基于EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路探討鱉甲煎丸對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞皮下瘤的抑瘤作用

〔摘要〕 目的 基于表皮生長因子受體（epidermal growth factior receptor， EGFR）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）信號(hào)通路探究鱉甲煎丸對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞皮下瘤的抑瘤作用及作用機(jī)制。方法 選取30只雄性BLAB/c裸鼠，建立MHCC-97H肝癌細(xì)胞皮下瘤模型。造模成功后隨機(jī)分為模型組，鱉甲煎丸低、中、高劑量組（0.55、1.1、2.2 g/kg），西藥組（樂伐替尼4 mg/kg+吉非替尼80 mg/kg），每組6只。鱉甲煎丸低、中、高劑量組灌胃2次/d，西藥組每周灌胃5 d，模型組予以等量生理鹽水2次/d灌胃，每組連續(xù)干預(yù)2周。觀察大鼠一般情況；計(jì)算各組大鼠抑瘤率；HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)變化；RT-qPCR檢測瘤體組織中EGFR、絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測EGFR、磷酸化的EGFR（p-EGFR）、MEK、磷酸化的MEK（p-MEK）、ERK1、ERK2、磷酸化的ERK1/2（p-ERK1/2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、細(xì)胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，Cyclin D1）、神經(jīng)型鈣黏附蛋白（N-cadherin）、上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組及西藥組精神、反應(yīng)、進(jìn)食飲水等情況均明顯改善。與第0天比較，各組第14天體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）。與模型組、鱉甲煎丸低劑量組比較，鱉甲煎丸中、高劑量組和西藥組瘤體質(zhì)量減輕（P＜0.05，P＜0.01）。鱉甲煎丸低、中、高劑量組和西藥組抑瘤率分別為20%、47.73%、55.91%、75.45%。與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組及西藥組腫瘤細(xì)胞排列疏松，邊界模糊，細(xì)胞核固縮、破裂，其中西藥組最明顯。與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組和西藥組EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；與鱉甲煎丸低劑量組比較，鱉甲煎丸高劑量組和西藥組EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），鱉甲煎丸中劑量組ERK1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與鱉甲煎丸中劑量組比較，西藥組EGFR、ERK2 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，鱉甲煎丸中、高劑量組和西藥組p-EGFR/EGFR、p-MEK/MEK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與鱉甲煎丸高劑量組比較，西藥組p-EGFR/EGFR、p-ERK1/ERK1、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）。結(jié)論 鱉甲煎丸可能通過抑制EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路激活，從而下調(diào)MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞皮下瘤產(chǎn)生顯著的抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕 鱉甲煎丸；表皮生長因子受體；絲裂原活化蛋白激酶；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；原發(fā)性肝癌；活血化瘀

〔中圖分類號(hào)〕R273 " " " " 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A " " " " "〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.008

Inhibitory effects of Biejiajian Pill on subcutaneous tumor of MHCC-97H hepatoma cells based on EGFR/MAPK/ERK signaling pathway

WU Mengsi1， LIU Hua1， LI Yaoyao1， TAN Nianhua2， SU Lianjun2， PENG Jie1， CHEN Yang1， CHEN Bin1*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the inhibitory effects and their mechanism of Biejiajian Pill （BJJP） on the subcutaneous tumor of MHCC-97H hepatoma cells based on the signaling pathway of epidermal growth factor receptor （EGFR）/mitogen-activated protein kinase （MAPK）/extracellular signal-regulated kinase （ERK）. Methods A total of 30 male BLAB/c nude mice were used to establish a subcutaneous tumor model of MHCC-97H hepatoma cells. After successful modeling， they were randomized into model group， low-， medium-， and high-dose BJJP groups， and western medicine group， with six mice in each group. Low-， medium-， and high-dose BJJP groups were treated with concentrated BJJP 0.55 g/kg， 1.1 g/kg， and 2.2 g/kg， respectively， twice a day; western medicine group was administered Lenvatinib 4 mg/kg combined with Gefitinib 80 mg/kg， 5 days a week; model group was given the equal volume of normal saline; twice a day. The intervention was carried out by gavage for 14 days successively. The general condition of mice was observed， and the tumor inhibition rate of each group was calculated. HE staining was used to observe pathological and morphological changes; RT-qPCR was used to determine the mRNA expression levels of EGFR， mitogen-activated protein kinase kinase （MEK）， ERK1， and ERK2 in the tumor tissue; Western blot was used to examine the relative expression levels of EGFR， phosphorylated EGFR （p-EGFR）， MEK， phosphorylated MEK （p-MEK）， ERK1， ERK2， phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2）， matrix metalloproteinase-1 （MMP-1）， cell cycle protein D1 （Cyclin D1）， N-cadherin， and E-cadherin. Results Compared with model group， the condition of spirit， reactions， and intake of food and water of mice in low-， medium-， and high-dose BJJP groups and western medicine group were improved significantly. Compared with day 0， the body weight of mice in each group was significantly lower on the 14th day， with the most obvious reduction in western medicine group （Plt;0.01）. Compared with model and low-dose BJJP groups， the tumor mass of mice in medium- and high-dose BJJP groups and western medicine group was significantly reduced （Plt;0.05， Plt;0.01）. The tumor inhibition rates of low-， medium-， and high-dose BJJP groups and western medicine group were 20%， 47.73%， 55.91%， and 75.45%， respectively. Compared with model group， the tumor cells in the low-， medium-， and high-dose BJJP groups and western medicine group were loosely arranged and the boundaries were blurred， and the cell nuclei were condensed and ruptured， especially in western medicine group. Compared with model group， the mRNA expression levels of EGFR， MEK， ERK1， and ERK2 in low-， medium-， and high-dose BJJP groups and western medicine group significantly decreased （Plt;0.01）; compared with low-dose BJJP group， the mRNA expression levels of EGFR， MEK， ERK1， and ERK2 in high-dose BJJP and western medicine groups were significantly reduced （Plt;0.01）， and that of ERK1 in medium-dose BJJP group was significantly lower （Plt;0.01）; compared with medium-dose BJJP group， the mRNA expression levels of EGFR and ERK2 in western medicine group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with model group， medium- and high-dose BJJP groups and western medicine group showed a decrease in the relative protein expression levels of p-EGFR/EGFR， p-MEK/MEK， p-ERK1/ERK1， p-ERK2/ERK2， MMP-1， Cyclin D1， and N-cadherin （Plt;0.05， Plt;0.01）， and a significant increase in the relative protein expression level of E-cadherin （Plt;0.01）. Compared with high-dose BJJP group， the relative protein expression levels of p-EGFR/EGFR， p-ERK1/ERK1， MMP-1， Cyclin D1， and N-cadherin in western medicine group were significantly reduced （Plt;0.01）， while that of E-cadherin was elevated （Plt;0.05）. Conclusion BJJP may downregulate the protein expressions of MMP-1， Cyclin D1， and N-cadherin and upregulate that of E-cadherin by inhibiting EGFR/MAPK/ERK signaling pathway activation， thereby exerting significant inhibitory effects on the subcutaneous tumor of MHCC-97H hepatoma cells.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Biejiajian Pill; epidermal growth factor receptor; mitogen-activated protein kinase; extracellular signal-regulated kinase; primary liver cancer; circulating blood and eliminating blood stasis

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer， PLC）是我國最常見的消化道惡性腫瘤，起病隱匿，惡性程度高，一旦發(fā)現(xiàn)多已進(jìn)入中、晚期，預(yù)后極差，具有生存期短、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、病死率高的特點(diǎn)[1]。肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，對(duì)于肝癌的西醫(yī)治療多采用肝動(dòng)脈灌注化學(xué)藥物治療（以下簡稱化療）栓塞、放射治療、消融、分子靶向治療、免疫治療等多種治療方式[2-3]。在肝癌的綜合治療中，中醫(yī)藥治療發(fā)揮著重要的作用，具有減毒增效、延長患者生存期、改善生活質(zhì)量、減輕藥物不良反應(yīng)及毒性等作用[4]。

古代中醫(yī)學(xué)對(duì)肝癌病名并無記載，根據(jù)肝癌發(fā)病的部位以及臨床表現(xiàn)將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”“肥氣”“膨脹”或“脅痛”等疾病范疇[5]。歷代醫(yī)家經(jīng)過不斷臨床實(shí)踐，將原發(fā)性肝癌的基本病因病機(jī)歸納為“瘀、毒、虛”[6-9]。鱉甲煎丸出自《金匱要略·瘧病脈證并治第四》，是治療肝病最經(jīng)典的方劑，方中諸多活血破瘀、消癥散結(jié)之品，以治標(biāo)；三陽同調(diào)，佐以干姜、阿膠等扶正氣、行氣血、化痰濁、泄結(jié)熱，以復(fù)本[10]。清代徐忠可曾言：“藥用鱉甲煎者，鱉甲入肝，除邪養(yǎng)血，合煅灶灰浸酒去瘕，故以為君；以小柴胡湯、桂枝湯及大承氣湯為三陽主藥，故以為臣，但甘草嫌柔緩而減藥力，枳實(shí)嫌破氣而直下，故去之；外加干姜、阿膠助人參養(yǎng)正為佐；瘕必假血依痰，故以四蟲合半夏消血化痰，凡積必有氣結(jié)，氣利則積消，故以烏扇、葶藶子利肺氣，合石韋、瞿麥清氣熱而化氣散結(jié)，血因邪聚則熱，故以牡丹皮、紫葳去血中伏火、膈中實(shí)熱為使”[11]。

本課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸活性成分與肝癌的核心靶點(diǎn)：表皮生長因子受體（epidermal growth factior receptor，EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）對(duì)接結(jié)合穩(wěn)定[12]。其中EGFR作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（protooncogene serine/threonine-protein kinase，Raf）/絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase， MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路的上游因子。研究證實(shí)，可通過上調(diào)EGFR的表達(dá)，從而激活Raf/MEK/MAPK信號(hào)通路誘發(fā)肝細(xì)胞癌[13]。因此，本課題組以BALB/c裸鼠作為研究對(duì)象，用鱉甲煎丸進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究鱉甲煎丸是否可通過EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞皮下瘤產(chǎn)生抑制作用。

1 材料

1.1 "細(xì)胞和動(dòng)物

肝癌細(xì)胞株MHCC-97H（中國Abiowell公司，批號(hào)：AW-CCH024）；SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0010，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，室溫恒溫20～25 ℃，濕度（50.0%±10.0%），每隔12小時(shí)開燈照明。本研究所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，并接受湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的監(jiān)督，倫理審批號(hào)：ZYFY20230725-36。

1.2 "藥物及主要試劑

鱉甲煎丸（國藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020772，批號(hào)：202790，規(guī)格：3 g/袋）；侖伐替尼、吉非替尼（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)分別為：C15327639、C14497254）；DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司，批號(hào)：D5796）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號(hào)：10099141）；雙抗（青鏈酶素）（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SV30010）；蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、山羊抗兔免疫球蛋白IgG、山羊抗鼠免疫球蛋白IgG、HE染色試劑盒（Abiowell公司，批號(hào)分別為：AWB0055、AWB0136、AWS0001、AWS0001、AW22A230813）；BCA蛋白定量試劑盒（中國Abiowell公司，批號(hào)：AWB0104）；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)公司，批號(hào)分別為：CW2569、CW2141）；Trizol試劑（美國Thermo公司，批號(hào)：15596026）；核酸染料（中國北京普利萊公司，批號(hào)：PB11141）；RNA轉(zhuǎn)染試劑（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：E607402-1000）；MEK、ERK1/2、磷酸化的ERK1/2（p-ERK1/2）、EGFR、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、細(xì)胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，Cyclin D1）、上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏附蛋白（N-cadherin）、β-actin抗體（美國proteintech公司，批號(hào)分別為：11049-1-AP、11257-1-AP、28733-1-AP、51071-2-AP、10371-2-AP、26939-1-AP、22018-1-AP、20874-1-AP、66009-1-Ig）；磷酸化的MEK（p-MEK）、磷酸化的EGFR（p-EGFR）抗體（英國abcam公司，批號(hào)分別為：ab278564、ab40815）。

1.3 "主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（上海三藤儀器有限公司，型號(hào)：DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號(hào)：DSZ2000X）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司，型號(hào)：A00-1-1102）；螢光定量RCP儀、螢光PCR板（美國Thermo公司，型號(hào)：PIKOREAL96、SPL0960）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（中國湖南湘儀公司，型號(hào)：H1650R）；水平瓊脂糖電泳槽、電泳儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號(hào)分別為：DYCP-31DN、DYY-2C）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope6100）。

2 方法

2.1 "細(xì)胞培養(yǎng)

MHCC-97H細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，采用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

2.2 "模型制備

選取狀態(tài)良好的MHCC-97H細(xì)胞，加入1.5 mL胰蛋白酶消化，離心，并棄上清，加入適量RPMI1640，取10 μL進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個(gè)/mL，用1 mL注射器吸取0.2 mL細(xì)胞懸液，75%乙醇棉球擦拭消毒后，將細(xì)胞懸液接種至裸鼠右前肢腋下，建立肝癌MHCC-97H細(xì)胞皮下瘤模型。接種后定期觀察裸鼠皮下瘤生長情況，游標(biāo)卡尺測量皮下移植瘤大小并計(jì)算體積（mm3）=長徑（mm）×短徑（mm）×高度（mm）。接種7～10 d內(nèi)肉眼可觀察到成型的腫瘤，當(dāng)腫瘤生長至直徑6 mm時(shí)提示造模成功[14]。

2.3 "實(shí)驗(yàn)分組、給藥及取樣

造模10 d左右，待皮下瘤長至50～100 mm3時(shí)[15]，將30只SPF級(jí)裸鼠隨機(jī)分為5組：模型組，鱉甲煎丸低、中、高劑量組，西藥組，每組6只。鱉甲煎丸成人臨床用藥6～9 g/d，以成人7.5 g/d的劑量作為鱉甲煎丸中劑量組的灌胃劑量，按照1∶2∶4原則，按照人體和動(dòng)物體表面積比換算[16]裸鼠需要的灌胃劑量，即鱉甲煎丸低、中、高劑量分別為：0.55、1.1、2.2 g/kg，西藥組用藥劑量為：樂伐替尼4 mg/kg+吉非替尼80 mg/kg[17]。各組按0.01 mL/g折算給藥，模型組給予等量生理鹽水2次/d灌胃，鱉甲煎丸低、中、高劑量組給藥2次/d，西藥組每周給藥5 d，1次/d，每組連續(xù)干預(yù)2周。末次給藥后禁食過夜，水合氯醛麻醉下頸椎脫臼處死裸鼠，摘取瘤體，立即稱重，一部分用4%多聚甲醛固定，剩余部分放于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 "一般情況觀察

觀察裸鼠的精神狀態(tài)、自主活動(dòng)、進(jìn)食情況、二便排泄、呼吸等一般情況，并比較各組裸鼠體質(zhì)量變化。

2.5 "抑瘤率計(jì)算

末次給藥后處死裸鼠，手術(shù)剝離腫瘤組織，用吸水紙吸干組織表面多余的水分，利用精密電子天平稱，稱取瘤體質(zhì)量，并在實(shí)驗(yàn)記錄本記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算抑瘤率=[模型組平均瘤體質(zhì)量（g）-用藥組平均瘤體質(zhì)量（g）]/模型組平均瘤體質(zhì)量（g）×100%。

2.6 "HE染色觀察裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)變化

取各組裸鼠部分瘤體組織，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后，進(jìn)行切片脫蠟，再用HE染色，脫水、封片，顯微鏡觀察瘤體組織形態(tài)。

2.7 "RT-qPCR檢測瘤體組織中EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平

取腫瘤組織0.02 g，加入1 mL Trizol后于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后裂解5 min，12 000 r/min，4 ℃，離心15 min（離心半徑9 cm），取上層液相，轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中，提取總RNA并計(jì)算其濃度和純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SYBR熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增定量，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成引物，以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法比較分析各基因表達(dá)，引物序列見表1。

2.8 "Western blot檢測EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路及MMP-1、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)水平

剪取0.025 g瘤體組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入300 ？滋L RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織至無組織塊，置于冰上裂解10 min至組織完全裂解。將離心機(jī)提前預(yù)冷至4 ℃，離心15 min（離心半徑9 cm）12 000 r/min，取上清進(jìn)行電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，加入按一定比例稀釋的一抗（MEK為1∶5 000；p-MEK為1∶1 000；；ERK1/2為1∶2 000；p-ERK1/2為1∶1 000；EGFR為1∶1 500；p-EGFR為1∶500；MMP-1為1∶1 000；Cyclin D1為1∶5 000；N-cadherin為1∶2 000；E-cadherin為1∶20 000；β-actin為1∶5 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，加入二抗（HRP山羊抗鼠IgG為1∶5 000；HRP山羊抗兔IgG為1∶5 000），PBST洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光拍照保存，凝膠成像系統(tǒng)成像進(jìn)行讀片分析。

2.9 "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 "各組裸鼠一般情況比較

藥物干預(yù)治療后，各組裸鼠均出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量減輕，精神欠佳，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食、飲水減少。與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組及西藥組精神、反應(yīng)、進(jìn)食及飲水等情況均明顯改善。

3.2 "各組裸鼠體質(zhì)量比較

藥物治療前，各組裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與第0天比較，西藥組第7天、第14天體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），模型組和鱉甲煎丸低、中、高劑量組第14天體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）；與第7天比較，鱉甲煎丸高劑量組第14天體質(zhì)量降低（P＜0.05）。與模型組和鱉甲煎丸低、中、高劑量組比較，西藥組第7天、第14天體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）。詳見表2。

3.3 "各組裸鼠瘤體質(zhì)量和抑瘤率的比較

與模型組、鱉甲煎丸低劑量組比較，鱉甲煎丸中、高劑量組和西藥組瘤體質(zhì)量減輕（P＜0.05，P＜0.01）。鱉甲煎丸低、中、高劑量組和西藥組抑瘤率分別為20.00%、47.73%、55.91%、75.45%。詳見表3。

3.4 "各組裸鼠瘤體組織病理學(xué)比較

模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大，染色較深，出血壞死較少；與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組及西藥組腫瘤細(xì)胞排列疏松，邊界模糊，細(xì)胞核固縮、破裂，其中西藥組最明顯。詳見圖1。

3.5 "各組裸鼠腫瘤組織內(nèi)EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平比較

與模型組比較，鱉甲煎丸低、中、高劑量組和西藥組EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。與鱉甲煎丸低劑量組比較，鱉甲煎丸高劑量組和西藥組EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。鱉甲煎丸中劑量組ERK1

mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與鱉甲煎丸中劑量組比較，西藥組EGFR、ERK2 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表4。

3.6 "各組裸鼠腫瘤組織內(nèi)EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路及MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

與模型組比較，鱉甲煎丸中、高劑量組和西藥組p-MEK/MEK蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；鱉甲煎丸低、中、高劑量組和西藥組p-EGFR/EGFR、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與鱉甲煎丸低劑量組比較，西藥組p-MEK/MEK蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），鱉甲煎丸高劑量組和西藥組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），鱉甲煎丸中、高劑量組和西藥組p-EGFR/EGFR、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。與鱉甲煎丸中劑量組比較，鱉甲煎丸高劑量組和西藥組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），西藥組p-EGFR/EGFR、p-ERK1/ERK1、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。與鱉甲煎丸高劑量組比較，西藥組p-EGFR/EGFR、p-ERK1/ERK1、MMP-1、Cyclin D1、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見表5、圖2。

4 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)制由多種分子機(jī)制驅(qū)動(dòng)，其中MAPK/ERK是肝癌發(fā)展中最關(guān)鍵的通路[17]。Raf/MEK/ERK信號(hào)通路作為MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵通路，在各種潛在致癌因素的刺激下，如表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）和轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）與EGFR結(jié)合，EGFR作為Raf/MEK/ERK通路的關(guān)鍵上游因子，進(jìn)而觸發(fā)下游的MAPK/ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[13]。研究表明，部分肝癌晚期患者在服用樂伐替尼后出現(xiàn)EGFR激活，刺激下游的MEK/ERK信號(hào)通路，刺激癌細(xì)胞分離，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[18]。在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中，通過敲除EGFR提高了肝癌細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的敏感性，將樂伐替尼與EGFR抑制劑（如吉非替尼）合用后，明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡[18]。在臨床實(shí)驗(yàn)中，對(duì)服用樂伐替尼無效同時(shí)EGFR高表達(dá)的30名肝癌晚期患者展開樂伐替尼與吉非替尼聯(lián)合治療研究，有半數(shù)以上患者的腫瘤明顯縮小，明顯改善了樂伐替尼的耐藥情況，提高了樂伐替尼的療效，可能與樂伐替尼和吉非替尼阻斷EGFR介導(dǎo)的MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)[18]。

張仲景創(chuàng)立的鱉甲煎丸在治療肝病尤其是肝癌的過程中充當(dāng)重要角色，該方攻補(bǔ)兼施、寒熱并用、氣血津液共治，諸法兼?zhèn)洌瑢?shí)乃消癥化積之良劑[10]。根據(jù)現(xiàn)代藥理研究，鱉甲煎丸具有提高免疫力、抗腫瘤、抗纖維化等作用[19]。同時(shí)有大量研究表明，鱉甲煎丸可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，抗腫瘤血管生成，抑制炎性因子，改善炎癥反應(yīng)、核因子κB、血小板衍生生長因子β受體等多種信號(hào)通路等[20-23]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)治療7、14 d后，與模型組、鱉甲煎丸低劑量組比較，鱉甲煎丸中、高劑量組瘤體質(zhì)量與西藥組的腫瘤增長緩慢，抑制腫瘤增長效果明顯。同時(shí)，與模型組相比，各治療組裸鼠精神、進(jìn)食、活動(dòng)等一般情況較好，鱉甲煎丸各劑量組裸鼠體質(zhì)量無明顯差異，但西藥組裸鼠體質(zhì)量明顯減輕，可能與樂伐替尼與吉非替尼兩種化療藥物合用有關(guān)。化療藥物雖然能夠明顯抑制瘤體生長，抗癌作用顯著，但都存在一定的胃腸道不良反應(yīng)及肝功能損害。這也暗示著鱉甲煎丸相比化療藥物在抑制腫瘤方面能力相當(dāng)，但對(duì)機(jī)體的損害更低，體現(xiàn)了中醫(yī)藥在治療腫瘤方面有明顯改善生活質(zhì)量、減輕副作用等優(yōu)勢。治療結(jié)束后，鱉甲煎丸各組隨劑量增加，腫瘤細(xì)胞破裂壞死越明顯。進(jìn)一步研究鱉甲煎丸對(duì)MHCC-97H肝癌細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用，相比模型組，鱉甲煎丸各劑量組與西藥組明顯下調(diào)EGFR、MEK、ERK1/2 mRNA表達(dá)水平。同時(shí)，鱉甲煎丸中、高劑量組與西藥組顯著抑制EGFR、MEK、ERK1/2磷酸化的激活，且不同程度下調(diào)MMP-1及Cyclin D1的蛋白表達(dá)。MMP-1是與細(xì)胞外基質(zhì)多種組分降解相關(guān)的內(nèi)肽酶，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[24]。Cyclin D1是與腫瘤直接相關(guān)的癌基因，其過度表達(dá)與腫瘤的增殖密切相關(guān)[25]。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可以上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin的蛋白表達(dá)，E-cadherin和N-cadherin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的標(biāo)志物。EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制或者阻斷EMT的發(fā)生，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可能通過抑制EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路的激活，下調(diào)下游MMP-1、Cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制EMT發(fā)生，為鱉甲煎丸治療肝癌提供了科學(xué)理論依據(jù)。因此，鱉甲煎丸抗肝癌的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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