小兒清熱止咳口服液高效液相色譜指紋圖譜的建立及8 種成分含量測定

潘 燕，胡林水，吳 明

（1. 浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 金華 321109； 2. 浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江 金華 321109）

小兒清熱止咳口服液為《傷寒論》名方“麻杏石甘湯”加板藍根、北豆根、黃芩而制成，有清熱宣肺、平喘利咽功效，主治小兒外感風熱所致咳嗽，癥見發熱、惡寒、咳嗽、咳黃痰、氣促、喘息、口干、聲音嘶啞、咽喉腫痛等［1-2］。2020年版《中國藥典（一部）》中該制劑僅以鹽酸麻黃堿為質量控制指標，成分單一，不能全面反映制劑特征［3］，而中藥指紋圖譜已成為中藥制劑質量控制的有效手段之一［4-12］。目前已有高效液相色譜（HPLC）法測定小兒清熱止咳口服液中各類成分的報道［13-16］，但尚未見對其指紋圖譜的研究。為此，本研究中嘗試建立了該制劑的HPLC 指紋圖譜，并定量分析了除北豆根、石膏外的5味藥材中的鹽酸麻黃堿、黃芩苷、苦杏仁苷、甘草酸銨、鹽酸偽麻黃堿、黃芩素、甘草苷、（R，S）-告依春等8種成分，以為該制劑的質量控制提供理論依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XSE205DU 型電子天平（精度為0.01 mg）、S210 型Seven CompactTMpH 計（瑞士Mettler Toledo 公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；WSZ - 100A 型回旋振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

小兒清熱止咳口服液（浙江康恩貝制藥股份有限公司，6批，批號分別為210610-1，210610-2，210611-1，210611 - 2，210612 - 1，210612 - 2，依次編號S1 - S6，規格均為每支10 mL）；鹽酸麻黃堿對照品（批號為171241 - 201809，含量100.0%），黃芩苷對照品（批號為110715-202122，含量94.2%），苦杏仁苷對照品（批號為110820 - 201808，含量88.2%），甘草酸銨對照品（批號為110731-202021，含量96.2%），鹽酸偽麻黃堿對照品（批號為171237-201510，含量99.9%），黃芩素對照品（批號為111595-201808，含量97.9%），甘草苷對照品（批號為111610-201908，含量95.0%），（R，S）-告依春對照品（批號為111753-202007，含量100.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸為高純，甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：A 為乙腈-甲醇（89∶11，V/V），B 為0.01 mol / L 磷酸二氫鉀溶液（pH 3.2），梯度洗脫（0～5 min時2%A →3%A，5～15 min時3%A →5%A，15～25 min時5%A →10%A，25～35 min時10%A →15%A，35～60 min 時15%A →25%A，60～68 min 時25%A →41%A，68～75 min 時41%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：210 nm（0～31 min），270 nm（31～75 min）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取鹽酸麻黃堿、黃芩苷、苦杏仁苷、甘草酸銨、鹽酸偽麻黃堿、黃芩素、甘草苷、（R，S）-告依春對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL分別含20，380，90，40，10，10，20，7 μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品5 mL，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇50 mL，回旋振蕩40 min，用50%甲醇定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按小兒清熱止咳口服液處方及工藝［1］制備缺石膏、炒苦杏仁、板藍根、麻黃、黃芩、甘草、北豆根的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液（編號S2）適量，分別于室溫下放置0，6，12，18，24，36 h 按2.1 項下色譜條件進樣測定。以黃芩苷（18 號峰）為參照峰，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.49%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.79%（n= 6），表明供試品溶液室溫放置36 h內基本穩定。

重復性試驗：取2.2 項下供試品溶液（編號S2）適量，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以黃芩苷（18 號峰）為參照峰，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.27%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于2.59%（n=6），表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：取2.2項下供試品溶液（編號S2）適量，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以黃芩苷（18號峰）為參照峰，同時取重復性試驗項下6份樣品共12 份樣品，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.15%（n= 12），相對峰面積的RSD均小于3.14%（n=12），表明該方法中間精密度良好。

2.3.2 指紋圖譜生成

取編號S1 - S6 樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），以S1為參照圖譜，選擇中位數法，設定時間寬度為0.1 min，經多點校正進行匹配，生成疊加指紋圖譜及對照圖譜，詳見圖1和圖2。

圖1 6批小兒清熱止咳口服液的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of six batches of Xiaoer Qingre Zhike Oral Liquid

圖2 小兒清熱止咳口服液對照圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Xiaoer Qingre Zhike Oral Liquid

2.3.3 共有峰指認及歸屬

共28 個共有峰，將對照指紋圖譜與對照品保留時間、紫外吸收光譜進行對比，指認了8 種成分，分別為（R，S）-告依春（1 號峰）、鹽酸麻黃堿（2 號峰）、鹽酸偽麻黃堿（3 號峰）、苦杏仁苷（7 號峰）、甘草苷（12 號峰）、黃芩苷（18 號峰）、黃芩素（27 號峰）、甘草酸銨（28 號峰），其中選取分離度較好，峰面積較大且穩定，保留時間適中的黃芩苷峰（18號峰）為參照峰（s）。將單味藥材圖譜與樣品圖譜進行對比，確認1號峰來自板藍根，2-3，5 號峰來自麻黃，6 - 7 號峰來自炒苦杏仁，9 - 11 號峰來自北豆根，12-13，19，28號峰來自甘草，13-27號峰來自黃芩。4，8 號峰尚無藥材歸屬，可能因為在煎煮過程產生了新成分。詳見表1。

表1 共有峰歸屬及指認Tab.1 Attribution and identification of common peaks

2.3.4 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）計算6 批樣品的相似度，結果均大于0.99，表明各批樣品間的相似度高。

2.4 各成分含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果各成分色譜峰分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。詳見圖3。

1.（R，S）- 告依春 2. 鹽酸麻黃堿 3. 鹽酸偽麻黃堿 7. 苦杏仁苷 12. 甘草苷 18. 黃芩苷 27. 黃芩素 28. 甘草酸銨A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖3 高效液相色譜圖1.（R，S）- epigoitrin 2.Ephedrine hydrochloride 3.Pseudoephedrine hydrochloride 7.Amygdalin 12.Liquiritin 18.Baicalin 27.Baicalein 28.Ammonium glycyrrhizinateA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關系考察：取各對照品適量，精密稱定，加50%甲醇稀釋制成不同質量濃度的系列對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

表2 線性關系及檢測限、定量限考察結果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ investigation

檢測限與定量限考察：取8 種對照品，分別用50%甲醇溶解并逐級稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定。分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時待測成分的質量濃度作為檢測限和定量限，結果見表2。

穩定性、重復性及中間精密度試驗：按2.3.1項下對應方法進行穩定性、重復性及中間精密度試驗。結果的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好，供試品溶液在室溫下放置36 h內基本穩定，方法重復性、精密度良好。

加樣回收試驗：精密量取本品2.5 mL，置100 mL容量瓶中，分別精密加入8 種對照品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n = 6）

2.4.2 樣品含量測定

取6批樣品，各平行2份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（mg/mL，n=2）Tab.4 Results of the content determination of eight components in samples（mg / mL，n = 2）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

預試驗中分別選擇50%甲醇、50%乙腈等不同提取溶劑進行操作，結果表明，50%甲醇作為提取溶劑時供試品溶液色譜圖的色譜峰更豐富，其成分色譜峰峰高也最高，故以其為提取溶劑。

3.2 流動相優化

預試驗中比較了乙腈- 0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫銨、（乙腈- 甲醇）- 0.01 mol/L磷酸二氫鉀等不同系統的洗脫效果，結果表明，選擇乙腈- 甲醇（89∶11）- 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀洗脫系統時，供試品溶液色譜圖中各成分分離度較好，故以該流動相進行梯度洗脫。

3.3 檢測波長選擇

預試驗中采用DAD 檢測器對供試品溶液中各色譜峰的紫外吸收進行全波長掃描，結果（R，S）-告依春在245 nm 波長處，苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿在210 nm 波長處，黃芩素、黃芩苷在276 nm 波長處，甘草苷在234 nm 波長處，甘草酸銨在250 nm 波長處分別有最大吸收。為避免波長頻繁切換造成基線漂移，且鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、（R，S）-告依春、鹽酸偽麻黃堿均在0～31 min 出峰，而黃芩素、甘草酸銨、黃芩苷、甘草苷均在31～75 min 出峰，故最終確定0～31 min 時檢測波長為210 nm，31～75 min 時檢測波長為270 nm，結果各共有峰均有較好吸收，能滿足分析要求。

3.4 方法評價

本研究中建立了小兒清熱止咳口服液HPLC 指紋圖譜，確定了28個共有峰，覆蓋了方中除石膏外其余6味中藥主要特征性成分，并同時對鹽酸麻黃堿、黃芩苷、苦杏仁苷、甘草酸銨、鹽酸偽麻黃堿、黃芩素、甘草苷和（R，S）- 告依春8 個成分進行定量分析，方法靈敏、簡便、準確，重復性好，能較全面地反映制劑的質量信息，可用于制劑的質量控制。處方中炒苦杏仁、北豆根均為小毒藥材，故本研究中僅考察了炒苦杏仁中的苦杏仁苷含量，北豆根的蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿等與安全性相關的指標有待進一步研究。