鹽霉素體外對豬流行性腹瀉病毒的抑制效果

馬亞娟,蘇 愷,林依丹,王亞文,張亞楠,袁洪興,袁 晨*,宋勤葉*

(1.河北農業大學動物醫學院,保定 071000;2.館陶縣農業農村局,邯鄲 057750)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種腸道傳染性疾病[1],該病毒可感染所有年齡段的豬,但7日齡以內的仔豬最易感,主要引起仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡,發病率和死亡率可高達100%。自2010年以來,PEDV變異毒株引起的仔豬腹瀉呈現新的流行特征,即使免疫過PED疫苗的豬場也未能幸免,給養豬業造成了巨大的經濟損失,因此,當務之急是采取有力的措施加強對PED的防控。

目前PED的防控除了加強飼養管理外,主要以疫苗預防為主,但由于病毒的高變異性,現有疫苗已不能提供足夠的保護力,因此,開發可抑制PEDV感染的藥物迫在眉睫。PEDV與經典冠狀病毒生命周期一致[2-3],該病毒的S蛋白與宿主細胞表面的受體結合并吸附,從而啟動病毒粒子的生命周期[4-5]。PEDV基因組與細胞核糖體結合后翻譯非結構蛋白(non-structural protein 1-16,nsp1-16)和逆轉錄復合物(reverse transcription complex,RTC),不連續的基因組可翻譯結構蛋白:纖突蛋白(spike protein,S蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein,E蛋白)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)和輔助蛋白(ORF3蛋白)。與N蛋白結合的病毒基因組在內質網-高爾基體中間區室(ERGIC)進行組裝并進入含有病毒結構蛋白(S、E和M蛋白)的ERGIC膜,導致成熟病毒體的形成,完成病毒粒子的復制過程,最后病毒粒子經細胞膜以胞吐的方式釋放到細胞外,又可開始新一輪的感染[6]。盡管目前國內外科研者針對PEDV生命周期的不同階段已發現多種能夠抑制PEDV活性的抗病毒藥物,但多數正處于實驗室的研究階段,尚未獲得批準。

鹽霉素(salinomycin,SLM)又名沙利霉素,是1968年首次由日本科研株式會社發現的一元羧酸聚醚類廣譜抗生素[7-8],其對癌癥[9-10]、球蟲原蟲[11]、革蘭陽性細菌和耐藥菌株[12]都具有抑制活性。SLM作用之多的原因可能是因為其可以參與多種信號通路的調節,例如,抑制Wnt/β-catenin信號通路[13]和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[14],啟動細胞的自噬[15],降低三磷酸腺苷(ATP)的水平,促進活性氧(ROS)的產生[16],觸發DNA損傷和預防DNA修復[17],抑制核轉錄因子(NF-κB)信號通路[18]。以上信號通路與病毒感染靶細胞后的增殖密切相關,說明SLM可能是一種抗病毒候選藥物,然而SLM對PEDV的抑制效果尚不清楚。

本研究旨在探索SLM體外對PEDV的抑制效果及其對病毒復制周期的影響,為SLM作為一種新的抗PEDV藥物的開發提供理論支持,并為后期SLM抑制PEDV感染機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和主要試劑

非洲綠猴腎細胞(Vero)、PEDV CV777毒株均由本實驗室保存。MEM培養基購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)、胰酶(TRYPSIN/EDTA)購自Multicell公司;PEDV N蛋白單克隆抗體由本實驗室制備并保存;小鼠抗GAPDH單克隆抗體、ECL化學發光超敏顯色試劑盒購自翌圣公司;HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)購自博奧龍公司;CCK-8試劑盒購自Biosharp公司;2×AugeGreen Master Mix購自UE公司;鹽霉素購自MCE公司。

1.2 病毒滴度的測定

將Vero細胞接種于96孔細胞培養板,置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中,待細胞長到90%后,每孔接種100 μL倍比稀釋(10-2～10-7)的PEDV病毒液,接毒后72 h統計細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)。用Reed-Muench兩式法計算病毒滴度(TCID50)。

1.3 病毒生長曲線的測定

將Vero細胞接種于細胞培養皿,待細胞長到90%,將細胞上清液換為維持液培養12 h,吸出細胞上清液,用0.01 mol·L-1pH 7.2～7.4的PBS洗滌細胞,然后感染0.5 MOI PEDV,對照組加入等量維持液,37 ℃孵育2 h后更換新維持液繼續培養,最后收集感染后1、12、24、48、60 h的病毒液,測定病毒的TCID50。

1.4 RT-qPCR

使用Trizol法提取總RNA,取病毒液和TriQuick Reagent混勻后靜置,加入三氯甲烷分離有機相和無機相,離心后取上清,加入等量異丙醇萃取RNA,使用經DEPC水處理的75%酒精洗去殘留的異丙醇,加入9.5 μL無RNA酶水重懸管底核酸,按試劑盒說明書進行反轉錄后,使用SYBE Green染料法檢測。其中,RT-qPCR反應體系如下:1 μL cDNA,10 μL 2×AugeGreen qPCR Master Mix,上、下游引物各0.5 μL,8 μL無菌純化水。擴增條件為酶激活95 ℃ 120 s;然后采用三步法,即95 ℃ 5 s,56 ℃ 5 s,72 ℃ 25 s,共進行45次循環,每個樣品重復3次。

1.5 免疫印跡(Western blot)

待Vero細胞長滿單層后首先用PEDV感染或SLM處理細胞,然后用預冷的PBS洗滌細胞,再用含有蛋白酶抑制劑混合物的細胞裂解緩沖液裂解,4 ℃離心后收集上清液,加入上樣緩沖液,混勻后105 ℃變性10 min,然后用SDS-PAGE分離蛋白樣品,并轉移到PVDF膜上,再用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫將PVDF膜封閉2 h,然后加入PEDV N蛋白單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)4 ℃孵育過夜,再用TBST洗滌PVDF膜,然后加入HRP-山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育1.5 h,再次洗膜后用ECL發光液檢測目的蛋白。

1.6 間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescent assay,IFA)

將Vero細胞接種于96孔細胞培養板,待單層細胞長到90%后用PBS洗滌細胞并分組,首先用冰冷的甲醇于-20 ℃固定細胞10 min,然后用PBS洗滌,使用2% BSA-PBS溶液37 ℃封閉1 h,然后棄上清,加入PEDV N蛋白單克隆抗體(1∶200)37 ℃孵育1 h,再用PBS洗滌后加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶500)37℃孵育45 min,再次用PBS洗滌后加入DAPI染色溶液(Bisben Iimde)室溫避光顯色,洗滌后拍干,最后用熒光顯微鏡觀察結果并拍照,使用Image J統計陽性細胞率。陽性細胞率(%)=陽性細胞數/總細胞數×100。

1.7 半數細胞毒性濃度(CC50)的測定

待96孔細胞培養板中長滿單層Vero細胞后用PBS洗滌,并分組,然后用不同濃度SLM處理細胞,并設置只含營養液而沒有細胞的孔作為空白對照,繼續培養24 h。根據增強型CCK-8細胞活性試劑盒說明書,每孔加入10 μL工作液后再置于37 ℃孵育1 h,最后使用酶標儀讀取OD450 nm值。

細胞活力(%)=(OD450 nm天然產物孔-OD450 nm空白對照)/(OD450 nm陰性對照-OD450 nm空白對照)×100。將細胞活力與藥物濃度的數據導入到GraphPad Prism 5.0中,使用Analyze下的transform功能,轉換成細胞活力與lg(藥物濃度)的關系,進一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非線性擬合功能,利用log (inhibitor) vs. response-Variable slope (four parameters)選項,得到擬合曲線和CC50值。

1.8 半數抑制濃度(IC50)的測定

待96孔細胞培養板中長滿單層的Vero細胞后用PBS洗滌細胞,然后用不同濃度SLM處理細胞,每個濃度重復8個孔,每孔加入100 μL含有相應SLM濃度的維持液預處理細胞1 h,棄掉孔內液體,再用含有0.2 MOI PEDV和相應SLM濃度的混合液處理細胞1 h,并設置僅含有維持液的陰性對照孔和僅接毒不加藥的陽性對照孔,最后將孔內液體更換為含有相應SLM濃度的維持液繼續培養72 h,肉眼觀察CPE并統計。

抑制率(%)=(1-FL天然產物孔/FL陰性對照)×100。將抑制率與藥物濃度的數據導入到GraphPad Prism 5.0中,使用Analyze下的transform功能,轉換成抑制率與lg(藥物濃度)的關系,進一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非線性擬合功能,利用lg (inhibitor) vs. response-Variable slope (four parameters)選項得到擬合曲線和IC50值。

1.9 SLM對PEDV增殖的抑制作用

將Vero細胞接種于24孔細胞培養板,待長滿單層細胞后,棄上清,用PBS洗滌細胞加入含有不同SLM濃度(0.05、0.5、5 μmol·L-1)的維持液,在37 ℃培養箱預處理細胞1 h,隨后用PBS洗滌細胞,再用0.2 MOI PEDV感染細胞1 h,然后將病毒液更換為含有相應SLM濃度的維持液,繼續培養24 h,收集細胞上清液測定TCID50,提取核酸和蛋白用于測定病毒N基因水平和N蛋白含量,IFA觀察病毒分布并計算陽性細胞率。

1.10 SLM對PEDV復制周期的影響

1.10.1 SLM對病毒粒子的作用 將Vero細胞接種于12孔細胞培養板,待細胞長到90%后,將以下四管溶液(A:0.2 MOI PEDV和5 μmol·L-1SLM混合液,B:0.2 MOI PEDV稀釋液,C:維持液,D:5 μmol·L-1SLM稀釋液)各設置兩組,分別放置在培養箱中作用3 h和5 h,將以上溶液接種于Vero細胞,然后置于37 ℃孵育1 h,用PBS洗滌細胞,再加入維持液繼續培養12 h,然后收集病毒液,提取核酸,RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的高低,判斷SLM是否對PEDV病毒粒子具有直接滅活作用。

1.10.2 SLM對病毒吸附的影響 將Vero細胞接種到12孔細胞培養板,待細胞長到90%后,用含有0或5 μmol·L-1SLM的維持液在37 ℃預處理細胞1 h,然后用含有0.2 MOI PEDV和相應SLM濃度的混合液在4 ℃處理細胞15、30和60 min,再用冰冷的PBS洗滌后收集細胞,提取核酸,使用RT-qPCR檢測細胞中PEDVN基因的mRNA水平。通過比較同一時間段SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低,判斷SLM是否影響病毒的吸附。

1.10.3 SLM對病毒入胞的影響 將Vero細胞接種到12孔細胞培養板,待細胞長到90%后,首先將細胞板放入4 ℃預冷,然后用0.2 MOI PEDV在4 ℃感染細胞2 h,再更換含有0或5 μmol·L-1SLM的維持液,37 ℃繼續孵育0.5、1和 2 h,用預冷的PBS洗滌細胞,以去除未入胞的病毒,最后收集細胞,提取核酸,使用RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低,判斷SLM是否影響PEDV的入胞。

1.10.4 SLM對病毒復制的影響 將Vero細胞接種于12孔細胞培養板,待細胞長到90%后,將細胞上清液更換為含有0.2 MOI PEDV的維持液,在37 ℃培養箱中孵育1 h,用PBS洗滌細胞后補充維持液,繼續在37 ℃培養箱中培養,在接毒后4 h將培養基更換為含有0或5 μmol·L-1SLM的維持液,置于37 ℃繼續孵育2、4和6 h,然后用PBS洗滌細胞,收集細胞后提取RNA,并反轉錄成cDNA,RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低,判斷SLM是否影響病毒的復制。

1.10.5 SLM對病毒釋放的影響 將Vero細胞接種于12孔細胞培養板中,待細胞長到90%后,用0.2 MOI PEDV在37 ℃感染細胞1 h,然后更換為維持液繼續培養10 h,再將培養基更換為含有0或5 μmol·L-1SLM的維持液繼續孵育0.5、1和2 h后收集樣品,提取核酸,RT-qPCR檢測PEDVN基因的mRNA水平。通過比較SLM處理組與PEDV感染組的PEDVN基因mRNA水平的相對高低,判斷SLM是否影響PEDV的釋放。

1.11 統計學分析

所有試驗至少重復3次,使用SPSS 26軟件對數據進行統計分析,并使用GraphPad Prism 5.0軟件作圖,結果表示為平均值±標準偏差。使用單因素方差分析(ANOVA)檢查組間差異的統計顯著性。圖中星號表示有顯著差異(*.P<0.05表示差異顯著;**.P<0.01表示差異非常顯著;***.P<0.001表示差異極顯著;ns代表差異不顯著)。

2 結 果

2.1 PEDV的TCID50及其在Vero細胞上的生長曲線

用Reed-Muench兩式法測定PEDV感染Vero細胞不同時間的TCID50,繪制病毒生長曲線,結果如圖1所示,PEDV感染細胞后24 h病毒滴度最高,約107.7·0.1 mL-1,隨后病毒滴度緩慢下降,感染后60 h的TCID50約107.2·0.1 mL-1。

圖1 PEDV在Vero細胞上的生長曲線Fig.1 Growth curve of PEDV on Vero cells

2.2 CC50和IC50

為了確定后期試驗所使用的SLM濃度,首先使用CCK-8試劑盒測定不同SLM濃度下的細胞活力,結果表明SLM的CC50為7.698 μmol·L-1(圖2A);經統計不同濃度SLM處理組的CPE,結果表明SLM對PEDV的IC50為1.617 μmol·L-1(圖2B)。同時,經CCK-8試劑盒測定所用SLM濃度(0.05、0.5、5 μmol·L-1)處理后的細胞活力,結果如圖2C所示,以上濃度的SLM對Vero細胞活力無影響。

A. CC50的測定;B. IC50的測定;C. SLM對Vero細胞活力的影響A. Determination of CC50; B. Determination of IC50;C. Effects of SLM on Vero cell viability圖2 SLM對Vero和PEDV的影響Fig.2 The impact of SLM on Vero and PEDV

2.3 SLM對PEDV增殖的抑制作用

如圖3A所示,為PEDV感染和SLM作用示意圖,為了進一步確認SLM對PEDV增殖的影響,使用RT-qPCR、病毒滴度測定、Western blot、IFA多種技術進行檢測。Western blot和RT-qPCR結果顯示,與PEDV感染組相比,SLM能夠顯著降低PEDV N蛋白和N基因的表達和轉錄(P<0.01)

(圖3B和C)。病毒滴度的結果顯示,與PEDV感染組相比,SLM可以顯著降低病毒含量(P<0.01)(圖3D)。IFA的結果表明,PEDV感染組的綠色陽性細胞最多,而隨著SLM含量的增加,陽性細胞逐漸減少(圖3E);與PEDV感染組相比,不同濃度SLM(0.05、0.5、5 μmol·L-1)處理組的陽性細胞率均顯著降低,且差異極顯著(P<0.001)(圖3F)。

2.4 SLM對PEDV復制周期的影響

2.4.1 SLM不能直接作用于PEDV SLM和PEDV直接作用的方式如圖4A所示,RT-qPCR測定各組的核酸含量并進行統計學分析,結果如圖4B所示,分別比較SLM與PEDV作用不同時間段后的結果,SLM處理組與PEDV感染組的病毒mRNA水平在統計學上差異不顯著(P>0.05),表明SLM不能直接作用于PEDV。

A. 病毒感染和藥物作用示意圖;B. RT-qPCR檢測PEDV感染和SLM處理后N基因水平A. Schematic diagram of viral infection and drug action;nB. The N gene level was detected by RT-qPCR after PEDV infection and SLM treatment圖4 SLM對PEDV病毒粒子的影響Fig.4 Effect of SLM on PEDV

2.4.2 SLM不影響PEDV吸附 SLM作用于PEDV吸附階段的過程如圖5A所示,在病毒吸附的同時加入SLM,孵育相應的時間后SLM處理組與PEDV感染組相比,PEDVN基因mRNA水平沒有顯著差異(P>0.05)(圖5B),表明SLM對PEDV的吸附沒有顯著影響。

A. 病毒感染和藥物作用示意圖;B. RT-qPCR檢測PEDV吸附階段加入SLM后PEDV N基因水平A. Schematic diagram of viral infection and drug action; B. The PEDV N gene level was detected by RT-qPCR after the addition of SLM in PEDV adsorption stage圖5 SLM對PEDV吸附Vero細胞的影響Fig.5 Effect of SLM on PEDV adsorption of Vero cells

2.4.3 SLM不影響PEDV入胞 如圖6A所示,在PEDV入侵細胞階段加入SLM,孵育相應的時間后SLM處理組與PEDV感染組相比,細胞內PEDVN基因mRNA水平無顯著差異(P>0.05)(圖6B),表明SLM對PEDV的入胞沒有顯著影響。

A. 病毒感染和藥物作用示意圖;B. RT-qPCR檢測PEDV入胞階段加入SLM后PEDV N基因水平A. Schematic diagram of viral infection and drug action; B. The PEDV N gene level was detected by RT-qPCR after the addition of SLM in PEDV entry stage圖6 SLM對PEDV入侵Vero細胞的影響Fig.6 Effect of SLM on PEDV entry Vero cells

2.4.4 SLM抑制PEDV復制階段 SLM作用于PEDV復制階段的過程如圖7A所示,在病毒復制階段加入SLM,孵育4或6 h后,SLM處理組與PEDV感染組之間PEDVN基因的mRNA水平差異顯著(P<0.05)(圖7B),病毒滴度的結果表明在病毒復制階段加入SLM可以顯著降低細胞內病毒粒子的數量(P<0.05)(圖7C),以上結果均表明SLM影響PEDV的復制階段。

A. 病毒感染和藥物作用示意圖;B. RT-qPCR檢測PEDV復制階段加入SLM后PEDV N基因水平;C. 病毒粒子釋放水平A. Schematic diagram of viral infection and drug action; B. The N gene level was detected by RT-qPCR after the addition of SLM in PEDV replication stage; C. Level of virion release圖7 SLM對PEDV在Vero細胞中復制的影響Fig.7 Effect of SLM on PEDV replication in Vero cells

2.4.5 SLM不影響PEDV釋放 如圖8A所示,在PEDV釋放階段加入SLM,孵育相應時間后SLM處理組與PEDV感染組之間的病毒含量沒有顯著差異(P>0.05)(圖8B),表明SLM對PEDV的釋放沒有顯著影響。

A. 病毒感染和藥物作用示意圖;B. RT-qPCR檢測PEDV釋放階段加入SLM后N基因水平A. Schematic diagram of viral infection and drug action; B. The N gene level was detected by RT-qPCR after the addition of SLM in PEDV release stage圖8 SLM對PEDV從Vero細胞釋放的影響Fig.8 Effect of SLM on PEDV release from Vero cells

3 討 論

PED一直是困擾養豬業的一大問題,盡管疫苗免疫是防控PEDV感染的有效措施,但隨著PEDV變異株的出現,經典PEDV毒株的疫苗根本無法控制新毒株的致病性[19]。同時臨床上尚無治療PEDV感染的特效藥,但現已發現有效的抗病毒藥物可以在預防性治療中發揮重要作用,因此,臨床上迫切需要開發抗PEDV藥物。回顧文獻可知,PEDV吸附和侵入靶細胞的時間為30～60 min,PEDV侵入細胞完成一個生命周期大約需要6 h[20]。已有研究者針對病毒感染過程中的各個階段篩選或設計了新型抗病毒藥物。例如,槲皮素(quercetin)可以通過抑制PEDV 3C樣蛋白酶(3C-like protease,3CLpro)的活性來抑制PEDV在Vero細胞中的復制[21],甘草中的甘草甜素(glycyrrhizin,GLY)提取物可以通過依賴HMGB1/TLR4-MAPK p38途徑來阻止高遷移率族蛋白B1(HMGB1)與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的結合,從而抑制PEDV的感染[22]。金雞寧(cinchonine)可以對PEDV生命周期的早期階段表現出顯著的抗病毒活性[23],醉魚草皂苷(buddlejasaponin) IVb主要抑制PEDV的復制和釋放階段[24],表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-Gallate)可以抑制PEDV吸附、入侵和復制等生命環節[25],Griffithsin通過抑制PEDV的吸附來抑制病毒的感染[26],番茄堿(tomatidine)可通過靶向3CLpro并抑制其蛋白活性來減少PEDV的復制[27]。在本研究中,作者發現SLM以劑量依賴的方式顯著抑制PEDV的復制,基于病毒生命周期篩選抗病毒藥物,為其后期抗病毒機制的研究奠定了基礎。

藥物對病毒的抑制作用不僅與藥物作用機制有關,還與病毒增殖特性有關。SLM對甲型和乙型流感病毒表現出一致的抑制作用,其主要作用于流感病毒生命周期的早期階段,在流感病毒侵入過程中限制了病毒核蛋白(NP)的核遷移,進而破壞內體酸化。同時SLM能夠阻斷病毒基質蛋白2(M2)的質子通道活性,因此,SLM可以通過影響流感病毒脫殼的關鍵步驟進而抑制病毒增殖[28]。PEDV與流感病毒同屬于RNA病毒,其復制過程相似,SLM是否也通過該機制抑制PEDV增殖還有待探究。Wnt/β-catenin信號通路屬于Wnt經典信號通路,該通路在細胞遷移、遺傳穩定性和凋亡中具有重要作用[29-30]。據報道,多種病毒在感染宿主細胞后均可激活Wnt/β-catenin信號通路,使β-catenin的含量增加,進而影響病毒的增殖[31]。Zhu等[32]發現,當β-catenin的含量受到抑制后,可降低牛皰疹Ⅰ型病毒(BoHV-1)的增殖。左葉雯[31]研究發現細胞內β-catenin表達量增加后,進而抑制N蛋白的表達發揮抗PEDV的作用。SLM是Wnt/β-catenin信號傳導的有效抑制劑,可以通過阻斷Wnt/β-catenin通路抑制腫瘤的生長[33],因此,SLM可能通過調控β-catenin發揮抗病毒作用。

PEDV屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬,目前治療冠狀病毒感染的藥物主要包括廣譜抗病毒藥、靶向病毒核酸的抗病毒藥和靶向病毒關鍵復制酶的抗病毒藥等。聚醚離子載體屬于廣譜抗病毒藥,據報道,其對人體免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)[12]、流感病毒(influenza virus,IV)[28]、寨卡病毒(Zika virus,ZV)[34]和嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)[35-37]具有抗病毒活性。SLM是一種聚醚離子載體類的廣譜抗生素,已經是歐洲食品和藥品管理局(EFSA和EMEA)批準用于動物飼料的藥物,在正常的喂養劑量下,SLM不會在動物中引起明顯的異常,在動物的治療水平上通常是安全有效的[38]。SLM常用于動物飼料中,以預防球蟲病,提高家禽和牛的飼料效率,還可作為仔豬、育肥豬的新一代離子型促生長劑,其作用機制主要是通過干擾有害微生物,進而改善飼料轉化率,提高營養物質的吸收,SLM對動物機體來說是相對安全的,嚴格控制其用量即可發揮預防疾病的作用,方便臨床應用[38-39]。與開發新的抗病毒治療化合物相比,藥物再利用是一種有價值的戰略,因為其成本更低,審批時間更快。因此,選取SLM作為PEDV的治療藥物進行研究大大縮短了新藥研發周期,節省了人力、物力、財力。

本研究以PEDV感染Vero細胞為體外模型,在病毒生命周期的吸附、入侵、復制和釋放四個不同階段添加SLM,發現SLM顯著抑制PEDV在Vero細胞中復制的過程,而對病毒吸附、入侵和釋放階段沒有顯著的影響。此外,SLM體外抑制PEDV復制的機制和SLM在體內的抗PEDV效果需進一步探討。本研究結果為PEDV的防治提供新的策略。

4 結 論

SLM以劑量依賴的方式顯著抑制PEDV在Vero細胞上的增殖,并且其主要作用于PEDV的復制階段,而對PEDV的吸附、入侵和釋放階段沒有顯著影響。