透鏡陣列中獲得光譜編碼深度，能夠顯示出更靈敏的響應^[43]。

4 " "三維重建及應用

4.1 " "三維重建

在傳統共焦顯微鏡中，可以計算軸向響應的峰值強度來確定物體的軸向位置^[51]，通過建立波長與被測物體表面的軸向位移之間的關系，可以從接收到的波長信息獲得被測物體表面的高度信息，即三維成像。因此，準確和高效的峰值提取算法在共焦成像中至關重要。常用的標準峰值波長提取包括最大值搜索、質心算法和高斯擬合算法。但是，傳統的算法會導致較大的系統峰值提取誤差。因此，為提高計算的效率和準確性，研究人員提出了多種改進方法。

在CCM中，將彩色相機替代光電探測器作為系統接收端，可以得到整個物體表面的圖像，彩色共焦掃描成像系統的特性是光學層析，首先通過記錄一系列不同深度的截面圖像，再利用這些截面圖像來重構厚物體的完整圖像。根據光波編碼原理，通過聚焦點的顏色來校準軸向高度。聚焦點的顏色在不同的高度是不同的，因此可以使用不同的顏色RGB值來研究表面高度和波長之間的關系。然而，圖像RGB與波長之間存在非線性關系，因此需要將RGB顏色模型轉換為其他合適的顏色模型，并通過算法實現與波長的對應關系^[52]。

未來，在共焦顯微鏡的三維重建方面仍需付出巨大努力來降低數據處理的復雜性，提高成像效果，光學信號的調制領域也有很多的方法可能能夠進一步加快共聚焦顯微鏡領域的信號傳輸和分析^[53]。

4.2透明材料檢測

CCM不僅可以用于三維成像，其具有的層析能力還可以對光學透明、半透明或弱散射材料進行斷層深度剖面、多層成像和缺陷檢查^[54-55]及厚度測量，檢測層間界面處反射光后能夠提供準確的薄膜厚度信息，而且不會造成任何樣品的損壞。測量系統能夠有效地克服漫反射表面的局限，廣泛應用于微尺寸測量包括玻璃、陶瓷等材質在內的高精度表面深度位移測量中。

隨著第四次工業革命的到來，半導體和顯示行業對厚度測量的需求穩步增加，為了確認襯底和薄膜的各種層的物理厚度^[56]，應準確且快速地測量厚度，以保持高生產率，如圖5（a）所示為薄膜形貌測量。此外，在觸摸界面電子設備等應用中，需要在薄膜上涂一層硬涂層以提高表面硬度，涂層的精確測量為未來的電子皮膚提供了前景^[57]。Cox 等^[58]提出了共焦厚度測量法來測量光盤上的薄透明涂層；Wang等^[59]使用新型差分共焦系統測量透鏡厚度，提高了測量精度；Kuo等^[60]開發了雙光束共焦顯微鏡，測量了透明材料的折射率和厚度。

在透明材料檢測過程中，CCM測量系統會由于被測物體的透明介質（如玻璃、塑料）的分散在檢測過程中出現信號混疊，串擾等情況，降低測量系統的信噪比，導致無法準確獲得不同層表面的光譜信息，使實驗結果產生誤差。Yu等^[61]通過傾斜照明彩色共焦顯微鏡測量透明試樣厚度，如圖5（b）所示，提高了系統的信噪比，但是樣品厚度在不同的軸向位置測量結果不一致。因此，在使用CCM對透明樣品厚度進行測量時，需要對材料色散的誤差進行理論分析，建立誤差評估的關系以及如何對產生的誤差進行補償，這些對提高CCM對透明材料的測量精度都是十分必要的。如圖5（c）所示，使用CCM對厚度為0.17 mm的玻璃板進行檢測，當玻璃板上下兩個表面位于測量的范圍內時，只有聚焦在被測物體上下兩個表面上波長為λ₁、λ₂的光會原路返回，光譜儀顯示兩個光譜峰值。最后，根據波長信息與位移的關系，分別得到兩個光譜峰值對應的位移，位移之間的差值即玻璃板厚度信息。實驗所測得的厚度信息包含由于待測透明物對不同波長的光有不同的折射率，聚焦距離與對應的波峰關系發生偏差，因此，需要建立玻璃板的厚度補償模型對測量結果進行補償，提高實驗的準確度，最終，玻璃板的測量誤差在2 μm。

玻璃基板的厚度均勻性、翹曲度及表面波紋度等參數可以衡量其平整度^[62]，采用彩色共焦顯微鏡，能夠在透明試樣的制作過程中對其表面信息進行實時監測，提高生產的效率和質量。

4.3"工業集成檢測

在機械加工、薄膜制備、光學加工等精密領域中，表面粗糙度是描述表面微觀輪廓的基本特點，是評價產品表面質量最常用的參數之一^[63]。工業上最常用的光學無損測量，需要采用位移傳感器對變化信息進行精密測量和標定。相比于傳統的共焦顯微方法，彩色共焦法對被測物體表面的紋理、傾斜、顏色等外界因素不敏感，具有良好的抗干擾性，精度高，易于集成的優勢也在非接觸式在機測量研究中得到了廣泛關注，適合用于要求高檢測效率和在線測量的工業現場，如圖6所示。微加工后的工件表面在線測量成為滿足日益增長的質量要求的關鍵。基于CCM開發的集成在微加工機床上的掃描系統，可以掃描工業級在線集成的基板上滿載的粘結模具的托盤，并且在一個有強烈振動影響的環境中實現了大約2～3 μm的精度，減少了64%的檢測時間^[64]。在超精密車床上集成了彩色共焦位移傳感器后，可以實現加工—測量一體化的功能，實現了自動測量與數字化加工的協調。

彩色共焦顯微鏡是在機測量中非常重要的組成，可以實現高效率、高精度的在線檢測。

4.4"生物醫學成像

共焦顯微鏡在組織和細胞水平上對癌癥成像具有很大的前景，為皮膚科的診斷和治療提供了有效的方法。熒光反射共焦顯微鏡（fluorescence reflection confocal microscope，FRCM）是一種無創光學成像方法，可以準確分辨組織并檢查皮膚細節。通過大量的臨床研究，熒光反射共焦顯微鏡已被證明能夠以高靈敏度和特異性診斷絕大多數皮膚癌^[66]，這大大超過了臨床評估。例如使用半導體激光器作為發射器和接收器來檢測皮膚癌，實驗結果與數值模擬一致，并且結構變化明顯，能夠可視化癌癥類型的識別^[67]。

熒光反射共焦顯微鏡在組織細胞水平上可做多種功能的測量與分析，能夠實現單色、多色熒光通道實時成像，可用于拍攝高放大率的熒光圖像、利用拼接功能對大組織進行全景掃描、動態觀察生理狀態下細胞內離子PH對細胞代謝等各種指標的影響等^[68]。因此，共焦顯微鏡結合其他相關生物技術，如圖7所示為共焦顯微鏡在生物學中的應用。

4.5 " "其他

共焦顯微鏡的三維成像還應用于許多其他的領域，在日常安全運輸中準確監測變形極其重要。例如，Ma等^[70]使用彩色共焦檢測方法評估金屬厚度，檢測不確定度為0.12，用共焦技術測量了150 ℃高溫范圍內動態壓力下薄膜的彈性膨脹變形。

共焦顯微鏡廣泛應用于生物醫學和工業領域，在化學和材料方面的應用就比較有限。在這些領域，很多學者使用共焦顯微鏡做溫度相關的研究，例如，冷凍乳劑、晶體生長、擴散等，通過使用共焦顯微鏡精確控制溫度平臺，能夠對200 mm冰晶成型化合物鋯的溶液醋酸鹽固化期間傾斜冰晶生長進行原位3D成像獲得的完整信息，而不會產生觀測偽影^[72]，如圖8（b）所示。此外，它還可以結合拉曼成像用于檢測聚合物混合物，例如評估纖維、復合材料（存在納米顆粒的地方）、混合物和乳液等。能夠快速、無損的全面應用于分析銀紋形成、表面界面動力學和不穩定性、相容性、液滴破碎、聚合物混合物混合效率、組分擴散流變學和滑移檢測^[73]，如圖8（c）所示檢測雜交聚合物酶體，能夠幫助研究人員更好地理解聚合物混合物。

共焦顯微鏡可用于研究物體表面粗糙度、透明和半透明物體厚度、生物醫學、工業集成、溫度檢測等領域，表1總結了此處描述的幾種三維共焦顯微鏡測量任務的特點。

5 " "總 結

在過去幾十年里，傳統的共焦測量法仍局限于視野和實時測量上，單一的掃描點降低了共焦鏡頭的掃描速率，大大阻礙了測量速度和精度。但隨著計算機和激光技術的快速發展，相比于其他類型的共焦顯微測量，許多研究人員針對共焦系統中光源選型和提升色散透鏡的分辨能力上進行深入地研究，出現了多點并行的掃描方式，能夠更快地采集物體的二維信息，明顯地提高了三維成像速度。由于彩色共焦法省略了軸向步驟，能夠適應更多復雜環境，快速實現三維表面的測量，同時，改進了峰值提取算法來提高成像的范圍和圖像的分辨率，加快了三維測量的速度和精度，逐漸成為工業檢測、生物醫療、超精密幾何量計量測試等相關領域的不可缺少的角色，相信在未來繼續優化提升共焦顯微鏡系統性能具有重要的工程價值和產業價值。

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