和樞消積丸對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及腫瘤組織VEGF、PDGF蛋白的影響*

陳相霖 汪 靜 朱曉寧 張玉蓉 彭昭宣

1.西南醫科大學中西醫結合學院 (四川 瀘州, 646000) 2.西南醫科大學附屬中醫醫院肝膽病科

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是原發性肝癌的主要組織學類型,是全球第七大常見癌癥,也是第三大癌癥相關死因[1]。早期肝癌可通過手術切除、消融或肝移植等進行治療,激酶抑制劑和免疫治療成為中晚期肝癌患者主要選擇。然而肝癌患者五年的相對生存率僅18%[2]。肝癌內含有豐富血管,與新生血管生成密切相關的血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)在肝癌細胞間質中過度表達,是干預肝癌生成和發展的重要因子[3,4]。索拉非尼是被BCLC分期系統推薦用于晚期肝癌治療的一線靶向藥物,能通過抑制VEGF和PDGF在內的酪氨酸激酶受體的活性,來抑制腫瘤內部的新生血管的生成和腫瘤增殖,有效延長中晚期肝癌患者生存時間[5,6]。單一的索拉非尼治療的患者的中位生存時間僅延長10.7月,毒副作用較大且總體預后差[7]。諸多證據證實,草藥中的天然化合物具有多活性成分、多靶點和低毒性等優點,是抑制惡性腫瘤的理想候選者,逐漸被選為全球手術、化療和放療后癌癥患者的補充和替代療法[8]。

研究團隊總結臨床肝癌治療經驗創制的和樞消積丸已獲國家專利并成為院內制劑。前期細胞實驗表明,和樞消積丸可抑制人肝癌細胞增殖、遷移,促進肝癌細胞凋亡[9]。因此,本研究通過構建H22皮下異位肝癌動物模型,觀察和樞消積丸對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用,初步探討其抗肝癌機制, 積極尋找有效抗肝細胞癌的中西結合治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物:雄性BALB/c小鼠,清潔級,鼠齡5～6周,體重18～20 g,來源于成都生物實驗動物有限公司(生產許可:四川SCXK2020-034)。細胞株:小鼠肝癌腹水瘤細胞系H22細胞(中國碧云天公司)。實驗藥物:和樞消積丸由西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科提供,中藥材的煎劑、提取、濃縮由西南醫科大學附屬中醫院制劑科完成,根據人與動物之間表面積的轉換比進行劑量轉換[10]。索拉非尼購自北京索萊寶科技有限公司(生產批號222B024)。主要試劑:HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司(批號G1120),VEGF抗體、PDGF抗體購自美國Abcam公司(批號ab51745、ab23914),β-Actin抗體購自北京索萊寶公司(批號K0218),天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)均購自南京建成生物工程(批號C009-2、C010-2)。

1.2 實驗方法 隨機分組,實驗組30只小鼠均在右腋窩皮下注射200 μl H22細胞懸液(4.5×106個/ml),空白組小鼠5只不做特殊處理。第3天觸及直徑達2～4 mm的瘤體則造模成功。將30只H22荷瘤小鼠隨機分為6組(每組5只):模型組、中藥低劑量組(1.37 g/kg和樞消積丸)、中藥中劑量組(2.73 g/kg和樞消積丸)、中藥高劑量組(5.46 g/kg和樞消積丸)、索拉非尼組(30 mg/kg索拉非尼)、聯合組(30 mg/kg索拉非尼聯合5.46 g/kg和樞消積丸)[11],持續灌胃14 d。實驗期間,每3 d測量1次腫瘤大小,計算腫瘤體積,腫瘤體積=(長度×寬度2)/2。實驗結束剝離瘤體,測量瘤重,計算抑瘤率,抑瘤率=治療后瘤重/模型組瘤重。新鮮瘤組織固定并脫水,通過HE染色觀察腫瘤細胞病理改變。測量小鼠肝功能(AST、ALT水平)。通過免疫組化和Western Blotting法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、PDGF蛋白表達。

2 結果

2.1 H22荷瘤小鼠的生命活動和體重變化 模型組和索拉非尼組小鼠出現明顯食欲不振、運動緩慢、精神狀態低下、腹瀉等癥狀;聯合組小鼠運動敏捷,精神狀態、食欲良好且大便正常。各組小鼠實驗前后體重比及各組間體重比較均差異無統計學意義,見表1。結果表明,和樞消積丸具有提高H22荷瘤小鼠生活質量和改善索拉非尼毒副作用的潛能,且對小鼠體重無明顯影響。

表1 H22荷瘤小鼠體重變化情況

2.2 H22荷瘤小鼠異位瘤體積和瘤重 見表2。結果表明,和樞消積丸具有單獨抑制肝癌生長和增殖的能力,與索拉非尼聯用時效果最佳。

表2 實驗小鼠H22異位瘤體積及瘤重變化情況

2.3 H22荷瘤小鼠肝功能變化 見圖1。結果表明,和樞消積丸具有改善肝功能、減緩肝損傷的功效,與索拉非尼聯用效果優于單用索拉非尼。

與模型組比較,*P<0.01

2.4 H22皮下異位瘤組織學變化 模型組小鼠的腫瘤細胞排列緊密,細胞膜較完整;中藥低、中、高劑量組小鼠的腫瘤細胞均發生不同程度的破裂和壞死,與劑量呈正相關;聯合組小鼠的腫瘤細胞內結構紊亂明顯。各組小鼠病理組織結構紊亂程度與腫瘤增長指數趨勢負相關。見圖2。結果表明,和樞消積丸能破環腫瘤細胞內部結構,具有抑瘤作用,并且能夠提高索拉非尼抑制肝癌細胞增殖和發展的潛力。

圖2 H22荷瘤小鼠瘤組織病理結構改變(HE,200×)

2.5 H22皮下異位瘤的VEGF和PDGF蛋白表達 與模型組比較,各治療組小鼠瘤組織的VEGF和PDGF蛋白表達均下降,差異具有統計學意義(P<0.01)。免疫組化實驗顯示,VEGF和PDGF陽性細胞的數量與和樞消積丸的劑量呈負相關。與單用和樞消積丸或索拉非尼比較,聯合治療時瘤組織VEGF和PDGF表達下降最為明顯(P<0.01),與Western Blotting法檢測結果基本一致。見圖3。結果表明,和樞消積丸具有抑制VEGF和PDGF表達的中藥,能夠協同索拉非尼拮抗肝癌細胞增殖。

與模型組比較,**P<0.01;與索拉非尼組比較,##P<0.01

3 討論

中醫認為肝癌屬于“積聚”“癌毒”等范疇,全國優秀中醫臨床人才、四川省名中醫汪靜教授基于中醫學“兩本三樞”理論和全國名老中醫孫同郊教授“和調”學術思想,認為發病于脾、腎和少陽、少陰兩樞以及脾胃中樞功能失調密切相關。“滋水涵木”“見肝之病,知肝傳脾,當先實脾”,當補脾腎,顧護先后天之本。少陽為陰陽之道路、表里之樞機;少陰為人身性命之樞機,能量儲存之地。脾胃處中焦,脾主升清而胃主降濁,脾升則下焦肝腎二臟之氣升,胃降則上焦心肺之氣降,脾升胃降斡旋一身之氣機,為氣機升降之樞,故“樞機利則百氣轉”。是以基于仲景“小柴胡湯”、張錫純“新擬和肝丸”和《內經》“四烏賊骨一蘆茹丸”融合創新,創制和樞消積丸。方中柴胡、黃芩,行小柴胡之意,調和少陽樞機,共為君藥;雞內金、麥芽兩藥配伍使肝氣升發,胃氣通降,脾氣健運,共為臣藥;黃芪、白術顧護后天之本,肉桂固先天之本,抑肝木橫恣,茜草活血化瘀,海螵蛸疏通血脈,鱉甲軟堅散結,連翹清熱散結,白芍潤以柔肝護肝,共為佐藥;甘草以緩肝兼調和諸藥,冰片、薄荷腦芳香通肝絡,共為使藥。諸藥配伍,使氣機調暢,肝胃調和,脾氣得健,濕熱清利,癥積自消。前期臨床觀察研究發現該方能夠延長肝癌患者總生存期,臨床療效明確。

為研究和樞消積丸對肝癌的抑制作用及機制,我們構建了H22皮下異位種移植小鼠模型,發現各治療組小鼠的腫瘤體積、腫瘤抑制率均顯著低于模型組,聯合組小鼠的抑瘤作用明顯高于單用和樞消積丸或索拉非尼。實驗觀察到和樞消積丸可以破環腫瘤組織內部結構,協助索拉非尼減緩肝癌細胞的發展進程。不同劑量的和樞消積丸均能不同程度下調H22荷瘤小鼠AST、ALT水平,而索拉非尼組小鼠的AST、ALT水平與模型組相近,提示和樞消積丸改善肝臟功能、減緩肝損傷的作用優于索拉非尼。VEGF可與血管內皮細胞的特異性受體結合,促進血管內皮細胞增殖,同時提高微血管的通透性,為腫瘤細胞提供營養物質;PDGF可促進細胞生化和增殖,能夠誘導血管內皮細胞、平滑肌細胞和腫瘤細胞的增殖和遷移[3],因此,抑制肝癌血管生成相關因子是治療肝癌的重要途徑。本文通過免疫組化和Western blotting實驗,證實和樞消積丸能夠抑制VEGF和PDGF表達水平,聯合索拉非尼使用時效果更優。

綜上所述,和樞消積丸具有抑制H22異位移植瘤生長和提高索拉非尼抗肝癌療效的作用,機制可能與抑制血管新生相關VEGF和PDGF相關。本研究也存在局限性,H22荷瘤小鼠樣本量有限,在今后的研究中還需利用體外模型、人體組織樣本進一步闡明作用機制。