金黃色葡萄球菌異質性耐藥研究進展

和曉蘭,趙艷坤,,孟 璐,劉慧敏,高姣姣,鄭 楠*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室(烏魯木齊)新疆農產品質量安全實驗室,烏魯木齊 830091)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus),為革蘭陽性菌,屬于人畜共患致病菌,也是臨床中最常見的致病菌。2021年全國細菌監(jiān)測報告顯示,納入監(jiān)測的細菌中,革蘭陽性菌占28.9%,金黃色葡萄球菌在革蘭陽性菌的分離率中排名第一,占革蘭陽性菌的31.8%。甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的發(fā)生率近年來有所增加[1-2]。在我國,甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的平均檢出率為29.4%。研究發(fā)現(xiàn),從2010年到2021年的收集的糖尿病患者樣本中有52%存在至少3種MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)危險因素[3]。Russell等[4]發(fā)現(xiàn),巴西72%的病例中感染了MRSA。近年來,隨著抗菌藥物在養(yǎng)殖場所、食品保藏和臨床上大量及不合理的使用,金黃色葡萄球菌對多種抗菌藥物表現(xiàn)出了耐藥現(xiàn)象。甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌對青霉素、甲氧西林、苯唑西林等耐藥[5],也對頭孢菌素等β-內酰胺類抗菌藥物耐藥[6]。萬古霉素是治療甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的黃金藥物,然而有許多萬古霉素對甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度上升的報道[7-9]。異質性耐藥可看成抗菌藥物敏感菌株向耐藥菌株轉化的中間階段[10],加強異質性耐藥轉變過程中的研究,有助于抗菌藥物對致病菌的防治。異質性耐藥細菌是指存在耐藥亞群,其能夠在至少8倍的最低抑菌濃度下生長,并且耐藥亞群出現(xiàn)的頻率大于10-7。本文簡要綜述了金黃色葡萄球菌異質性耐藥的流行狀況及機制,旨在加深對金黃色葡萄球菌異質性耐藥的了解,并為其評估治療方案和指導臨床抗菌藥物的合理使用提供參考。

1 異質性耐藥的特點

異質性耐藥最廣泛的定義是存在異質性細菌種群,其中有一個亞群或幾個亞群與主要種群相比表現(xiàn)出更高水平的抗菌藥物耐藥性[11]。異質性耐藥的克隆性分為單克隆和多克隆。單克隆指的是細菌在高頻率上分化出了敏感亞群和耐藥亞群。在抗菌藥物存在的情況下,異質性耐藥群體中耐藥亞群的比例增加,但當抗菌藥物壓力下降時,細胞又恢復到抗菌藥物敏感狀態(tài),如圖1[12]。在抗菌藥物治療期間,感染了耐藥菌株,或感染致病菌后,經過抗菌藥物的治療,某些菌株產生自發(fā)耐藥突變,都屬于多克隆異質性耐藥[11]。異質性耐藥與耐藥亞群的耐藥水平有關,如果某些耐藥亞群可以在比主要亞群的最低抑菌濃度高8倍的情況下生長,則認為該菌疑似存在異質性。定義異質性耐藥的另一個因素是耐藥亞群的出現(xiàn)頻率,根據(jù)目前常用的檢測方法,耐藥亞群頻率的檢測限為10-7甚至更低[11]。異質性耐藥分為穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的,在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中,穩(wěn)定的異質性耐藥亞群最低抑菌濃度基本不變,不穩(wěn)定的異質性耐藥亞群最低抑菌濃度可能從耐藥逐步恢復到敏感。

圖1 單克隆異質性(改自參考文獻[12])Fig.1 Monoclonal heteroresistance(Modified from reference[12])

2 異質性耐藥的檢測方法

目前,用于異質性耐藥檢測最常用的方法有肉湯微量稀釋法、K-B紙片擴散法、E-test法和菌群譜型分析PAP法(圖2)。隨著生物技術的發(fā)展,出現(xiàn)了很多新型的檢測方法包括全自動微生物鑒定藥敏分離系統(tǒng)、液滴數(shù)字PCR[13]、等離子體膠體體耦合技術[14]、等離子膠質體偶聯(lián)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術、拉曼光譜技術、DNA分子探針等。

圖2 金黃色葡萄球菌異質性耐藥篩選方案Fig.2 Scheme for determination of heteroresistance of S. aureus

K-B紙片擴散法和E-test試紙條法是檢測致病菌異質性耐藥的初篩方法。操作簡單,成本低,具有可重復性,可以靈活選擇抗菌藥物。但是存在較高的假陰性率,會導致異質性耐藥菌株的漏檢[13]。紙片擴散法[15]作為大多數(shù)細菌病原體的抗生素藥敏試驗的可靠方法,具有較完備的標準。改良的紙片擴散EUCAST法[16-17]具有較高的可重復性。Vitek 2自動化系統(tǒng)在7 h內就可得出耐藥性結果,在對甲氧西林耐藥性的檢測中,具有高度的準確性[18]。菌群譜型分析PAP法是檢測致病菌異質性耐藥的確證方法,被認為是檢驗異質性耐藥的黃金標準。然而典型的PAP方法成本高,既費時又費力。肉湯微量稀釋法主要用于致病菌對抗菌藥物最低抑菌濃度MIC值的測定。Zuill等[17]建立了改良的EUCAST酵母肉湯微量稀釋MIC法。Spencer等[19]開發(fā)了電動肉湯微量稀釋法,可在1 h快速完成檢測。

目前,不斷有新型快速的異質性耐藥檢驗方法被開發(fā)出來,相比異質性耐藥表型的檢測,新型檢測方法具有更高的準確度。Kim和Lee[20]開發(fā)了TaqMan單核酸多態(tài)性SNP基因分型測定法。Ding等[21]開發(fā)了噬菌體擴增試驗的方法來間接定量檢測目標細菌及其敏感性。高通量測序[22]和微滴式數(shù)字聚合酶鏈式反應[13]是檢測異質性耐藥的有效方法,但是存在較多的局限性。Price等[23]研究出固定化細菌細胞自動顯微鏡技術來鑒別菌株的耐藥性。Gallois等[24]評估了基于微流控芯片技術和顯微成像分析的快速抗菌藥物藥敏試驗方法。等離子膠質體偶聯(lián)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜可將生物體鑒定時間縮短1～1.5 d[25]。將細菌代謝活性與拉曼光譜結合可使抗菌藥物快速篩選成為可能[26](表1)。

表1 異質性耐藥檢驗方法對比Table 1 Comparison of detection methods for heteroresistance

3 金黃色葡萄球菌異質性耐藥的流行情況

3.1 金黃色葡萄球菌對糖肽類抗菌藥物異質性耐藥的流行情況

隨著萬古霉素的廣泛使用,金黃色葡萄球菌的敏感性逐漸下降,MRSA的發(fā)病率越來越高。金黃色葡萄球菌的異質性耐藥研究常見于糖肽類抗菌藥物,關于糖肽類的異質性耐藥率被廣泛報道,但其大都集中于臨床醫(yī)學方面。金黃色葡萄球菌對糖肽類抗菌藥物的異質性耐藥率在不同的研究之間有很大差異,從2.19%～25.9%(表2)。胡遠芳等[27]從濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院患者痰液中檢出異質性耐藥萬古霉素中介金黃色葡萄球菌22株,檢出率為8.4%,比劉彩林和明亮[28]從鄭州大學第一附屬醫(yī)院臨床分離株檢測的17.9%低了兩倍。Nam等[29]顯示出韓國醫(yī)院臨床分離株萬古霉素的異質性耐藥率為20%,比意大利從血流、肺炎和皮膚結構感染患者分離的萬古霉素異質性耐藥率25.9%低。M等[30]顯示出印度卡納塔克邦醫(yī)院糖尿病和非糖尿病患者對萬古霉素的異質性耐藥率為6.4%,這比Amberpet等[31]發(fā)現(xiàn)的印度醫(yī)院臨床分離株的異質性耐藥率12.4%低兩倍左右。Ramli等[32]顯示出馬來西亞醫(yī)院患者分離株萬古霉素的異質性耐藥率為2.19%,比從我國黃河三角洲地區(qū)膿液、血液、痰液中分離到的異質性耐藥率10.8%低五倍左右[33]。

表2 金黃色葡萄球菌對糖肽類抗菌藥物異質性耐藥的流行情況Table 2 Prevalence of heteroresistance of S. aureus to glycopeptide antibiotics

3.2 金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類抗菌藥物異質性耐藥的流行情況

表3 金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類抗菌藥物異質性耐藥的流行情況Table 3 Prevalence of heteroresistance of S. aureus to β-Lactam antibiotics

3.3 金黃色葡萄球菌對磺胺類抗菌藥物異質性耐藥的流行情況

磺胺類抗菌藥物主要包括磺胺甲惡唑、磺胺異惡唑等抗菌藥物。甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑經常被用來治療甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的感染。Xu等[42]研究顯示,豬場鼻拭子樣本中分離的金黃色葡萄球菌對復方新諾明的耐藥率為100%。Huang等[44]發(fā)現(xiàn),奶牛場的金黃色葡萄球菌對磺胺甲惡唑的耐藥率為65%。Amare等[45]通過對街頭售賣食品中的細菌病原體進行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌是分離頻率最高的分離株,經藥敏試驗發(fā)現(xiàn)甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑是對所有分離株均有明顯抗菌效果的藥物之一。隨著磺胺類藥物的廣泛使用,Sato等[46]報道了醫(yī)院臨床分離株金黃色葡萄球菌對甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑耐藥的風險。Nurjadi等[47]從來自醫(yī)院臨床分離株的馬血瓊脂平板上觀察到了甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑異質性耐藥菌株。Nakipolu等[48]發(fā)現(xiàn)醫(yī)院臨床分離株甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑的耐藥性。Wang等[49]發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌牛奶樣品的金黃色葡萄球菌對甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑的耐藥率為71.4%。目前,關于磺胺類異質性耐藥的研究在臨床方面非常少。在動物源方面,大多與耐藥率有關,還沒有深入到異質性耐藥的研究。

3.4 金黃色葡萄球菌對其他抗菌藥物異質性耐藥的流行情況

我國研究異質性耐藥的抗菌藥物的種類很多,包括四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類等,異質性耐藥率為0%～73.7%(表4)。Xu等[42]經過豬鼻拭子四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星和氯霉素異質性耐藥的檢測,顯示其耐藥率分別為93.46%、34.58%、24.30%和100%。Mutu等[50]顯示醫(yī)院臨床分離株的莫匹羅星異質性耐藥率為27.7%,異質性耐藥亞群的頻率為10-9～10-8。Bai等[51]顯示醫(yī)院臨床分離株氨甲基環(huán)素的異質性耐壓率為7.98%,對氨甲基環(huán)素的異質性耐藥率為20.73%。陳東科等[52]結果顯示醫(yī)院臨床分離株紅霉素的異質性耐藥率為73.7%。

表4 金黃色葡萄球菌對其他抗菌藥物異質性耐藥的流行情況Table 4 Prevalence of heteroresistance of S. aureus to other antibiotics

4 金黃色葡萄球菌異質性耐藥機制

4.1 對糖肽類抗菌藥物異質性耐藥機制

糖肽的異質性耐藥還沒有直接與特定的機制相聯(lián)系[11]。異質性耐藥可能是由于細菌在生長過程中產生了突變,這些不穩(wěn)定的突變可以由點突變、插入序列和小缺失引起,這些突變在遺傳上是穩(wěn)定的,但具有很高的適應度成本,在沒有抗菌藥物壓力的情況下,高適應成本是選擇第二位點代償性突變的驅動因素,補償突變有助于降低適應成本[11]。Liang等[33]認為,萬古霉素能與D-丙氨酸-D-丙氨酸末端結合形成復合體,進而阻止轉肽和轉糖基化,導致在細胞壁合成過程中不完全或無效的肽聚糖交聯(lián)。Yamakawa等[35]發(fā)現(xiàn)hVISA(萬古霉素中介金黃色葡萄球菌)菌株具有非同義突變。Hu等[54]發(fā)現(xiàn)58%的hVISA菌株存在Agr功能障礙,具體機制見圖3。Katayama Y等[56]研究顯示,實驗室突變株含有1個突變的vraS,導致氨基酸替換,與臨床hVISA表現(xiàn)出相似的表型,說明額外的突變機制可能是導致hVISA表型進化的原因。Howden等[57]在Walk突變體的假定運輸基因中檢測到了兩個潛在的代償突變。Shu等[58]認為內源性S-亞硝化可以誘導轉錄信號繞過萬古霉素的作用,是調節(jié)金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥性的關鍵機制。

圖3 參與金黃色葡萄球菌生物膜形成調節(jié)的相關基因(改自參考文獻[59])Fig.3 Related genes involved in the regulation of S. aureus biofilm formation(Modified from reference[59])

4.2 對β-內酰胺類藥物異質性耐藥機制

目前,關于β-內酰胺類異質性耐藥的研究大多集中在革蘭陰性菌中,而在革蘭陽性菌中研究相對較少。在金黃色葡萄球菌的治療過程中,β-內酰胺類藥物經常被用到,但隨著MRSA菌株的流行,金黃色葡萄球菌開始對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥[39]。對于其異質性耐藥機制的研究,存在很多關于mecA基因編碼青霉素結合蛋白PBP2a產生的增加導致對甲氧西林耐藥的說法[60],具體機制見圖4。造成異質性耐藥的另一個可能機制是轉錄調控因子的失活[61]。β-內酰胺類藥物通過抑制青霉素結合蛋白,進一步影響細胞壁的肽聚糖合成從而發(fā)揮抗菌藥物作用[62]。Sasaki等[63]研究顯示青霉素結合蛋白中的突變賦予了臨界MRSA菌株對苯唑西林的耐藥特性。Proulx等[64]認為在甲氧西林敏感表型向甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌轉化過程中,會出現(xiàn)以重復核苷酸延伸為特征的序列突變。Liang[65]等發(fā)現(xiàn)mecA基因的第二個啟動子的錯義突變和單取代突變都可以使苯唑西林和頭孢西丁敏感的SA分離株變?yōu)殡[形耐藥的MRSA。

圖4 由4種 PBP 酶(PBP 1-4)完成的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌中肽聚糖生物合成(改自參考文獻[62])Fig.4 Peptidoglycan biosynthesis in the methicillin-susceptible S. aureus is accomplished by four PBP enzymes (PBPs 1-4) (Modified from reference[62])

4.3 對磺胺類藥物異質性耐藥機制

磺胺類藥物的異質性耐藥機制往往與耐藥突變和適應性降低有關(圖5)。Sato等[46]在體外復方新諾明暴露實驗中發(fā)現(xiàn)耐藥株突變。金黃色葡萄球菌小菌落變異株對SXT的敏感性降低,通常涉及胸腺嘧啶核苷、甲萘二酮或氯化血紅素營養(yǎng)不良[47]。Clarke等[66]發(fā)現(xiàn),復方新諾明介導的DNA損傷可能導致耐藥菌株的出現(xiàn)。有些異質性耐藥基因突變與小菌落變異表型相關,這種耐藥突變體在沒有抗菌藥物作用時,會選擇增加適應性和敏感性的代償突變[11]。Kriegeskorte等[67]發(fā)現(xiàn)復方新諾明在短期暴露后誘導了胸苷依賴性耐藥小菌落變異體表型。

圖5 點突變、插入序列和小缺失引起的異質性耐藥(改自參考文獻[11])Fig.5 Heteroresistance caused by point mutations, insertion sequences and small deletions(Modified from reference[11])

4.4 對其他抗菌藥物異質性耐藥機制

對其他抗菌藥物的異質性耐藥機制主要涉及兩方面,一方面與抗菌藥物的外排或內流有關,很多研究報道外排泵的增加、外排相關基因上調、磷霉素內流、孔蛋白編碼基因表達減少、外排泵過表達等都有助于異質性耐藥表型的形成,另一方面與點突變、插入序列、小缺失等引起的耐藥突變有關[11],具體機制見圖6。Mutu 等[50]發(fā)現(xiàn),突變是導致金黃色葡萄球菌莫匹羅星異質耐藥的關鍵機制。Bai等[51]發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸轉運系統(tǒng)II 載體蛋白和 Na/Pi 協(xié)同轉運蛋白家族蛋白和基因的過表達有助于奧達環(huán)素異質性耐藥的產生。陳東科等[52]發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌對紅霉素呈現(xiàn)異質性耐藥,且檢出ermA基因。虞培娟等[68]發(fā)現(xiàn)1株菌出現(xiàn)了“G”-“T”點突變。Wang等[69]發(fā)現(xiàn)Na/Pi 協(xié)同轉運蛋白和支鏈氨基酸載體蛋白可以促進金黃色葡萄球菌的二氫四環(huán)素異質性耐藥。

圖6 主要促進因子超家族多藥外排泵的離子驅動反轉運機制(改自參考文獻[70])Fig.6 Modulation of MFS efflux pump by efflux pump inhibitors (EPIs) in S. aureus(Modified from reference[70])

5 小 結

異質性耐藥的本質是對抗菌藥物敏感的菌株,其亞群對于抗菌藥物存在不同的反應,即大多數(shù)亞群對抗菌藥物敏感,而少部分亞群出現(xiàn)對抗菌藥物耐藥的情況。目前,對豬源、牛源金黃色葡萄球菌的研究仍然局限于抗菌藥物耐藥性和分子流行病學,缺乏對于異質性耐藥和更深層次的研究。因此,牧場和養(yǎng)殖場中金黃色葡萄球菌的耐藥情況和異質性耐藥流行情況更應該引起重視,以防止耐藥和多重耐藥的廣泛傳播。