捻轉血矛線蟲對伊維菌素的耐藥機制

張艷敏,趙東旭,王文龍*

(1.內蒙古農業大學獸醫學院/農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室,呼和浩特 010010;2.內蒙古大學生命科學學院,呼和浩特 010021)

牛、羊和其他反芻動物采食附著有捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)三期幼蟲(L3)的牧草,從而引起捻轉血矛線蟲病。在畜體內,該蟲通過矛型齒劃破消化道黏膜,以吸食血液為生[1],被感染的動物高度貧血、極度消瘦,甚至死亡[2-3],造成嚴重的經濟損失[4]。捻轉血矛線蟲在全球范圍內廣泛流行至今,仍然是畜牧業的一大難題,對于該病通常是采用化學藥物進行驅蟲治療[5]。但是近年來,國內外大量研究報道H.contortus對阿苯達唑、伊維菌素和左旋咪唑等常用驅蟲藥均產生了耐藥性,甚至出現了多重耐藥性[6]。早期在美國,于1961年已報道H.contortus對苯并咪唑類藥物產生耐藥性,20世紀80年代在澳大利亞發現H.contortus對伊維菌素產生了耐藥性[7],另外新藥物莫奈太爾用來治療H.contortus效果不佳,且也產生了耐藥性[8]。時至今日,耐藥性的研究進展仍未取得重大突破,其他防治方法如中草藥方劑、新藥研制及疫苗預防也有相應的研究進展,但同時伴隨諸多問題,如新藥對宿主的毒性及藥物殘留、疫苗的成品上市時間等,目前還并不能取代伊維菌素、阿苯達唑等常用驅蟲藥的治療方案,所以解決消化道線蟲的主要方案仍然是選擇常用藥進行驅蟲治療。另外,發現關鍵耐藥靶點還可以為藥物改造帶來新的方向,因此解決耐藥性的問題仍然是目前研究方向的重中之重。

1 伊維菌素耐藥基因的相關機制研究

伊維菌素(ivermectin, IVM)作為一種抗寄生蟲藥物,具有廣譜、高效和低毒等特點,對線蟲、節肢動物等體內外寄生蟲均具有良好的驅殺作用。其作用機理主要包括兩個方面,第一種是作用于蟲體神經遞質γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)受體,其亞單位分布于H.contortus的腹部神經索和頭部的部分神經元,引起蟲體運動活力減弱;第二種是通過配體門控氯離子通道(GABA或谷氨酸門控氯離子通道)介導產生麻痹作用,與谷氨酸門控氯離子(Glu-Cl)高度結合,在氯離子膜傳導上是呈現緩慢、不可逆的增加,作用于咽泵,影響蟲體攝食;作用于肌肉組織,使其停留在宿主體內偏好部位能力受限[9-10]。伊維菌素在長期應用過程中,存在不規范使用的現象,導致耐藥蟲株的出現。捻轉血矛線蟲對伊維菌素產生耐藥性在全球范圍均有報道,而且耐藥性的產生越來越嚴重,針對伊維菌素耐藥性機制研究的報道也越來越多,現綜述如下。

1.1 GABA門控Cl-通道與耐藥性

IVM對線蟲神經肌肉系統的影響一直是IVM作用機制研究的重點,在線蟲的神經肌肉系統中,γ-氨基丁酸(GABA)被認為是主要的抑制性神經遞質。因此,神經遞質受體一直是研究的主要對象。GABA門控氯離子通道是伊維菌素的作用部位之一,它的生物學靶點是一種五聚體配體門控離子通道,在線蟲和節肢動物的神經和肌肉細胞中高度表達,但在脊椎動物中不存在。低濃度的伊維菌素不可逆地通過葡萄糖醛酸受體激活Cl-內流[11],改變細胞膜對Cl-的通透性從而阻斷神經肌肉傳導,導致蟲體弛緩性麻痹或饑餓致死[12]。

GABA受體參與伊維菌素耐藥性的產生已經從不同的方向進行了驗證,其中Hco-UNC-49基因及其UNC家族研究眾多,且探索了該基因的分子動力學及其突變結合位點[13-14],可以作為后續探索IVM耐藥性機理及驅蟲藥新靶點的一個重要研究方向。據報道,捻轉血矛線蟲中對伊維菌素敏感基因HG1A和耐藥基因HG1E為兩個等位基因,分別編碼GABA受體的a和c亞基,發現 HG1/GABA-1受體的共表達在耐藥蟲株中對GABA作用發揮呈負相關,即伊維菌素增強了GABA-1/HG1A受體的電流,但減弱了GABA-1/HG1E受體的GABA反應[9]。來自H.contortus的GABA門控Cl-通道的Hco-UNC-49,是秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的神經肌肉受體的正構體,使用雙電極電壓鉗測試了幾種殺蟲劑和幾種驅蟲藥對通道功能的影響,發現Hco-UNC-49通道被氟蟲腈和印防己毒素阻斷,被IVM和莫西菌素適度增效,并被高濃度的哌嗪激活[15-16]。IVM還可抑制C.elagans肌肉的 GABA 和 L-AchR(對左旋咪唑敏感煙堿受體)受體[17]。但是目前發現GABA通道在伊維菌素耐藥性的相關研究報道中,對捻轉血矛線蟲的耐藥性研究似乎到了瓶頸期,而在小鼠或其他物種關于伊維菌素的耐受性報道中,GABA通路的研究更為廣泛新穎。

1.2 谷氨酸門控Cl-通道與耐藥性

IVM可以激活或延緩性麻痹谷氨酸門控的Cl-通道[18],還可以作為谷氨酸的激動劑來增加谷氨酸門控氯離子通道的開放頻率。在低濃度時,可以誘導電流并增加神經遞質;在高濃度時,可以打開離子通道,從而增強細胞膜對氯離子的通透性,最終導致神經傳導受阻,肌肉松弛麻痹。在蠕蟲咽部肌肉的蠕動被阻斷后,蠕蟲的進食受到干擾或阻礙,最終導致饑餓和死亡[19],所以一般認為,IVM對咽部肌肉的麻痹作用是通過谷氨酸門控的氯離子通道受體(GluClRs)實現的。2019年,Atif等[20]在突觸和單體受體水平上研究了H.contortus的GluClRs的不同異構體表達,發現IVM能增強突觸電流的振幅和衰減,并延長了單一受體的活動,表明伊維菌素可以通過與細胞膜相互作用更好地與GluClRs結合。

在許多情況下,耐藥性是高度可遺傳的,在藥物選擇下可能會出現抗蠕蟲藥的進化[21]。與捻轉血矛線蟲敏感蟲株相比,調控伊維菌素耐藥蟲株的谷氨酸門控Cl-通道的基因序列發生了突變,在80～170 bp處有多個突變;192～207 bp處有堿基丟失[22]。后續有研究通過遺傳學研究確定了主要的谷氨酸門控受體基因,這些基因(glc-1、avr-14和avr-15)的聯合突變導致了IVM產生極高的抗性[23]。通過全基因組關聯和連鎖圖譜分析阿維菌素的基礎反應變化,確定了V號染色體上的3個數量性狀基因位置(QTL)[24]。其中一個QTL是由谷氨酸門控氯離子通道基因glc-1的變異引起的,說明該基因glc-1可以作為后續伊維菌素耐藥靶點展開研究。

另外,在探索H.contortus對伊維菌素產生耐藥性的機制中,發現C.elegans可以用于識別耐藥性候選基因。使用近等基因系(NILs)獨立驗證和縮小每個QTL,并使用CRISPR-Cas9技術對候選基因進行測試,在H.contortus的V號染色體上尋找伊維菌素反應QTL的同源基因,發現C.elegans和H.contortus兩個物種的QTL中具有共同的40個基因[24]。所以在研究捻轉血矛線蟲對伊維菌素的耐藥性中,結合模式線蟲進行耐藥基因的共同篩選并驗證,可以增加獲取關鍵基因的概率。此外,由于伊維菌素的作用機制之一是通過配體門控氯離子通道介導使蟲體產生麻痹作用,所以部分研究者認為GABA和Glu之間可能是協同作用參與捻轉血矛線蟲對IVM耐藥性的發生。

1.3 外排轉運蛋白與耐藥性

ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)作為藥物轉運體超家族,其主要功能是排除有害物質、轉運離子和攝取營養物質等[25]。其中,ABC相關轉運蛋白的過度表達參與了伊維菌素耐藥性的產生[26],與H.contortus對伊維菌素敏感蟲株相比,耐藥蟲株Pgp-A基因表現出更高的表達水平[27]。以前研究者普遍認為ABC轉運蛋白可以保護蠕蟲免受伊維菌素等驅蟲藥的侵害[28],然而在幼蟲遷移試驗中,研究者在耐藥蟲株中觀察到IVM藥物暴露反應與之前的報道存在一些差異,這表明在幼蟲中,ABC轉運蛋白基因轉錄水平和外排活性的簡單測量并不一定能表明轉運蛋白途徑能夠保護蠕蟲免受驅蟲劑的傷害。說明ABC轉運蛋白是可以在耐藥中發揮作用,但是不同的mRNA的作用能力有所差異,目前報道的基因還不足以說明該基因在耐藥性產生過程中發揮關鍵作用,可見伊維菌素的抗性是極其復雜的。另外,ABC轉運蛋白在物種內部和不同物種之間的作用能力有所不同。通過比較耐伊維菌素的C.elegans(IVR10)和野生型蟲株(N2)的轉錄水平發現,不同的ABC轉運蛋白可能在調節IVM對蟲體咽泵、運動和產卵量的影響中發揮作用,其中基因mrp-1和基因half-2的下調影響較強。然而,在IVR10蟲株中,相關基因的表達下調對IVM導致蟲體死亡并沒有顯著影響[29]。表明,這些ABC轉運蛋白基因及其產物可能在調控IVM效應中發揮作用,但不是單獨負責IVM抗性的關鍵基因。2021年,Sengthong等[30]建立了圓線蟲IVM耐藥性誘導小鼠模型,發現ABC亞型基因(ABCA、ABCF和ABCG)在IVM耐藥株中的表達水平明顯高于易感株。上述可見外排轉運蛋白確實在不同線蟲對IVM產生耐藥性中發揮作用,尤其在捻轉血矛線蟲對伊維菌素耐藥蟲株中研究最為廣泛,但是目前關于這一可能耐藥機制的相關基因眾多,且調控能力及發揮作用強度仍是未知。

P-糖蛋白 (P-glycoprotein),是ABC轉運體中最具代表性的蛋白。其作為一種跨膜轉運蛋白,以外排泵的方式從細胞中排出疏水性外源物質, 降低了伊維菌素在Glu-Cl受體作用位點的局部藥物濃度[31],同時可以去除線蟲細胞中的有毒分子,在伊維菌素耐藥性中發揮了重要作用[32]。有研究報道Hco-Pgp-16基因可能有助于捻轉血矛線蟲對IVM的耐藥性相關研究[33]。在后續研究中發現,外排轉運蛋白家族Pgp-9系列基因似乎已被證實參與耐藥性的產生,無論是在L3還是成蟲的耐藥性產生中,均發現了Pgp-9基因。在捻轉血矛線蟲耐IVM的L3中,pgp-1、pgp-9.1和pgp-9.2結構性過表達[34]。Kellerov等[35]在2019年發現成年H.contortus中p-gps的構成性表達存在明顯差異,在IVM作用下,雄蟲的pgp-9.2和pgp-10表達均顯著增加。Mate等[26]于2022年發現,與敏感蟲株相比,pgp-9.2基因在耐藥蟲株中的表達有明顯差異,這與之前的報道一致,更進一步表明Pgp-9可能是導致IVM抗性的多基因參與的最相關候選基因之一;同年Pacheco等[36]發現檸檬烯參與了Pgp-9基因的調控,它可以將多重耐藥H.contortus株的IVM活性恢復到敏感蟲株的水平。檸檬烯是柑橘皮的主要化合物之一,如果與IVM聯合使用,既安全又經濟,又會提高IVM對耐藥H.contortus的療效。另外用量不準確的使用IVM對綿羊進行驅蟲也可能會導致耐藥性的發展,因為這個過程它會增加H.contortus成蟲中外排轉運蛋白的表達(同時臨床應用也需要考慮宿主的影響,據報道60 mg·kg-1的槲皮素可從mRNA和蛋白質水平顯著增加大鼠空腸P-gp的表達,降低伊維菌素在大鼠空腸的滲透性[37])。綜上,外排轉運蛋白家族Pgp-9系列基因可以作為今后耐藥性研究的主要方向,繼續探索外排轉運蛋白對耐藥性的影響機制。

1.4 其他相關耐藥機制

捻轉血矛線蟲對藥物敏感性的差異,還與藥物在線蟲體內的擴散和積累有關(藥代動力學)。也有研究認為IVM劑量水平相關療效差異與基因的變異和H.contortus在皺胃內不同位置的藥物積累的潛在差異有關[38]。捻轉血矛線蟲的治療主要使用數量有限的驅蟲藥,然而,這些驅蟲藥的療效還可能會受到在獸醫寄生蟲中和人類寄生蟲中出現的耐藥性的限制[39]。

藥物代謝酶、生物轉化酶以及異物代謝酶(XMEs)調控眾多藥物的生物活性和作用行為,可幫助消除大量潛在有毒的外源性化學物質、去除內源性代謝的有毒副產物以及控制內源性信號分子的水平和分布[40]。其中細胞色素P450、UGTs和GSTs家族作為對有害異生物的主要防御系統[41-42],被認為其有助于耐藥性的研究發展。2020年劉陽[43]通過轉錄組學與蛋白組學關聯分析篩選出可能耐藥基因,并結合RNAi試驗確定了Pgp-9、GST和UGT三個基因與捻轉血矛線蟲對伊維菌素產生耐藥性相關。當然,還有一些研究支持Cyps對IVM抗性具有潛在貢獻, 當使用胡椒基丁醚抑制劑抑制Cyps的活性并同時接觸IVM時,對IVM敏感和耐藥的古柏線蟲和奧斯特線蟲的幼蟲發育會完全被抑制,并且幼蟲遷移明顯減少[44]。CyP450可通過增加酶的表達量、酶活力的改變加快機體對藥物的代謝,使機體產生一定的適應性,從而產生耐藥性[45]。

在伊維菌素耐藥性機制的研究過程中,耐藥基因的確定似乎容易受到地理環境及時間的影響,導致耐藥基因的暫時性與不穩定性。早在2003年,通過對H.contortus的電子顯微鏡分析顯示,與對IVM敏感的線蟲相比,對IVM耐藥的線蟲的纖毛感受器(amphid cilia)更短[46],這充分表明,感受器在線蟲對IVM進入和藥物敏感性中發揮作用。在2014年,一項研究發現不同地理來源的對IVM耐藥的H.contortus和C.elegans中,dyf-7基因是纖毛感受器形成的關鍵,作者還發現了H.contortus的dyf基因與IVM抗性之間存在關聯[47]。長期暴露于大環內酯類莫西菌素的線蟲也會導致感受器缺陷,進一步確定了線蟲感受器與線蟲耐藥性之間的聯系[48]。盡管莫西菌素與IVM同屬于大環內酯類藥物,但莫西菌素屬于米爾貝霉素類,IVM屬于阿維菌素類,莫西菌素目前耐藥性產生不及伊維菌素。后續于2018年Elmahalawy等[49]比較了來自瑞典同一農場的捻轉血矛線蟲在IVM處理前后的dyf-7等位基因的頻率,沒有發現dyf-7與IVM抗性水平之間存在相關性的證據。由此說明,已報道的相關耐藥基因還需進一步證明。

伊維菌素作為幾種配體通道的正變構調節劑,主要包括谷氨酸門控的氯離子通道(Glu-Cl)、γ-氨基丁酸a型受體(GABAA)、甘氨酸受體、神經元α7-煙堿受體和嘌呤能P2X4受體[50]。前兩種通道已被認為可能作為耐藥性產生機制進行廣泛研究,后續研究中發現,其他三種配體通道也參與了IVM對H.contortus不同程度的作用過程。H.contortus基因組顯示出大量的半胱氨酸-環(Cys-loop)家族受體,且被一系列不同的神經遞質和伊維菌素激活,2023年研究者從H.contortus中鑒定出一種Cys-loop受體LGC-39,這是一種新型的膽堿能敏感配體門控Cl-通道,屬于已命名的GGR-1 (GABA/甘氨酸受體-1) Cys-loop受體[51]。另外嵌合受體(包含伊維菌素敏感P2X4R和伊維菌素不敏感P2X2亞基結構域)的試驗證明跨膜結構域在IVM的變構調節中發揮關鍵作用[52]。目前,在Cys-loop受體家族和P2X受體家族中已經確定了幾個變構位點,所以證實了當IVM結合高親和力的結合位點時,即通過增加通道打開的概率來增加反應,降低通道脫敏的概率;而當它結合低親和力的結合位點時,它通過穩定受體的開放構象來增加失活時間[53]。這些受體位點可能代表未來重要的藥物靶點或耐藥研究新方向。

2 伊維菌素耐藥非編碼RNA的相關研究

通過查閱文獻發現近幾年耐藥性的研究進展似乎遇到了瓶頸,盡管已經從多角度[54-57]進行研究,但是截至目前,仍然沒有確切的耐藥機制。由于非編碼RNA研究的崛起,且已被報道參與增殖、凋亡、遷移、侵襲、轉移和耐藥性等各種生物學和病理學過程[58],所以近年來有研究將H.contortus對IVM耐藥性相關研究擴展到非編碼RNA。非編碼 RNA 可分為基礎結構型ncRNA和調控型ncRNA兩種主要類型。根據RNA的長度,調控型ncRNA主要可分為小ncRNA (small ncRNA,18～200 nt)和lncRNA (long ncRNA, >200 nt)[59-61]。那么非編碼RNA在耐藥性相關研究中進展如下。

2.1 miRNA與耐藥性的相關研究

早有研究表明,一些miRNA被認為與耐藥相關,初步認為其可能參與改變ABC外排轉運蛋白的表達[62],而這一耐藥機制也與伊維菌素的耐藥機制之一相似,可見小RNA與IVM的耐藥性有著密不可分的聯系。

通過對節肢動物[63]的藥物抗性的大量研究發現,其涉及多種生物學過程,尤其是miRNA與解毒基因細胞色素p450之間的關系,細胞色素P450在H.contortus對IVM的耐藥性研究中也早有研究報道,但是miRNA在調控關鍵耐藥分子信號通路的作用仍未明確。Gillan等[64]研究了對伊維菌素產生耐藥性的4株H.contortus,分別是來自地理位置不同的2株耐藥蟲株、由易感親本和耐藥親本經多輪回交產生的2株耐藥蟲株。與敏感蟲株相比,4株耐藥蟲株的hco-miR-9551的表達量均顯著增加。2023年溫海峰等[65]利用全轉錄組測序分析,探究H.contortus對IVM敏感蟲株與耐藥蟲株的miRNA差異轉錄譜,篩選出差異顯著的miRNA共375個,其中253個轉錄上調,122 個轉錄下調。有研究發現不同miRNA在H.contortus和C.elagans的蟲體發育不同時期的表達量是不同的[66-67]。說明不同的miRNA在蟲體不同時期參與了機體不同部位的多功能調節,由此可見miRNA在不同物種間無論是生物學過程還是耐藥性產生過程都有不可忽視的作用。

2.2 lncRNA與耐藥性的相關研究

lncRNA參與了捻轉血矛線蟲及節肢動物相關耐藥性的產生過程,并且在解毒或其他毒素相關代謝中發揮一些未知作用。在捻轉血矛線蟲對伊維菌素的耐藥性研究中,僅構建了H.contortus對IVM部分耐藥相關通路的lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡[68]。然而,lncRNA已被揭示與節肢動物的藥物耐藥性機制有關[69],先后有研究者[70-71]發現小菜蛾的lncRNA在對三種不同類型的殺蟲劑(有機磷類、苯吡唑類和Bt類)產生耐藥性時的表達譜發生了改變,這三種殺蟲劑的作用模式分別為滅活乙酰膽堿酯酶、靶向GABA門控的Cl-通道和裂解中腸細胞,其中靶向GABA門控Cl-通道也是H.contortus對IVM產生耐藥性的機制之一。另外在對驅虱藥產生耐藥性的海虱研究中發現,一部分lncRNA通常與藥物反應相關基因(如ABC轉運蛋白、細胞色素p450和谷胱甘肽S-轉移酶等)有很強的轉錄相關性[72-73],后續探討了參與海虱耐藥生物學過程相關的miRNA-lncRNA間的相互作用[74-75]。綜合上述這些研究結果,初步說明lncRNA可能在不同生物產生耐藥性的過程中發揮關鍵作用,也進一步支持lncRNAs可能在不同驅蟲藥耐藥發展中發揮作用的假說[70]。

目前,關于miRNA-lncRNA間的相互作用及如何參與耐藥性的產生證據仍然不足,盡管有研究認為這兩類非編碼RNA可能涉及許多耐藥靶點,后續關于lncRNA-miRNA-mRNA、lncRNA-mRNA等在耐藥性的研究中還需要大量的試驗方法進行支持驗證。另外從遺傳學的角度講,長久的耐藥性是可遺傳的,耐藥蟲株和敏感蟲株的兩組基因或許不同。在生物學研究中,普遍認為DNA轉錄成mRNA,mRNA編碼蛋白質,蛋白質決定表型,但是在RNA的分岔口,還有一群非編碼RNA在起到運輸、抑制、推動和調控等作用。目前,關于伊維菌素的相關耐藥基因及耐藥靶點較多,且其他可能耐藥調節因子還未繼續研究,所以要將目前已報道的IVM耐藥機制相關的mRNA與非編碼RNA相結合,才能更好更快地找出關鍵耐藥基因或耐藥通路。

3 展 望

關于捻轉血矛線蟲對伊維菌素的耐藥性相關研究已經進展多年,且已報道幾種可能耐藥通路及其相關耐藥基因,比如,GABA門控氯離子通道中的UNC-49基因、Glu-Cl中的glc-1基因、外排轉運蛋白中的pgp-9基因和異物代謝細胞色素P450等。從現有研究可知,耐藥性的產生是多基因參與和多途徑調控,但是仍然沒有確定的耐藥機制和耐藥基因。近年來,隨著非編碼RNA在耐藥性相關研究的增多,研究者也意識到單獨研究非編碼RNA在耐藥性中的調控關系是片面的,獨立的針對單一基因或調控因子進行此類機制研究也是不全面的。所以將基因,甚至是多個基因,與非編碼RNA相結合,開展耐藥性機制研究可能是更為合理、更有可能取得突破性進展的研究方案。