基于牛結節性皮膚病病毒ORF61基因熒光定量檢測方法的建立

馬春玲,任善會,楊 雪,藺玉剛,李積雲,王相偉,殷相平,孫躍峰,萬學瑞,陳豪泰

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所,蘭州 730046;2.甘肅農業大學,蘭州 730070;3.塔里木大學,阿拉爾 843300;4.青海省科學技術信息研究所,西寧 810003)

牛結節性皮膚病(lumpy skin disease,LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CaPV)中的成員牛結節性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)引起的一種牛的急性、亞急性傳染病[1]。LSDV主要的傳播途徑是通過蚊蟲叮咬和機械性接觸,主要會引起牛的頭、頸、肩和乳房等處發生炎癥反應,并引起牛發熱、丘疹或皮膚結節,嚴重時形成膿皰狀損傷,以及組織會發生壞死結痂。

牛結節性皮膚病(LSD)傳染性較強,不同品種的牛中均可見發病,發病率一般在2%～45%,發病牛會出現發燒,皮膚、黏膜和內臟會出現結節等臨床癥狀,嚴重時會出現死亡病癥,死亡率高達10%[2]。在該病流行的國家和地區,其易感動物及動物源性產品出口會受到世界各貿易國的嚴格限制,對當地畜牧業經濟的發展影響巨大[3]。目前,針對LSD主要采用疫苗預防控制,動物感染后尚無特異性藥物可治療[4],因此盡早檢出病毒,對傳染源進行隔離撲殺,是防制LSD的有效方法。

由于LSDV與綿羊痘病毒和山羊痘病毒的基因組序列相似性極高,所以在檢測過程中很難區分[5],雖然兩者宿主范圍不同,但動物感染后會出現發熱、皮膚結節等類似癥狀,以上因素影響了對LSDV的準確診斷[6]。目前,LSDV一般用常規的檢測方法,例如病毒中和試驗、病毒分離與鑒定技術、血清學檢測技術等[7],但是常規的檢測方法檢出速度慢、準確性低以及對樣本要求高,尤其對早期發病動物不能做到有效的診斷,易于造成疫病的擴散與傳播[8-9]。趙鐘毅等[10]建立的LSDV雙重熒光定量PCR方法,最低檢出限為15拷貝·μL-1;聶福平等[11]建立了基于TaqMan MGB熒光定量PCR技術的羊痘病毒屬多重熒光定量PCR方法,對LSDV的最低檢測限為14.8拷貝·μL-1;Agianniotaki等[12]基于GPCR基因建立了LSDV的雙探針qPCR方法,最低檢測限均為8拷貝·μL-1;Das等[13]建立的兩種羊痘病毒屬通用型qPCR檢測方法,最低檢測限為10拷貝·μL-1;南文龍等[14]建立了一種區別LSDV、山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)和綿羊痘病毒(sheeppox virus, SPPV)的三重實時熒光定量PCR方法,主要應用于三種病毒的核酸區分。為了能夠更加快速、準確、高效地檢測出LSDV,預防LSD的發生以及避免疫病傳播造成經濟損失,建立一種更靈敏、更高效的檢測方法對LSD防控具有重要的臨床應用意義[15-16]。

本研究中,基于國內流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株全基因組序列分析,參考qPCR引物設計的基本原則,作者最終設計了靶向于LSDV ORF61基因的3對qPCR引物。通過優化PCR反應條件及驗證引物特異性、敏感性和重復性,最終篩選到靶向于ORF61基因的LSDV1 qPCR引物,建立了更為靈敏的LSDV的qPCR檢測方法,為LSD預防和控制提供了一種有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要病毒和試劑

LSDV毒株(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)、羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒由蘭州獸醫研究所草食動物病毒病創新團隊分離與保存。上述所有病毒經過支原體檢測,結果呈現陰性。

胎牛血清(FBS),諾萊和上海逍鵬生物有限公司(貨號:CF602/C04001-500)產品;DMEM培養基,健碩生物科技有限公司(貨號:66001-20012)產品;無鈣鎂PBS緩沖液購自上海逍鵬生物科技有限公司(Viva cell)(貨號:C3593);支原體檢測試劑盒購自上海翊圣生物有限公司(貨號:40601ES20);Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) qPCR購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司(貨號:11201ES03);Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號:P505d1);快速克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(貨號:C112);TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天跟生化科技有限公司(貨號:DP315);瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自OMEGA(貨號:D2500-02)。

1.2 引物和探針的設計與合成

根據LSDV/FJ/CHA/2021毒株核苷酸全基因序列(GenBank登錄號:OP752701),利用INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(IDT)(https://sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest?returnurl=%2FPrimerQuest%2F)在線網站,優化設計了3對帶有MGB探針的熒光定量PCR引物(LSDV1、LSDV2和LSDV3),該三對引物均特異性靶向ORF61基因(表1)。根據引物的特異性和靈敏性特點,作者選擇了其中特性最優的LSDV1熒光定量PCR引物進行后續試驗,如圖1所示,LSDV1 qPCR引物在LSDV ORF61基因中的位置。同時,作者設計了一對普通PCR引物LSDV4(表1),用于擴增LSDV ORF61基因,用于后續構建標準的陽性質粒。

圖1 LSDV 1熒光定量PCR引物靶向ORF61基因位置示意圖Fig.1 The diagram of the LSDV 1 qPCR primer targeted ORF61 gene

表1 引物信息Table 1 The primer sequence used in this study

1.3 DNA的提取及標準重組質粒的構建

采用TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取LSDV樣品的總DNA,30 μL洗脫緩沖液洗脫DNA,測量濃度后-20 ℃保存。以LSDV DNA為模板進行普通PCR擴增,反應體系:cDNA 1 μL,上、下游引物各2 μL,2×phanta Max Buffer 25 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,dNTP Mix 1 μL,ddH2O 18 μL,總反應體積50 μL。反應條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,34個循環;72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用膠回收試劑盒(Omega Gel Extration Kit)回收符合預期大小的目的片段,產物置于-20 ℃保存備用。

將pCAGGS空載用EcoRⅠ和KpnⅠ酶進行雙酶切,雙酶切體系:10×rCutsmart Buffer 5 μL,pCAGGS 2 μg,EcoRⅠ1 μL,KpnⅠ 1 μL,ddH2O 41 μL,總體積50 μL,37 ℃水浴鍋3 h,1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠鑒定并膠回收;酶切的空載pCAGGS與目的片段連接,采用同源重組的方法,用連接酶按照空載Vector∶目的片段=1∶3連接,10 μL反應體系:5×CE Multis Buffer 2 μL,Exnase Multis 1 μL,空載1 μL,目的片段3 μL,dd H2O 3 μL。見表5,根據ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒,置于37 ℃ PCR儀器中,連接1 h得到連接產物。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中,在含有氨芐抗性的瓊脂平板培養基上均勻涂布培養,12～18 h后挑取單個陽性菌,用含有氨芐抗性的培養基37 ℃過夜培養。經菌液PCR鑒定后用質粒小提試劑盒說明書提取質粒,測量其重組質粒 D260/D280 值及濃度的大小并將符合要求的樣品送測,將測序正確的重組質粒命名為pCAGGS-LSDV-ORF61。獲得檢測方法的標準品,根據計算公式:質粒拷貝數(拷貝·μL-1)=(質粒濃度×10-9×稀釋倍數×6.02×1023)/(660道爾頓/堿基×堿基數),將標準質粒濃度換算成拷貝數。

1.4 熒光定量PCR方法的建立及條件的優化

采用 Premix ExTaq(Probe qPCR)試劑盒進行試驗。采用20 μL反應體系,根據控制變量法優化體系中的模板量(0.5～2.0 μL,以0.5 μL為1個梯度),引物和探針的使用量(0.4、0.6、0.8和1.0 μL)依次進行優化處理,篩選出最佳的模板、引物和探針組合(20 μL反應體系:cDNA 1 μL,上、下游引物各0.8 μL,SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL,MGB探針0.8 μL,Free Water 6.6 μL),并對退火溫度(54、56、58、60和62 ℃)進行優化,確定熒光定量最佳反應條件,在60 ℃的條件下進行qPCR檢測(表2)。

表2 qPCR反應條件Table 2 The reaction conditions of a qRT-PCR

1.5 熒光定量PCR標準曲線的繪制

將構建的重組質粒10倍倍比稀釋,選取6.71×101～6.71×1010拷貝·μL-1為模板,利用已優化的反應體系及條件擴增,每個梯度設3個重復,ddH2O為陰性對照,取3個重復梯度的平均Ct值,以重組質粒標準品拷貝數的對數值為橫坐標,以測得的平均Ct值為縱坐標,繪制標準曲線并計算相關系數。

1.6 熒光定量PCR特異性試驗

提取羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA,將已經稀釋的陽性標準品以1×107拷貝·μL-1標準陽性質粒為陽性對照,分別以陽性質粒、羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒DNA為模板,以ddH2O作為試驗的陰性對照,按照最佳的反應體系及條件,驗證該方法的特異性的擴增能力。

1.7 熒光定量PCR敏感性試驗

將構建的LSDV標準品陽性質粒10倍倍比稀釋,取濃度為6.71×100～6.71×108拷貝·μL-1作為模板,共取9梯度,每個濃度3個重復,ddH2O為陰性對照,以優化反應體系和條件進行熒光定量PCR敏感性試驗的檢測。

1.8 熒光定量PCR重復性試驗

對不同濃度的陽性重組質粒進行組內和組間熒光定量PCR檢測。同一批次的以6.71×107、6.71×106和6.71×105拷貝·μL-1作為模板,每個濃度設3次組內重復。以6.71×107、6.71×106和6.71×105拷貝·μL-1在不同批次稀釋的樣品進行組間檢測,每個濃度設3次組間重復。以此來評估不同濃度重組質粒組內與組間發生的變異情況,通過其變異系數(CV)來反映方法的穩定性與可重復性。

1.9 臨床樣品的檢測

隨機選取30份由中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物病毒病創新團隊實驗室采集保存的疑似LSDV陽性樣品,其中,皮膚組織樣品15份,鼻咽拭子樣品10份,抗凝血清樣品5份,利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取基因組DNA并測量其濃度大小,利用建立的方法開展LSDV樣品檢測,同時采用《牛結節性皮膚病診斷技術》(GB/T 39602—2020)推薦通用LSDV熒光定量PCR檢測方法作為對照來評估建立的檢測方法[17]。

1.10 生物安全聲明

LSDV相關試驗均在中國農業科學院蘭州獸醫研究所完成,整個試驗過程,嚴格按照中國農業科學院蘭州獸醫研究所的3級生物安全實驗室的操作指南進行。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增

使用本研究設計的PCR引物對靶向ORF61的LSDV的普通PCR擴增結果顯示,目的基因擴增產物大小為783 bp,與預期大小一致(圖2)。將擴增產物膠回收,利用同源重組的方法,克隆于pCAGGS空載,構建出重組質粒標準品pCAGGS-LSDV-ORF61,利用紫外分光光度計測定其濃度為575.5 ng·μL-1,計算拷貝數6.71×1011拷貝·μL-1,成功構建出重組質粒標準品。

圖2 LSDV ORF61基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification result of LSDV ORF61 gene

2.2 熒光定量PCR標準曲線建立

以濃度為6.71×1010～6.71×101拷貝·μL-1的重組質粒標準品作為模板,按照已經優化的反應體系和條件,使用篩選出的LSDV1 qPCR引物,進行熒光定量PCR。如圖3A,LSDV1 qPCR引物靶向于不同LSDV毒株,具有較高的結合特性。如圖3B,LSDV1 qPCR引物擴增曲線的結果表明該引物具有較高的靈敏性。同時,以重組質粒標準品拷貝數的對數值為橫坐標,以測得的平均Ct值為縱坐標繪制標準曲線(圖3C)。熒光定量PCR標準曲線結果顯示,在濃度6.71×1010～6.71×102拷貝·μL-1標準品與平均Ct值呈現出良好的線性關系,線性相關系數R2=0.998 6,標準曲線y=-3.287 5x+47.87,而且從熔解曲線峰單一,平均溫度為77.5 ℃,證明引物具有良好的特異性,根據公式E=10-1/斜率-1計算,擴增效率為101%。

A. LSDV1 qPCR引物序列比對;B. pCAGGS-LSDV-ORF61的擴增曲線;C. pCAGGS-LSDV-ORF61的標準曲線A. The sequence alignment of LSDV1 qPCR primer; B. Amplification curve of pCAGGS-LSDV-ORF61; C. Standard curve of pCAGGS-LSDV-ORF61圖3 靶向LSDV ORF61基因LSDV1 qPCR引物標準曲線的建立Fig.3 The construction of the standard curve of LSDV1 qPCR primer targeted the LSDV ORF61 gene

2.3 熒光定量PCR引物特異性試驗

采用優化后的熒光定量PCR方法對LSDV陽性標準品及羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒基因組DNA為模板進行擴增,ddH2O為陰性對照,結果顯示,該方法能擴增LSDV標準品基因組DNA,有特異性的擴增曲線,而對于羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒基因組和陰性對照無擴增信號(圖4),上述結果表明本研究建立的檢測方法特異性良好。

A. 病毒基因組DNA擴增曲線;B. 病毒基因組DNA熔解曲線;1. pCAGGS-LSDV ORF61 1×107 拷貝·μL-1;2. 其他病毒基因組DNA及陰性對照A. Viral genome DNA amplification curve; B. Viral genomic DNA dissolution curve; 1. pCAGGS-LSDV ORF61 1×107 copies·μL-1; 2. Other viral genomic DNA and negative control圖4 熒光定量PCR特異性試驗Fig.4 The specificity of fluorescence quantitative PCR

2.4 熒光定量PCR引物敏感性試驗

將重組質粒標準品10倍倍比稀釋后以質粒濃度6.71×108～6.71×100拷貝·μL-1作為模板熒光定量PCR擴增如圖5所示,結果顯示,重組質粒標準品均能擴增出有效的擴增曲線,所有梯度均可檢測到熒光信號,并且最低有效檢測量為6.71×100拷貝·μL-1,表明建立的方法敏感性較高。

1. pCAGGS-LSDV ORF61拷貝數為6.71×108～6.71×100 拷貝·μL-1;2. 陰性對照1. pCAGGS-LSDV ORF61 copies ranged from 6.71×108 to 6.71×100 copies·μL-1; 2. Negative control圖5 熒光定量PCR引物敏感性試驗Fig.5 The sensitivity test of fluorescence quantitative PCR primer

2.5 熒光定量PCR引物重復性試驗

利用熒光定量PCR的方法對不同批次和不同濃度的進行組內和組間檢測,以6.71×107、6.71×106、6.71×105拷貝·μL-1在不同批次稀釋的樣品進行3次檢測,結果如表3所示,批次內與批次間重復性試驗結果的變異系數小于2%。

表3 熒光定量PCR引物重復性分析Table 3 the repeatability analysis of fluorescence quantitative PCR primer

2.6 臨床樣品檢測

通過對疑似LSDV陽性臨床樣品進行檢測,作者建立的熒光定量PCR檢測出陽性樣品總數19份,陰性樣品11份。相比下,推薦通用方法檢測陽性樣品17份,陰性樣品13份,與對照檢測方法相比其中鼻咽拭子與抗凝血清中檢測結果一致,結果不一致樣品有2份,經測序鑒定為LSDV陽性樣品,檢測樣品平均Ct值結果如表4所示。以上結果表明研究建立的檢測方法特異性強、敏感性高,適用于LSDV的臨床樣品鑒別檢測。

3 討 論

熒光定量PCR檢測方法相比傳統的檢測方法具有靈敏度高、反應快速、重復性好、特異性強等優點,利用熒光定量PCR方法解決常規檢測中出現的不足,也對流行病調查與檢測具有重要的意義[12]。

本研究中,基于LSDV/FJ/CHA/2021毒株全基因組序列,參照qPCR引物設計原則,利用IDT在線qPCR引物設計網站,設計出3對靶向LSDV ORF61基因的qPCR引物序列,經后續引物特異性、靈敏性和反應性分析,成功篩選到靶向ORF61基因的LSDV1 qPCR引物,建立了更為靈敏的LSDV的qPCR檢測方法。

LSDV基因組約151 kb編碼156個蛋白,有156個ORFs,研究發現SPPV和GTPV基因組在LSDV中均能找到,但LSDV中有額外基因,該基因在SPPV和GTPV中是非功能性的[18],可能與LSDV的宿主特異性有關[19]。由于LSDV與GTPV、SPPV、VACV、傳染性膿皰性皮炎病毒等均會呈現不同程度的交叉反應[20],采用熒光定量PCR方法對LSDV檢測比傳統的PCR方法更為靈敏,可以對LSDV進行快速和高通量的測定,進而來區分GTPV、SPPV與LSDV[21]。本研究選擇LSDV靶向ORF61高度保守區域設計并篩選出引物和探針的最佳組合(LSDV1 qPCR引物),建立了特異性針對LSDV的Taq Man MGB熒光定量PCR方法,靈敏度較高,反應特性良好。本研究中,敏感性試驗結果顯示,該qPCR引物最低檢測限為6.71拷貝·μL-1。該引物能夠有效地擴增LSDV病毒基因組,不能擴增出羊口瘡病毒、口蹄疫病毒和小反芻獸疫病毒基因組,引物特異性良好。同時,臨床樣品重復性試驗中批次內與批次間重復性結果的變異系數均小于2%。檢測隨機抽取30份臨床樣品,利用qPCR引物檢出LSDV核酸陽性樣品19份,相比于推薦通用檢測方法檢出率高7%,表明所建立的熒光定量檢測方法敏感性高、重復性好。

該熒光定量PCR方法的建立不僅為LSDV區別于其他病毒的檢測提供新的檢測方法與手段,而且也彌補了LSDV實驗室檢測技術中出現的不足,對LSDV的流行病學調查分析、疫病防控及感染LSDV后的診斷提供了技術支持。

4 結 論

本研究篩選出一對靶向LSDV ORF61基因的帶有MGB探針的熒光定量PCR引物,成功建立了針對LSDV敏感性高、重復性好、特異性強的特定熒光定量PCR檢測方法,為LSDV的精準防控提供了快速有效的技術手段。