超聲誘發成核提高HepG2 細胞冷凍消融致死率研究

摘要：冷凍消融技術對于治療實體腫瘤具有一定的效果，但普遍存在降溫效果有限、靶向殺傷效率不高等問題。為提高冷凍消融的療效，提出了將超聲誘發成核用于冷凍消融的一種新的輔助手段，研究了2 種降溫速率下不同誘發成核溫度對細胞存活率的影響，觀察并記錄了超聲誘發成核后的胞外冰晶形態、胞內冰晶生成情況及復溫后的細胞損傷情況。結果表明：使用超聲誘發成核輔助冷凍消融可以提高腫瘤細胞的致死率。慢速冷凍輔助成核組的效果最佳，消融更為徹底，HepG2 細胞的存活率低至15.60% ± 2.60%。快速冷凍輔助成核時，需要配合較低的誘發成核溫度才能更好地殺傷細胞。設計開發具有超聲誘發成核功能的冷凍消融器械具有實際意義。

關鍵詞：超聲誘發成核；冷凍消融；細胞活力；冰晶

中圖分類號：R 318.52 文獻標志碼：A

冷凍消融是一種通過凍融過程破壞腫瘤細胞的物理消融方式，與常規手術切除相比，具有微創、疼痛小、出血少等優勢，在實體瘤患者的治療中發揮著越來越重要的作用。迄今為止，冷凍消融已被用于肝癌[1]、乳腺癌[2] 和前列腺癌[3] 等的臨床治療中。然而，冷凍消融普遍存在降溫效果有限、靶向殺傷效率不高等問題，最終會導致腫瘤出現殘留、轉移和復發，治療效果不佳。

為提高冷凍消融的療效，眾多學者開始研究低溫復合治療模式。目前已有研究將抗凍蛋白[4-6]或納米粒子[7-9] 加入冷凍消融過程中，盡管這些聯合應用可以加劇冷凍消融對腫瘤細胞的殺傷，但抗凍蛋白的提取復雜、產量低，而納米粒子的添加不可避免地會帶來細胞毒性、載體的可降解性以及靶向性等問題[10]。因此，尋找一種新的冷凍消融輔助手段迫在眉睫。近年來，超聲波已成為一種新興治療手段，其在癌癥的臨床治療中顯示出獨特的價值和優勢。超聲波在介質中傳播時會引起空化效應、機械效應和熱效應，可誘導細胞凋亡[11-13] 并增加細胞膜的通透性[14-15]。低強度超聲波除了可以直接用于臨床治療外，在藥物生產中也發揮著巨大的作用[16]。使用超聲波可以促進原料結晶，并且顯著影響晶體的粒徑和分布，提高結晶的可重復性。除此之外，超聲波也被應用于食品工業以提高冷凍食品的品質。它可以有效地增強冰核形成，控制冰晶大小與形狀，同時還能改善傳熱傳質以加速冷凍過程[17]。盡管已經發現使用保護劑結合超聲誘發成核可以提高細胞的保存效果[18]，但未添加保護劑下的超聲誘發成核效果還未被研究。

本文提出了一種將超聲誘發成核用于冷凍消融的新方法，為達到提高腫瘤細胞致死率的目的，研究了超聲波輔助冷凍消融對腫瘤細胞即時存活率和再培養存活率的影響。通過低溫顯微系統，觀察并記錄了超聲誘發成核后的胞外冰晶形態、胞內冰晶生成情況以及復溫后的細胞損傷情況，探討了冰晶形態與細胞損傷的微觀結構關系，為未來進一步優化腫瘤冷凍消融提供了新方向。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

肝癌細胞 HepG2（ Procell CL-0103， 武漢普諾賽生命科技有限公司） ， 胎牛血清（ CAPRICORN 公司），DMEM 培養基（ GIBCO 公司） ， 雙抗（ GIBCO 公司） ， 胰蛋白酶（ TBD 公司），PBS 緩沖液（TBD 公司），AO/PI（吖啶橙/碘化丙啶）染色液（ Nexcelom Bioscience，CS2-0106-5 mL）。

T-25 培養瓶（ NEST 耐思） ， 50 mL 離心管（NEST 耐思），15 mL離心管（NEST 耐思），1.2 mL凍存管（ LABSELECT， CV-002-120-EX） ， CCK-8細胞計數試劑盒（日本同仁，CK04）。

1.2 儀器和設備

全自動細胞計數儀（BodBoge），多功能讀板儀（美國BioTek， Synergy H1），手持超聲波發生器（ 愛爾創， UPT3） ， 程序降溫儀（ 英國Planer，Kryo360-1.7），機械超聲波清洗機（科璽世紀，KX-1730QT）。

1.3 細胞培養

HepG2 細胞在補充有體積分數為10% 胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養基中培養，置于37 ℃、體積分數為5% 的CO2 培養箱內。取對數生長期的細胞用于實驗，取細胞時先輕輕吸棄培養瓶里的上清液，向瓶中加入1 mL PBS 緩沖液，輕柔洗滌2 次后吸棄PBS 緩沖液，加入1 mL 胰蛋白酶，培養瓶放入培養箱消化3 min。在光學顯微鏡下見細胞形態已呈圓形，輕拍培養瓶一側，細胞可與壁面完全脫離，添加2 mL 完全培養基終止消化。用1 mL 移液槍吸取培養液，輕柔、均勻地反復吹打培養瓶底壁，確保細胞脫離底壁全部進入溶液中，將細胞溶液以1 100 r/min 的轉速離心4 min 后重懸于培養基中待用。

1.4 細胞冷凍消融

取1.2 mL 凍存管，分別加入500 μL HepG2 細胞懸液，保證每管內的細胞濃度為5×105 個/mL，分為實驗組和對照組。實驗開始前，將對照組和實驗組的凍存管分別夾在程序降溫儀的遞送管上，按設計的凍融程序設定好程序降溫儀，啟動儀器。對照組僅進行冷凍消融，而不進行超聲誘發成核。

細胞冷凍消融程序為： 以10 ℃/min 或50 ℃/min 的降溫速率從20℃ 降溫到超聲誘發成核溫度（?5，?7，?9，?11 ℃），程序降溫儀顯示達到誘發成核溫度并提示可進行誘發成核操作后，將遞送管取出放入超聲波清洗機內，開啟超聲2 s，誘發成核。超聲波頻率40 kHz，功率120 W。超聲誘發成核完成后將遞送管迅速放回程序降溫儀中，以原速率降溫至?20 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的升溫速率將溫度升至20 ℃。

1.5 細胞存活率檢測

采用AO/PI 染色評估凍融后即時的HepG2 細胞活力。用10 μL 移液槍吸取10 μL 凍融結束后的細胞懸液，避光加入10 μL AO/PI 染液，輕輕混勻。吸取10 μL 混合液到一次性計數板，細胞存活率由細胞計數儀直接讀取。采用CCK-8 法評估細胞經過凍融后繼續培養12 ，24，48 h 的細胞活力。將凍融完成后的不同組細胞以1×104 cell/孔接種在96 孔板上，分別于37℃、體積分數為5% 的CO2 培養箱內培養12，24，48 h。培養完成后使用CCK-8 試劑染色，在450 nm 波長下測定每個孔的最終吸光度。

1.6 低溫顯微觀察

低溫顯微實驗之前的細胞準備與1.3 小節描述的相同，裝置示意圖如圖1 所示。首先將樣品坩堝放置于冷熱臺中央，用移液槍吸取4 μL 新鮮制備的HepG2 細胞懸液并滴加到樣品坩堝中，隨后迅速蓋上干凈的蓋玻片，將顯微鏡調節至視野清晰后啟動設定好的凍融程序。誘發成核的實驗操作步驟為：當達到所設定的誘發成核溫度后，打開冷臺頂部圓蓋，使用超聲波發生器尖端輕碰玻片邊緣來誘發溶液中冰晶的形成，整個過程應做到快速且精確，并盡可能保證玻片不被移動。用CCD 相機實時記錄整個降溫和復溫過程，時間間隔為1 s。

低溫顯微鏡的凍融程序為：實驗組細胞分別在10 ℃/min 和50 ℃/min 的降溫速率下，從20 ℃降溫到所需溫度（?5，?7 ，?9，?11 ℃）后誘發成核， 接著以原來的速率降溫至?20 ℃ 并保持1 min，以5 ℃/min升至室溫。對照組細胞也分別以10 ℃/min 和50 ℃/min 的速率降溫至?20 ℃ 并保持1 min，最后以 5 ℃/min 升至室溫。

1.7 數據處理

數據處理采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行，采用單因素方差分析，數據以平均數±標準差的形式表示，Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同降溫速率下超聲誘發成核溫度對細胞存活率的影響

圖2 顯示了不同降溫速率下誘發成核溫度對HepG2 細胞存活率的影響（**代表Plt;0.01）。同各自對照組（未誘發成核，cryo）相比，實驗組的細胞存活率均顯著降低（Plt;0.01），這說明使用超聲誘發成核來輔助冷凍消融的確能提高HepG2 細胞的致死率。當降溫速率為10 ℃/min 時（圖2a），HepG2細胞的存活率最高僅為22.53 %± 5.79%，在?5～?11 ℃ 的溫度范圍內，誘發成核溫度對細胞的存活率不產生顯著影響（Pgt;0.05）。當降溫速率提高到50 ℃/min 時（圖2b），較高成核溫度（ ?5 ℃ 和?7 ℃）的實驗組之間沒有統計學差異，HepG2 細胞的存活率最低為67.19% ± 2.24%，較低成核溫度（?9 ℃ 和?11 ℃）的實驗組之間差異也不顯著，但HepG2 細胞的存活率下降至最低為42.14 %± 2.45%，細胞存活率明顯受到誘發成核溫度的影響。

當超聲波作用于細胞溶液時，可以顯著提高傳熱與傳質系數，有利于快速去除結晶過程所釋放的潛熱，因此可以有效地誘發晶核的形成。當細胞外形成冰晶后，若降溫速率較慢，胞外冰晶將有充足的時間向胞內生長，形成胞內冰晶，從而導致細胞死亡；若降溫速率較快，胞外冰晶則形成較少且來不及生長，冰晶不能及時進入細胞內，無法對細胞造成致命的打擊。在較低的溫度下誘發成核時，由于過冷度較大，生成的晶核臨界尺寸小，溶液內部可以形成更多穩定的晶核，因此會形成更為細密的胞外冰晶。這些胞外冰晶就更有可能進入細胞內，產生較好的殺傷效果。總的來說，超聲波誘發成核對于慢速冷凍組的殺傷效果更為顯著。

2.2 不同降溫速率下超聲誘發成核對細胞培養存活率的影響

冷凍消融不徹底是造成腫瘤復發的重要因素，因此驗證消融后不同時間的細胞存活率顯得尤為重要。CCK-8 法檢測結果顯示，當降溫速率為10 ℃/min（圖3a） 時， 實驗組細胞在培養12，24，48 h 后都保持極低的存活率，與對照組相比均有統計學差異（Plt;0.01）。當降溫速率為50 ℃/min（圖3b）時，超聲誘發成核溫度為?7 ℃ 的實驗組細胞在培養12，24，48 h 后均與對照組沒有顯著差異，誘發成核溫度為?5 ℃ 的實驗組在培養48 h 后也失去了與對照組的差異，而在較低成核溫度下（?9 ℃ 和?11 ℃）的實驗組在每個時間節點與對照組之間均有統計學差異（Plt;0.01）。這是由于快速冷凍組在高成核溫度下形成的胞外冰晶大而疏，且沒有足夠的時間向胞內生長，因此無法產生致命的胞內冰晶損傷。綜上，慢速冷凍組的殺傷效果最佳，而快速冷凍組在較高成核溫度下進行的冷凍消融不徹底，容易造成腫瘤復發。

2.3 不同降溫速率下超聲誘發成核的低溫顯微觀察

2.3.1 降溫速率為10 ℃/min 時HepG2 細胞的低溫響應

當降溫速率為10℃/min 時， HepG2 細胞的低溫顯微圖像如圖4 所示。圖4 中第1 列為開始降溫前細胞的圖像，可見肝癌細胞狀態良好，細胞膜均保持完整。在使用超聲波誘發成核后（圖4（a2、b2、c2、d2）），胞外冰晶的生長速率很快，視野內幾乎一瞬間就布滿冰晶，同時可觀察到部分HepG2 細胞內部變成黑色，說明此時有胞內冰晶的形成。圖4（e2） 為對照組自發成核時生成的冰晶情況，胞外冰晶在?15.8 ℃ 形成，并且在形成后迅速覆蓋了全部細胞，但細胞內沒有馬上出現胞內冰晶，而是在?20 ℃時才出現。從第2 列的胞外冰晶形態可以看出，隨著成核溫度的降低，胞外冰晶分支數目明顯增多，形態變得更加細密。從第3 列可以看出，繼續慢速冷凍至?20 ℃ 并且平衡1 min 后，各組中的胞外冰晶都有了更為明顯的生長，且細胞內全部生成了胞內冰晶。復溫后的實驗組（圖4（a4、b4、c4、d4））較對照組（圖4（e4））中的細胞均表現出明顯的損傷，細胞膜的邊界變得模糊，難以辨認，如圖中紅色箭頭所示。有些細胞在經歷了這樣的冷凍消融后失去了活性，但仍然會有一些HepG2 細胞的細胞膜受損不嚴重，這樣的細胞就可能會存活下來，造成腫瘤的復發和轉移。實驗組中直觀的細胞損傷與細胞實驗中較低的存活率相對應，再次證明超聲誘發成核輔助冷凍消融具有很好的效果。超聲波的使用使細胞膜對于胞內冰晶的成核變得足夠“活躍”，而充分的的胞內冰晶生長導致了更強的細胞損傷。

2.3.2 降溫速率為50 ℃/min 時HepG2 細胞的低溫響應

圖5 顯示了降溫速率為50 ℃/min 時，HepG2細胞的低溫顯微圖像。當降溫速率升高到50 ℃/min后，胞外冰晶的形態呈現出與降溫速率為10 ℃/min時一致的變化規律，均為高成核溫度條件下形成的胞外冰晶大而疏，低成核溫度下形成的胞外冰晶小而密，并且均在形成胞外冰晶后立即觀察到了胞內冰晶的形成。與對照組（圖5（e4））相比，低成核溫度（圖5（c4、d4））下細胞復溫后的膜邊界模糊，且受損嚴重，這樣的現象對應了其在細胞實驗中的低存活率，而較高成核溫度（圖5（a4、b4））下細胞的損傷則沒有那么嚴重。

3 結 論

為提高腫瘤細胞冷凍消融的殺傷效果，本文創新性地引入超聲誘發成核來提高冷凍消融的治療結果，得到如下結論：

a. 超聲誘發成核輔助冷凍消融對細胞有更好的殺傷效果。當降溫速率為10℃/min 時，超聲誘發成核的細胞存活率最低為15.60% ± 2.60%，不同誘發成核溫度間無統計學差異（Pgt;0.05）。當降溫速率為50℃/min 時，需要配合較低的成核溫度才能達到更理想的殺傷效果，細胞存活率最低為42.14% ± 2.45%。

b. 慢速冷凍組的冷凍消融效果最佳，HepG2細胞在培養12， 24， 48 h 后均保持極低的存活率，而快速冷凍組在較高成核溫度下進行的冷凍消融不徹底，容易造成腫瘤復發。

c. 較高成核溫度下形成的胞外冰晶大而疏，較低成核溫度下形成的胞外冰晶小而密。超聲波使細胞膜對于胞內冰晶的成核變得足夠“活躍”。當降溫速率較慢時，胞外冰晶有足夠的時間向細胞內生長，這導致了更強的細胞損傷。當降溫速率較快時，降溫時間較短，冰晶不能及時進入胞內，只有在低成核溫度下形成更細小的胞外冰晶時，才有可能進入細胞內并產生良好的殺傷效果。

d. 設計開發具有超聲誘發成核功能的冷凍消融器械具有實際意義。