基于網絡藥理學探討龍藤通絡方治療癌癥疼痛的作用機制

蘇羚子,焦麗靜,許 玲,周 迪

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

癌痛特指由腫瘤直接壓迫、致痛介質(炎性因子等)分泌、癌細胞浸潤轉移等原因,累及空腔及實質器官,誘發局部壞死、炎癥等,引起疼痛,常伴有牽涉痛。疼痛作為與生活治療相關的一個重要的因子(HRQOL),提供了生存的預后信息,對惡性腫瘤患者的生活質量產生了嚴重的影響。據統計,90%患者在病情發展的不同階段出現癌痛癥狀,80%晚期患者可出現中重度疼痛[1]。自世界衛生組織推廣實施三階梯止痛方案以來,癌痛的治療已取得了較大的進步,對于中重度的癌痛患者,阿片類止痛藥無可取代,但其引起便秘、惡心、呼吸抑制等不良反應給患者造成了很大的困擾[2]。近年來,中醫藥逐漸成為臨床治療癌痛的輔助手段,有研究證實中醫藥與止痛藥的結合使用,可以提高止痛藥的療效并減輕不良反應[3]。龍藤通絡方由上海中醫藥大學特聘教授許玲教授創制,是基于長期大量臨床實踐而總結的經驗方,由穿山龍、延胡索、川楝子、乳香、沒藥、絡石藤、海風藤組成,具有解毒化瘀、活血通絡功效。經過1項中美NIH國際合作項目,3項國家自然科學基金的研究,已授權國家發明專利(專利號:ZL201510580078.X)。課題組前期研究發現龍藤通絡方外用治療肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腸癌等導致的疼痛臨床療效顯著、使用安全,可減少阿片類藥物的應用,減輕不良反應,提高生活質量[4]。基礎研究提供了龍藤通絡方外用治療大鼠骨癌痛的行為學支撐,初步闡明了止痛的外周機制和部分中樞機制[5-8]。然而,目前龍藤通絡方治療癌痛的機制及分子作用機制尚未明確。因此,本研究基于網絡藥理學方法,探討龍藤通絡湯治療癌痛的潛在成分、作用靶點及分子通路,闡明其作用機制。

1 資料與方法

1.1龍藤通絡方藥物活性成分和相關靶點的篩選利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[9](https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集龍藤通絡湯中延胡索、乳香、沒藥、絡石藤、海風藤、川楝子的化合物成分。以口服生物利用度為≥30%、藥物相似性≥0.18為閾值設置ADME屬性,獲取藥物相關活性成分,再利用該平臺獲取活性成分作用的蛋白質靶點信息。由于TCMSP數據庫中未找到穿山龍相關的靶點,因此,穿山龍的化合物成分通過Batman-TCM數據庫[10](http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)進行補充,選取得分>20分的成分靶點納入。所有靶點經UniProt數據庫[11](https://www.uniprot.org/)校正, 去掉非人類靶點。

1.2癌癥疼痛相關靶點的篩選 以“cancer pain”為關鍵詞,在GeneCards數據庫[12](https://www.genecards.org/),NCBI基因數據庫[13](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及DisGeNET數據庫[14](https://www.disgenet.org/)進行人類基因檢索。其中,GeneCards數據庫的靶點根據得分進行中位值的篩選以獲得更加相關的靶點。

1.3龍藤通絡湯活性成分-癌痛靶點的可視化網絡的構建 利用網絡在線工具Venny 2.1.0 (http://bioinfogn.cnb.csic.es/tools/venny/),針對龍藤通絡湯活性成分的作用靶點與癌痛的靶點繪制韋恩圖,所得的交集靶點即為龍藤通絡湯作用于癌痛的靶點。利用Cystoscape 3.8.0對前期收集到的關于藥物成分和交集靶點的數據進行可視化處理,構建“藥物活性成分-癌痛靶點”網絡,選擇Network Analyzer工具進行拓撲分析。

1.4蛋白互作網絡圖的構建及關鍵靶點的獲取將藥物疾病共有靶點導入String數據庫[15](https://string-db.org/cgi/input.pl)構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡模型,選擇生物種類為“Homo sapiens”,可信度>0.9,得到PPI 網絡圖。將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0[16]中,構建通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析,通過degree排序,選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點,總共篩選出個61關鍵靶點,將前20個靶點使用R 4.0.3進行圖片繪制,橫坐標為每個靶點的度值。通過插件MCODE[17]進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.5基因本體(Gene ontology,GO)生物過程分析將藥物疾病交集靶點進行GO的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cell component,CC)富集,引用String 數據庫,將校正P值<0.05的項目進行篩選。

1.6京都基因與基因組百科全書(Kypyo encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析,引用String 數據庫,將校正P值<0.05的項目進行篩選, 且從小到大排序作為篩選條件, 選取符合條件的前20位的KEGG通路。

1.7“成分-疾病-通路-靶點”網絡構建 利用Cytoscape 3.8.0中的關聯功能, 合并活性成分-疾病-通路-靶點網絡圖,在輸出結果中,以不同顏色的節點分別表示活性成分、疾病、通路和靶點?；衔锖蜐撛诎悬c通過邊緣(edge)相連,目標蛋白和通路也通過邊緣相連。

2 結 果

2.1龍藤通絡湯藥物活性成分和相關作用靶點通過TCMSP數據庫檢索檢索延胡索、乳香、沒藥、絡石藤、海風藤、川楝子的化合物成分和靶點,經匯總刪重后,獲得延胡索活性成分49種及其作用靶點201個;獲得乳香活性成分8種及其作用靶點11個;獲得沒藥活性成分45種及其作用靶點184個;獲得絡石藤活性成分9種及其作用靶點112個;獲得海風藤活性成分21個及其作用靶點54個;獲得川楝子活性成分9種及其作用靶點144個;獲得穿山龍活性成分3種及其作用靶點128個靶點。

2.2癌癥疼痛靶點 在GeneCards 數據庫中根據關鍵詞“cancer pain”獲得癌痛相關靶點2 946個;在NCBI數據庫中獲癌痛相關靶點447個;在DisGeNET數據庫獲得62個相關靶點。將這3個數據庫的基因合并刪重之后,得到8 019個癌痛相關基因。

2.3龍藤通絡湯活性成分-癌癥疼痛靶點的可視化網絡 將篩選出的藥物有效成分靶點與癌痛靶點輸入軟件Venny 2.1,制作韋恩圖,得到215個交集靶點,見圖1。交集靶點對應龍藤通絡湯中的113個化學成分,見表1。為了更好地理解成分、疾病以及相應靶點之間的復雜作用關系,使用Cytoscape 3.8.0構建成分-疾病-靶點網絡圖,見圖2。將成分-疾病-靶點網絡圖導入Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析,將成分按度值大小排序,度值越高成分越重要,度值最高的藥物活性成分為槲皮素(度值為121,介度為0.144 852,緊密度為0.510 638),其次為木樨草素(度值為51,介度為0.409 756,緊密度為0.025 654)、豆甾醇(度值為28,介度為0.400 955,緊密度為0.014 448),推測槲皮苷、木樨草素、豆甾醇為龍藤通絡湯治療癌痛的主要成分,見表2。

表1 交集靶點對應龍藤通絡湯中的113個化學成分信息

表2 MCODE聚類分析詳細信息

圖1 龍藤通絡方-癌痛的共有靶點韋恩圖

注:網絡中黃色為活性成分,粉色為藥物作用于疾病的靶點,綠色為中藥,藍色矩形為疾病

2.4PPI網絡構建及關鍵靶點的獲取 將交集靶點數據輸入String數據庫進行PPI網絡的構建,該網絡中有215個節點,723條邊,平均度值為6.67,見圖3和圖4(圖3為string網站導出的PPI網絡圖,圖2為Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖)。將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0中,通過Network Analyzer工具進行拓撲分析,通過degree排序,選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點,總共篩選出個61關鍵靶點,將前20個靶點,即STAT1、NCOA1、AR、RXRA、CCND1、EGFR、CDKN1A、RB1、MYC、IL6、CAV1、FOS、MAPK14、ESR1、TNF、RELA、JUN、MAPK1、AKT1、HSP90AA1,使用R 4.0.3進行圖片繪制,橫坐標為每個靶點的度值,見圖5。度值越大,節點越大,則蛋白之間的關系越密切,其中度值排名前4位的靶點即HSP90AA1、AKT1、MAPK1。通過MCODE分析進行核心基因的篩選。將已經構建好的PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0中,使用MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選?？偣驳玫?0個基因簇和8個核心基因,核心基因為PARP1、CXCL8、CDK2、CHRNA7、PPARG、GRIN2A、VCAM1、MMP3,見表2。

圖3 龍藤通絡方活性成分癌痛交集靶點的PPI網絡圖

注:圖中的節點顏色和大小根據度值調整,越大,顏色越深,度值越大;線的粗細,從粗到細表示edge betweenness從大到小

圖5 龍藤通絡湯作用靶點拓撲分析靶點的度值

2.5GO功能富集分析及KEGG通路富集分析通過R語言軟件的clusterProfiler對交集靶點進行GO功能富集分析,結果富集到生物進程條目2 682項,分子功能188項,細胞組成124項。結果顯示,龍藤通絡湯治療癌痛相關靶點參與的生物進程主要包括對藥物的反應、對金屬離子的反應、對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應等。涉及的主要細胞組分包括膜閥、膜微區、膜區域、等離子膜伐等。涉及的分子功能包括神經遞質受體活性、核受體活性、配體活化、轉錄因子活性、DNA結合轉錄因子結合等。輸出各組分排名前10的條目,繪制成氣泡圖,見圖6。通過R語言軟件的clusterProfiler對交集靶點進行KEGG通路富集分析,結果富集到龍藤通絡湯治療癌痛的信號通路共175條,參與通絡主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。龍藤通絡湯的有效成分可能通過作用于這些信號通路達到治療癌痛的目的。將富集結果繪制出氣泡圖,見圖7。

注:BP、CC、MF分別代表生物進程、細胞組分、分子功能

圖7 龍藤通絡湯治療癌痛交集靶點的KEGG通路富集分析(僅展示前20位)

2.6成分-疾病-通路-靶點網絡構建 選取核心的-個基因,制作“成分-疾病-通路-靶點”的網絡關系表,將其導入Cytoscape 3.8.0軟件,構建出龍藤通絡湯治療癌痛的通路網絡圖,更直觀地展示中藥活性成分在治療疾病過程中的多成分-多靶點的作用特點,見圖8。

注:綠色為化合物,黃色為中藥作用于疾病的靶點,藍色為最顯著的前20條通路,紫色為疾病,紅色為中藥

3 討 論

癌性疼痛是中、晚期癌癥患者最常見、最痛苦的癥狀之一,對患者臨床治療的依從性與生活質量均有較大的影響。目前,三階梯止痛藥物在癌性疼痛中的應用十分普遍,但并不能讓所有患者受益,且該類藥物會導致便秘、惡心、呼吸抑制等不良反應, 如何有效止痛,并最大限度地改善晚期癌痛患者地生活質量是臨床面臨地重大課題。

古代中醫典籍中,對疼痛的認識,《內經》《諸病源候論》《千金方》《證治要訣》等經典中皆有記載,早在《內經》就記載有“寒入經而稽遲,泣潤而不行,客于脈外則血少,客于脈中則氣不通,故猝然而痛……”在古代典籍中雖無癌痛的直接命名,但有許多類似于癌痛的具體描述。如《內經》中有“大骨枯槁、大肉下陷、胸中氣滿、喘息不便、內痛引肩頸”的描述,極似肺癌晚期疼痛。《證治要訣》中“痞積在胃脘,大如覆杯,痞塞不通,背痛心痛”是對臨床肝癌痛表現的描述。許玲教授在長期臨床實踐的基礎上,認為氣滯血瘀、脈絡不通為癌痛的主要病機,并貫穿其整個病理過程,治療時強調行氣活血、通絡止痛,并組方龍藤通絡方。方中穿山龍活血舒筋,延胡索、川楝子理氣散瘀,乳香、沒藥活血化瘀、消腫止痛,佐以海風藤、絡石藤加強祛風通絡、理氣止痛之功效。此方在行氣活血的同時,又可解毒散結、通絡止痛。中藥單體及復方的研究是現代中醫治療疾病的主要方法,通過潛在的多成分、多靶點相互作用起到治療效果,在復雜疾病的治療中發揮了重要作用。通過現代藥理學、網絡藥理學等研究可進一步對藥物成分及生物信息得以進一步的認識,從而呈現藥物、疾病、靶點之間的相互關系。現代藥理學對龍藤通絡方中諸藥已有一定的認識。其中,穿山龍具有抗炎、鎮痛作用,其機制可能與抑制體內IL-1β與IL-6表達有關[18]。延胡索味辛、苦,性溫,具有活血散瘀、理氣止痛的功效,現代藥理學研究顯示,延胡索總堿的鎮痛效價是嗎啡的40%,其鎮痛高峰可維持約2 h[19]。川楝子味苦,性寒,具有瀉熱疏肝、行氣鎮痛功效,研究表明川楝子醇提取物具有抗炎鎮痛的作用[20]。沒藥味辛、苦,性平,乳香味辛、苦,性溫,具有活血化瘀止痛功效,現代藥理學研究表明,乳香和沒藥具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、鎮痛等作用,其中對神經性疼痛的止痛效果顯著[21]。海風藤味辛、苦,性微溫,具有祛風濕、通經絡、止痹痛的功效。研究表明海風藤提取物能通過抑制環氧合酶-1(COX-1)和5-LOX減少前列腺素和白細胞三烯的生物合成,海風藤正丁醇提取物可減緩炎癥反應,并可延長疼痛反應出現的時間[22-23]。絡石藤主要成分為絡石藤總黃酮,實驗證明該物質可明顯提高小鼠熱板反應的痛閾值,具有抗炎鎮痛作用[24]。

本研究直觀地呈現了113個化合物成分、10個基因簇、8個核心基因和175條作用通路和癌性疼痛疾病間的關聯。經初步篩選發現,龍藤通絡方作用于癌性疼痛靶基因的主要活性成分以槲皮素、木樨草素、豆甾醇為主。槲皮素是植物界分布廣泛,具有多種生物活性的黃酮醇類化合物,已被證明有抗氧化、抗炎和抗增殖作用,具有潛在的抗癌特性[25]。動物和細胞實驗表明,槲皮素可在各種惡性腫瘤中下調AKT1、PTGS2和VEGFA的表達并上調TP53的表達,這些惡性腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌,它們是最容易發生骨轉移的排名前3位的惡性腫瘤。木犀草素是一種在植物中發現的類黃酮。它可抑制腫瘤細胞的增殖,激活細胞周期阻滯,通過不同的信號通路誘導凋亡,在體外和體內阻止癌癥的發展[26]。木犀草素還可通過細胞骨架收縮、誘導上皮生物標志物E-cadherin表達以及下調間充質生物標志物N-cadherin、snail和vimentin等機制逆轉上皮-間充質轉化[27]。豆甾醇屬于植物甾醇,具有較強的生理活性和表面活性。體外試驗研究發現,豆甾醇能明顯抑制LPS誘導的環氧合酶-2(COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和蛋白水平的提高,抑制前列腺E2和一氧化氮的釋放,具有抗炎的作用[28]。有研究發現,口服0.3～3 mg/kg豆甾醇,對醋酸誘導的扭體試驗、手術切口引起的機械性疼痛、部分坐骨神經結扎等多種急慢性疼痛模型表現出非常有效的鎮痛作用[29]。

PPI分析結果顯示,度值排名前3的靶點分別是HSP90AA1、AKT1、MAPK1、JUN。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一類高度保守的蛋白質,參與多種生物過程,HSP90AA1作為家族的重要成員,可通過其C末端結構域嵌入脂質雙層中,在應激條件下對膜穩定具有重要作用。Lei等[30]實驗發現,HSP90通過ERK機制調節疼痛行為,能夠提高嗎啡的鎮痛效果,減少嗎啡的不良反應。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的激活可導致各種刺激引起的疼痛[31]。AKT1是3種蛋白激酶之一,參與多個炎癥、免疫、代謝和細胞增殖相關的信號通路[32]。AKT蛋白在大多數癌癥類型中都高度表達,包括肺癌、肝癌、乳腺癌和結腸癌,其中AKT1是治療癌癥的主要靶點,在細胞增殖和抗凋亡的過程中發揮作用。mTOR是AKT通路的下游激酶之一,在疼痛相關的中樞神經系統中被激活,并作為阿片類藥物誘導痛覺過敏的有效靶點。AKT-mTOR信號級聯參與了一些生理和病理過程,如嗎啡耐受、痛覺過敏、血管生成等[33]。JUN屬于轉錄因子活化蛋白1,包括c-Jun、JunB、JunD, 其中多以c-Jun為主。c-Jun被活性氧激活后,可上調基質金屬蛋白酶2表達,從而增強癌細胞的侵襲和遷移能力,促進癌細胞擴散,加速癌癥病程進展,加重癥狀表現。

GO和KEGG富集分析進一步揭示了龍藤通絡湯治療癌痛的作用機制。通過對龍藤通絡方治療癌性疼痛的8個核心基因進行GO生物進程富集,顯示龍藤通絡方治療癌痛主要涉及對藥物的反應、對金屬離子的反應、對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應等生物進程,膜閥、膜微區、膜區域、等離子膜伐等細胞組分,神經遞質受體活性、核受體活性、配體活化、轉錄因子活性、DNA結合轉錄因子結合等分子功能。KEGG富集分析發現,上述生物進程的主要通路涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。AGE-RAGE信號通路通過激活PKC/JNK/NF-κB信號通路,促進炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α等的表達與釋放,從而引起炎癥反應的發生[34]。除此之外,它還可以激活PCK/PK-1信號通路,使得MCP-1、MMP-2、ICAM-1等蛋白過表達,使得血液黏滯度增加。IL-17信號通路和腫瘤壞死因子通路與炎癥、免疫調節相關,IL-17可與TNF-α共同誘導細胞產生炎癥因子IL-6,而IL-6不僅可促進C反應蛋白的生成,也對IL-17有正向反饋作用,三者互相影響加重炎癥反應[35]。此外,已有研究發現IL-17與其他疾病(如多發性硬化癥)的疼痛癥狀有關[36]。腫瘤壞死因子α是一種促炎因子,可由腫瘤或受腫瘤刺激的周圍組織產生,與腫瘤的生長、轉移密切相關。Constantin等[37]發現,TNF-α拮抗劑對于降低熱源性痛覺和機械性疼痛敏感性具有一定作用。

本研究初步闡釋了龍藤通絡方治療癌性疼痛的潛在活性成分及其可能的作用機制,篩選出槲皮苷、木樨草素、豆甾醇等活性成分,JUN、MAPK1、AKT1、HSP90AA1等作用靶點,以及AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等與疾病發生相關的通路。通過調控上述靶點和信號通路,減少癌細胞增殖,減少致痛介質釋放,緩解因腫瘤生長引起的牽涉痛及炎性因子相關性疼痛,從而達到治療癌痛的目的。為研究龍藤通絡湯的分子機制提供了依據,為癌痛的治療提供了新的選擇。然而,本研究基于網絡大數據得到的預測,存在一定的局限性,結果還需要通過動物體內實驗和細胞體外實驗進一步驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。