基于GC-MS的血清代謝組學(xué)探究夏枯草莖葉酚酸抗慢性盆腔炎的作用機制

〔摘要〕 目的 基于GC-MS的血清代謝組學(xué)探究夏枯草莖葉酚酸抗慢性盆腔炎的有效成分及其作用機制。方法 本實驗采用60只雌性大鼠，采用混合菌液加機械損傷對40只大鼠進(jìn)行慢性盆腔炎造模處理，正常組10只大鼠不做處理，假手術(shù)組10只大鼠只做機械損傷。造模成功后，將模型大鼠分為模型組、康婦炎膠囊組、頭孢克洛分散片組和夏枯草莖葉酚酸組，每組10只，連續(xù)給藥21 d；取正常組、假手術(shù)組、模型組和夏枯草莖葉酚酸組、康婦炎膠囊組、頭孢克洛分散片組大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并對篩選后的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果 夏枯草莖葉酚酸能修復(fù)慢性盆腔炎組織病理損傷；代謝組學(xué)鑒定出47種代謝物，主要以糖類、氨基酸、有機酸、脂肪酸、多元醇等多種內(nèi)源性物質(zhì)為主；多因素分析表明，夏枯草可改善炎癥大鼠血清代謝產(chǎn)物異常。主要差異代謝通路為氨基酸代謝、抗壞血酸和醛糖二酸代謝途徑，主要差異代謝物為尿素、葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、L-賴氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸等，還影響機體苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，抗壞血酸和醛糖二酸代謝，苯丙氨酸代謝，花生四烯酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。GO功能分析表明，對激素的反應(yīng)、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)和磷酸化的正向調(diào)節(jié)等是主要參與的生物過程。KEGG通路富集結(jié)果顯示，PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路和內(nèi)分泌抵抗等為主要富集的通路。結(jié)論 夏枯草莖葉酚酸對慢性盆腔炎大鼠具有明顯的治療作用，其機制可能與作用于COBT、ADH1C、MAOB等靶點，干預(yù)PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路和內(nèi)分泌抵抗等信號通路，引起差異代謝物變化有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 夏枯草莖葉；酚酸；慢性盆腔炎；血清代謝組學(xué)；氣相色譜-質(zhì)譜法

〔中圖分類號〕R284.1 " " " " 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.009

Mechanism of action of phenolic acids in the stems and leaves of Prunella vulgaris L. against chronic pelvic inflammatory disease based on serum

metabolomics using GC-MS

LI Shan1，2， TAN Zhihao1，2， XIAO Zhikui1，2， XIONG Suhui1，2， LUO Hongshan1，2， XIE Jingchen1，2*， LIN Limei1，2*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the active ingredients and mechanism of action of phenolic acids in the stems and leaves of Prunella vulgaris L. against chronic pelvic inflammatory disease based on serum metabolomics using GC-MS. Methods A total of 60 female rats were used in this experiment. Among them， 40 rats were treated with mixed bacterial liquid and mechanical injury to establish chronic pelvic inflammatory disease model， ten rats in the normal group were not treated， and ten rats in the sham-operated group were only treated with mechanical injury. After successful modeling， the rat models were subdivided into model group， Kangfuyan Capsules group （KFY group）， Cefaclor Dispersible Tablets group （CEC group）， and group of phenolic acids from stems and leaves of Prunella vulgaris L. （XKC group）. Each group was administered with the corresponding medication or distilled water continuously for 21 d. The rat serum from the normal， sham -operated， model， and XKC groups，KFY group， CEC group was analyzed using metabolomics， and the differentially expressed genes after screening were analyzed by GO function and KEGG pathway enrichment. Results The phenolic acids in the stems and leaves of Prunella vulgaris L. could repair the pathological damage of chronic pelvic inflammatory tissue. Metabolomics identified 47 metabolites， mainly including carbohydrates， amino acids， organic acids， fatty acids， polyols， and other endogenous substances， and multifactor analysis showed that Prunella vulgaris L. could reduce the abnormal serum metabolites in the inflammatory rats. The main differential metabolic pathways are amino acid metabolism， as well as ascorbic acid and aldaric acid metabolism. The main differential metabolites are urea， gluconic acid， D-glucuronic acid， L-lysine， glycine， L-serine， L-threonine， L-proline， L-phenylalanine， etc. The disease also affected the biosynthesis of phenylalanine， tyrosine， and tryptophan， ascorbic acid and aldaric acid metabolism， phenylalanine metabolism， arachidonic acid metabolism， as well as glycine， serine， and threonine metabolism. GO function analysis showed that the responses to hormones， cellular responses to nitrogen compounds， and positive regulation of phosphorylation were the main biological processes involved. KEGG pathway enrichment analysis showed that PI3K-Akt signaling pathway， thyroid hormone signaling pathway， and endocrine resistance were the main enrichment pathways. Conclusion The phenolic acids in the stems and leaves of Prunella vulgaris L. have obvious therapeutic effects on rats with chronic pelvic inflammatory disease. Its mechanism may be related to acting on COBT， ADH1C， MAOB and other targets， intervening in PI3K-Akt signaling pathway， thyroid hormone signaling pathway， endocrine resistance， etc.， and causing changes in differential metabolites.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 stems and leaves of Prunella vulgaris L.; phenolic acids; anti-chronic pelvic inflammatory disease; serum metabolomics; GC-MS

中藥夏枯草（Prunella vulgaris L.）為藥食同源大宗藥材，具有清瀉肝火、散結(jié)消腫、明目的功效，對目赤腫痛、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖、乳房脹痛等疾病具有治療作用[1-2]。2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定夏枯草藥用部位為果穗，而夏枯草非藥用部位（莖葉）占全株植物的80%，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)夏枯草莖葉成分與果穗相似，以多酚類成分為主（如迷迭香酸等），具有明確的抗炎活性[3-5]。

慢性盆腔炎為常見的婦科病癥，可造成異位妊娠、不孕癥和慢性盆腔疼痛等后遺癥，具有病程長、發(fā)作頻繁等特點，嚴(yán)重影響患病婦女的生活質(zhì)量。中成藥因其毒副作用低、療效確切等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于臨床慢性盆腔炎的治療，其中含夏枯草中成藥盆炎栓具有明顯治療效果[6]?；诖耍n題組以夏枯草非藥用部位（莖葉）為對象，探究其對慢性盆腔炎的干預(yù)作用，采用以GC-MS為主的血清代謝組學(xué)探討其作用機制，以期擴(kuò)大夏枯草非藥用部位的資源利用及開發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 "實驗動物

60只4～5周齡SD雌性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，SPF級，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（24±1） ℃，濕度為40%～60%，12 h暗/光循環(huán)，普通飼料，自由飲水。實驗通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會批準(zhǔn)（LLBH-202112150001）。

1.2 "藥物與主要試劑

夏枯草采收于江西藥材基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為唇形科植物夏枯草（Prunella vulgaris L.）的干燥全草；康婦炎膠囊（國藥準(zhǔn)字Z20055634，山東步長神州制藥有限公司，批號210213）；頭孢克洛分散片（國藥準(zhǔn)字H20041126，安徽市安科恒益藥業(yè)有限公司，批號211209）；苯甲酸雌二醇注射液2 mL：4 mg×10支[四川金科藥業(yè)有限公司，（2020）獸藥生產(chǎn)證字22041號]；4%多聚甲醛固定液（Biosharp生物科技有限公司，批號：21351381）；甲氧胺（批號：226904-5G）、N，O-雙（三甲基硅烷基乙酰胺）（批號：15238-25ML）、吡啶（批號：270970-250ML）、2-異丙基蘋果酸（批號：333115-100MG）均購自Sigma公司。

1.3 "主要儀器

TGL20M型離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；GC-MS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；TDL-5-A型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MS2型迷你振蕩器（廣州儀科有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 "基于GC-MS的血清代謝組學(xué)分析

2.1.1 "夏枯草莖葉酚酸提取 "取干燥的夏枯草莖葉，剪短，粉碎，過60目篩，備用。稱取夏枯草莖葉樣品5 kg，加入30倍量的蒸餾水（V/m），回流提取120 min，冷卻后補足減失的質(zhì)量，提取3次，合并濾液，旋蒸濃縮。隨后將樣品過AB-8大孔樹脂，分別用5倍量的純水、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，旋蒸濃縮至黏稠狀，冷凍干燥后即得夏枯草莖葉酚酸。

2.1.2 "造模與分組 "大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、夏枯草莖葉酚酸組、康婦炎膠囊組和頭孢克洛分散片組，每組10只。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，皮下注射雌二醇注射液0.2 mL/只（獸用苯甲酸雌二醇注射液），每天1次，連續(xù)5～7 d，注射期間注意觀察大鼠陰道口是否充血、紅腫，觀察動情期。誘發(fā)大鼠動情周期后，采用人體解脲支原體∶大腸埃希菌∶金黃色葡萄球菌按2∶2∶1配制成濃度為1×108 CFU/mL的混合菌液，10%水合氯醛麻醉大鼠，75%乙醇消毒大鼠下腹部，下腹部縱行切開2 cm切口，暴露子宮，用自制的診刮器搔刮大鼠子宮，從卵巢向?qū)m頸方向左右各注射配制完成的菌液，并用一塊無菌止血海綿（0.2 cm×0.2 cm）填于針孔處，陰道內(nèi)塞一塊無菌止血綿以防腹腔內(nèi)的菌液流出，術(shù)后抽取大鼠觀察子宮及輸卵管充血水腫情況判斷造模是否成功，正常組不做任何處理，假手術(shù)組大鼠僅做開腹暴露子宮、縫合關(guān)腹處理[5]。

2.1.3 "實驗給藥 "依據(jù)臨床用藥劑量按體表面積折算法換算大鼠灌胃劑量，XKC組（0.405 g·kg-1·d-1 夏枯草莖葉酚酸），KFY組（0.324 g·kg-1·d-1康婦炎膠囊），CEC組（0.067 5 g·kg-1·d-1頭孢克洛分散片）。模型組、假手術(shù)組和正常組大鼠灌胃給予10 mL·kg-1·d-1蒸餾水，連續(xù)給藥21 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h后麻醉，剔除下腹部毛發(fā)，75%乙醇消毒后剪開腹腔，行腹主動脈取血，取血后剪取子宮及輸卵管組織。

2.1.4 "血清樣本處理 "參考實驗室建立的方法處理血清樣本，方法如下：樣本于4 ℃下解凍1 h，取100 μL樣本，加入50 μL內(nèi)標(biāo)（1 mg/mL 2-異丙基蘋果酸甲醇溶液），渦旋混合；加 450 μL甲醇除蛋白，渦旋混合后，靜置8 min，13 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清液400 μL，氮氣溫和吹干[7]。向干燥殘渣中加入50 μL甲氧胺-吡啶（20 mg/mL），70 ℃下反應(yīng) 1 h。再加入 100 μL雙三氟乙酰胺，混勻30 s，70 ℃下反應(yīng)1 h，室溫冷卻2 h，樣品于13 000 r/min（半徑10 cm）離心8 min，取上清液100 μL轉(zhuǎn)至250 μL內(nèi)插管，裝入進(jìn)樣瓶用于GC-MS分析檢測[8]。

為確保分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，本實驗加入質(zhì)控樣本（quality control，QC），處理如下：分別吸取各個正常樣本10 μL，充分混合，按上述步驟進(jìn)行衍生化處理，儀器每運行6次，則吸取一次QC樣本進(jìn)樣檢測，維持平衡。

2.1.5 "GC－MS數(shù)據(jù)采集 "氣相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用儀采集數(shù)據(jù)，色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管（0.25 mm×30 mm，0.25 m）。進(jìn)樣量：1 μL，載氣：氦氣（99.99％），流速：1 mL/min，分流比50∶1，進(jìn)樣口溫度：280 ℃，離子源溫度：200 ℃，溶劑延遲時間：6.0 min，溶劑切割時間：6.5 min，質(zhì)譜掃描范圍：35～550 m/z。程序升溫條件：柱溫70 ℃保持4 min，20 ℃/min速率升溫至110 ℃，8 ℃/min速率升溫至270 ℃，保持5 min。

2.1.6 "數(shù)據(jù)分析 "所有樣本經(jīng)GC-MS檢測后，得總離子流色譜圖，對采集得到的譜圖進(jìn)行峰識別、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作，其中峰識別通過NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定和注釋（鑒定結(jié)果入選要求需滿足峰相似度大于80%），將結(jié)果整理成Excel表格，包含鑒定化合物保留時間和相對內(nèi)標(biāo)峰面積，導(dǎo)入SMICA-14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal Partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），根據(jù)VIP值大于1篩選差異代謝物。計量資料以“ｘ±s”表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，顯著性水平設(shè)為Plt;0.05。采用MetaboAnalyst（www.metabo？鄄analyst.ca）數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行代謝通路分析。

2.2 "網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.2.1 "成分相關(guān)靶點預(yù)測 "根據(jù)前期研究得到的夏枯草莖葉酚酸類成分[5]，通過PubChem數(shù)據(jù)庫[9]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢SMILES號，上傳SMILES號于SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫[10]（http：//www.swisstargetprediction.ch），設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，獲取靶點信息。

2.2.2 "炎癥相關(guān)靶點篩選及共同靶點 "采用“chronic pelvic inflammatory disease”作為關(guān)鍵詞，檢索Gene？鄄

Cards數(shù)據(jù)庫[11]（https：//www.genecards.org/）得到慢性盆腔炎相關(guān)靶點。導(dǎo)入Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），取成分和炎癥對應(yīng)靶點的交集，得共同靶點。

2.2.3 "PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 "將上述得到的共同靶點上傳至STRING v12.0[12]（https：//version-12-0.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”物種，靶點關(guān)聯(lián)的置信度為0.40，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Cytoscape 3.9.1軟件[13]分析，利用cytoHubba插件中的MCC算法識別PPI網(wǎng)絡(luò)的hub基因。

2.2.4 "核心靶標(biāo)的GO功能及KEGG通路富集分析

將共同靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫[14]（https：//metascape.org/）進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置“Homo sapiens”為物種，然后利用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析。

2.2.5 "分子對接 "采用Discovery Studio 2019軟件[15]進(jìn)行分子對接，對接配體和受體分別從PubChem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫[16]（https：//www.rcsb.org/）中獲得。以CDOCKER Energy作為標(biāo)準(zhǔn)評估分子對接結(jié)果，選取最高C-Docker能量評分值的構(gòu)象用于可視化分析。

3 結(jié)果

3.1 "GC-MS圖譜與代謝物質(zhì)指認(rèn)

血清樣本上機檢測，經(jīng)過自動質(zhì)譜去卷積鑒定系統(tǒng)對TIC譜圖（圖1）進(jìn)行噪聲處理、基線校正，對其中相似度大于80%的化合物進(jìn)行鑒別和分析，共鑒定47個化合物，主要為糖類、氨基酸、有機酸、脂肪酸、多元醇等內(nèi)源性物質(zhì)。

3.2 "組間差異代謝物的篩選和分析

PCA可在多維空間對樣本間差異進(jìn)行直觀顯示，如圖2A所示，6個QC樣本集中在原點附近，表明模型擬合穩(wěn)定；正常組和模型組樣本居于兩側(cè)，表明兩者之間存在明顯差異；正常組和假手術(shù)組樣本均居于第四象限，說明本次實驗手術(shù)不影響代謝物的變化；藥物組居于正常組和模型組之間，并趨于正常組，說明經(jīng)過夏枯草治療后，大鼠體內(nèi)代謝物差異向正常轉(zhuǎn)移。PLS-DA構(gòu)建提供多組別數(shù)學(xué)模型，在PLS-DA模型中（R2Y=0.77，Q2=0.56，數(shù)值大于0.5說明模型具有較好的預(yù)測度和擬合度，如圖2B所示），正常組、模型組、假手術(shù)組、藥物組、QC組組間和組內(nèi)差異更為清晰（圖2C）。

為進(jìn)一步明確正常組和模型組之間的代謝物差異，構(gòu)建兩組間OPLS-DA模型（R2Y=0.98，Q2=0.92，數(shù)值大于0.5說明模型具有較好的預(yù)測度和擬合度，如圖2D所示），正常組和模型組居于OPLS-DA模型兩側(cè)（如圖2E所示），模型準(zhǔn)確度采用20個置換的置換檢驗（R2=0.811和Q2=-0.325，說明模型可靠，如圖2F所示）。

OPLS-DA通過消除組間誤差和隨機誤差，提高模型對數(shù)據(jù)的解析能力，其中，VIPgt;1且Plt;0.05的變量與慢性盆腔炎有潛在關(guān)聯(lián)（如圖2G和表1所示）。分析正常組和模型組大鼠差異代謝物可知，相比于正常組，慢性盆腔炎大鼠血清中尿素顯著降低，葡糖糖酸、L-賴氨酸、D-葡萄糖醛酸、甘油、甘氨酸、L-絲氨酸、花生四烯酸、2-單棕櫚酸甘油、棕櫚酸、L-蘇氨酸、1，5-無水葡萄糖、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸顯著升高，經(jīng)夏枯草莖葉酚酸給藥后，尿素、葡糖糖酸、L-賴氨酸、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸、L-絲氨酸、花生四烯酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸等差異代謝物向正常方向轉(zhuǎn)移。

3.3 "血清差異代謝物的代謝通路分析

將差異代謝物導(dǎo)入至MetaboAnalyst 4.0數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行代謝通路富集分析，將Pathway Impactgt;0.2的代謝途徑作為最重要的代謝途徑，其中有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，抗壞血酸和醛糖二酸代謝，苯丙氨酸代謝，花生四烯酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。詳見圖3。

3.4 "網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.4.1 "成分和疾病靶點的篩選與共同靶點 "在Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫中，鑒定的22個化學(xué)成分，刪除重復(fù)靶點后得542個靶點。從GeneCards數(shù)據(jù)庫去重后得5 877個盆腔炎相關(guān)靶點。將成分和疾病靶點在Venny 2.1上取交集，得320個共同靶點，見圖4。

3.4.2 "PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 "將藥物和疾病交集靶點上傳至STRING 12.0數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)出TSV文件，通過Cytoscape3.9.1軟件的cytoHubba插件的MCC算法識別PPI網(wǎng)絡(luò)的hub基因，取前20個作為核心靶點進(jìn)行展示。詳見圖5。

3.4.3 "核心靶標(biāo)的GO功能及KEGG通路富集分析

將上述得到的核心靶點在Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以P＜0.01為篩選條件得到GO分析結(jié)果中生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）相關(guān)條目分別為2 724、160、332個。以-lgP值來衡量GO富集程度，取前10位進(jìn)行可視化展示，見圖6。GO功能分析表明，對激素的反應(yīng)（response to hormone）、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)（cellular response to nitrogen compound）和磷酸化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of phosphorylation）等是主要參與的BP；膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）和細(xì)胞體（cell body）等為主要CC；MF主要與蛋白激酶活性（protein kinase activity）、以醇為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（phosphotransferase activity， alcohol group as acceptor）以及激酶活性（kinase activity）等相關(guān)。通路分析得到217條KEGG富集條目，以-lg（P）值為條件，前20條通路見圖7。KEGG通路富集結(jié)果顯示，PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）和內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）等為主要富集的通路。

3.4.4 "分子對接 "對接靶蛋白的PDB ID分別為EGFR（3G5X）/SRC（1KC2）/STAT3（6GFA）信號通路和BCL2（5UUK）/AKT1（3OS5）信號通路。結(jié)合能熱圖見圖8。EGFR/SRC/STAT3信號通路評分較高，因此，選用最高C-Docker能量評分的構(gòu)象進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖9。

3.4.5 "“成分-靶點-差異代謝產(chǎn)物”網(wǎng)絡(luò) "利用Cytoscape 3.10.0軟件構(gòu)建“成分-靶點-差異代謝產(chǎn)物”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析，見圖10。其中，按度值（degree）排序，夏枯草核心成分由大到小依次是：白射干素（dichotomitin）、3-羥基肉桂酸（m-coumaric acid）、咖啡酸（caffeic acid）、原兒茶醛（protocatechualdehyde）、迷迭香酸（rosmarinic acid）、2，5-二羥基苯甲醛（2，5-dihydroxybenzaldehyde）、秦皮素（fraxetin）、對羥基苯乙酮（4-hydroxyacetophenone）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（nicotiflorin）、異槲皮苷（iso-quercitrin）。差異代謝物影響由大到小依次是：甘氨酸（glycine）、甘油（glycerol）、L-絲氨酸（L-serine）、L-脯氨酸（L-prolinum）、棕櫚酸（palmitic acid）、L-異亮氨酸（L-isoleucine）、花生四烯酸（arachidonic acid）。成分和和差異代謝物影響的核心靶點分別有：COBT、ADH1C、MAOB、PTGS2、PTGS1、LYZL4、ADH1B、MAOA、NOS2。通過圖10可知，夏枯草的治療慢性盆腔炎具有多成分、多靶點的作用特點。

4 討論

當(dāng)前，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展壯大，中藥材供不應(yīng)求，資源短缺日益加劇，中藥非藥用部位開發(fā)成為研究的熱點，如懷山藥根莖的皮和葉片中含有豐富的黃酮類化合物，具有較大開發(fā)潛力[17-18]。課題組前期實驗表明，慢性盆腔炎大鼠模型經(jīng)夏枯草莖葉酚酸干預(yù)后，子宮組織充血水腫、粘連及炎性細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞壞死脫落等病理形態(tài)得到修復(fù)，炎癥反應(yīng)緩解[19]。本研究基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究慢性盆腔炎模型大鼠生物體內(nèi)代謝物的生理變化，并闡述其與疾病的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)慢性盆腔炎大鼠造模前后血清中氨基酸、有機酸等發(fā)生明顯變化，給予夏枯草莖葉酚酸干預(yù)后，可扭轉(zhuǎn)部分差異代謝物變化趨勢，如尿素、葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、L-賴氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸等代謝物。富集分析結(jié)果表明，慢性盆腔炎影響了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，抗壞血酸和醛糖二酸代謝，苯丙氨酸代謝，花生四烯酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等代謝途徑。

目前，將氨基酸作為炎癥指標(biāo)受到較多的關(guān)注。研究人員在炎癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血清中丙苯氨酸的積累與新蝶呤或可溶性腫瘤壞死因子受體等免疫活性標(biāo)記物呈相關(guān)性，當(dāng)炎癥存在時，苯丙氨酸以及酪氨酸和苯丙氨酸比值均升高，為急性缺血性卒中、冠心病等心血管疾病提供新的診斷思路[20-21]。絲氨酸和蘇氨酸是蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的前體，作為糖酵解的分支，通過轉(zhuǎn)換成甘氨酸參與碳代謝，為鞘磷脂和磷脂的合成提供頭基，參與腫瘤過程線粒體一碳途徑[22-23]。在免疫細(xì)胞中，機體炎癥因子激活絲氨酸/蘇氨酸激酶-24，抑制IL-17誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化，降低IL-17誘導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，是IL-17介導(dǎo)的信號和炎癥的正向調(diào)節(jié)器[24]。研究也表明，隨著炎癥的加劇，參與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)的mTOR途徑和GCN-2途徑也與絲氨酸/蘇氨酸激酶密切相關(guān)[25]。炎癥的加劇促進(jìn)了絲氨酸和蘇氨酸代謝，含量升高。課題組前期結(jié)果表明，盆腔炎大鼠子宮內(nèi)膜厚度增加、輸卵管堵塞和粘連、炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高，在盆腔炎大鼠中觀察到苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸的升高表明炎癥的加劇，給予夏枯草莖葉酚酸治療后，苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸下降，炎癥反應(yīng)減輕[26]。

抗壞血酸作為一種氧化劑，通過免疫調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解炎癥有較多報道，如減輕氧化鋅納米顆粒引起的肺急性炎癥[27]，緩解硫酸右旋糖酐所致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的氧化應(yīng)激[28]，抑制白細(xì)胞中髓過氧化物酶-H2O2-鹵化物系統(tǒng)的活化[29]。D-葡萄糖醛酸是抗壞血酸合成途徑的前體物質(zhì)，參與抗壞血酸和醛糖二酸代謝途徑。在本研究中，經(jīng)過混合菌液感染后，機體免疫應(yīng)激反應(yīng)激活，促進(jìn)了抗壞血酸的合成和釋放，D-葡萄糖醛酸含量相比于正常組明顯增加。經(jīng)過夏枯草莖葉酚酸干預(yù)后，炎性介質(zhì)及免疫應(yīng)激反應(yīng)有所改善，D-葡萄糖醛酸含量降低。

綜上所述，本研究基于GC-MS技術(shù)探究夏枯草莖葉水提物對慢性盆腔炎大鼠血清代謝變化的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠經(jīng)混合菌液感染后，機體免疫反應(yīng)激活，促進(jìn)了抗壞血酸的合成和釋放，刺激炎癥反應(yīng)。經(jīng)過夏枯草莖葉酚酸干預(yù)后，炎癥反應(yīng)緩解，其機制可能與作用于COBT、ADH1C、MAOB等靶點，干預(yù)PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路和內(nèi)分泌抵抗等信號通路，引起差異代謝物變化有關(guān)。本研究的完成，證明了夏枯草莖葉的藥用價值，可為實現(xiàn)中藥非藥用部位的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

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