基于網絡藥理學及實驗驗證探討芎芪方治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學初步預測芎芪方治療心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）的活性成分、作用靶點及信號通路，通過動物實驗驗證其可能的作用機制。方法 通過TCMSP、UniProt數據庫獲取芎芪方藥理作用的活性成分及相關靶點；通過GeneCards、OMIM以及DRUGBANK數據庫獲取MIRI相關靶點；通過STRING平臺進行PPI分析，構建PPI網絡。通過DAVID數據庫分析“芎芪方成分-靶點”及其參與的生物學過程及信號通路，采用Cytoscape 3.9.1軟件構建“芎芪方-MIRI靶點-通路”網絡。36只SD雄性大鼠隨機均分為假手術組、模型組及芎芪方組，芎芪方組預防性灌胃給藥（3.6 g·kg-1），假手術組、模型組灌胃給予等量生理鹽水，均灌胃14 d。通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法建立實驗性MIRI大鼠模型。造模結束后，腹主動脈取血，ELISA法檢測大鼠血清肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；HE染色觀察心肌病理改變；Western blot法檢測心肌組織原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）蛋白表達。結果 初步篩選獲得芎芪方活性成分22個，藥物疾病交集基因125個，其中蛋白激酶B1（akt serine/threonine kinase 1，AKT1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、環氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等靶點可能與芎芪方預防MIRI密切相關，富集分析預測芎芪方預防MIRI主要涉及低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor，HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）信號通路、晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end product，AGE）-糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycosylation end product，RAGE）信號通路及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等。動物模型驗證結果提示，芎芪方可有效減輕MIRI大鼠心肌細胞損傷程度，降低MIRI大鼠血清CK-MB、LDH、MDA、TNF-α、IL-6水平（Plt;0.01），提高SOD水平（Plt;0.01），降低MIRI大鼠心肌組織JUN蛋白表達（Plt;0.01）。結論 芎芪方可能通過抑制TNF-α、IL-6、JUN等靶點，減輕MIRI大鼠心肌炎性反應，發揮治療MIRI的作用。

〔關鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷；芎芪方；網絡藥理學；作用機制；益氣活血法；炎性因子

〔中圖分類號〕R285.5 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.014

Mechanism of action of Xiongqi Formula in treating myocardial

ischemia-reperfusion injury based on network pharmacology and experimental verification

CHEN Ming， CHEN Cong*， LIAO Jing， YU Si'ao， QIN Haochang

School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To preliminarily predict the active ingredients， targets， and signal pathways of Xiongqi Formula （XQF） in treating myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） based on network pharmacology， and to verify the possible mechanism of action through animal experiments. Methods The active ingredients and related targets of XQF in its pharmacological action were obtained by TCMSP and UniProt， and the related targets of MIRI were obtained from GeneCards， OMIM， and DRUGBANK. PPI analysis was performed on the STRING platform to construct the PPI network. The \"XQF ingredients-targets\" and their biological processes and signaling pathways involved were analyzed through DAVID. Then， the \"XQF-MIRI targets-pathways\" network was constructed using Cytoscape 3.9.1 software. Thirty-six male SD rats were averagely randomized into sham-operated group， model group， and XQF group. XQF group was given prophylactic administration of the corresponding medication by gavage （3.6 g·kg-1）， and the sham-operated and model groups were given the same amount of normal saline by gavage， for 14 d respectively. The rat model of MIRI was established by ligating the left anterior descending coronary artery in rats. After the modeling， the blood was collected from the abdominal aorta of the rats， and the serum creatine kinase-MB （CK-MB）， malondialdehyde （MDA）， lactate dehydrogenase （LDH）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， and superoxide dismutase （SOD） were determined by ELISA. Myocardial pathological changes were observed by HE staining. Additionally， the protein expression of Jun proto-oncogene （JUN） in the myocardial tissue was examined by Western blot. Results A total of 22 active ingredients of XQF were obtained， as well as 125 XQF-MIRI intersection genes， among which akt serine/threonine kinase 1 （AKT1）， interleukin-1β （IL-1β）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， and other targets may be closely related to the prevention of MIRI by XQF. Enrichment analysis predicted that the prevention of MIRI by XQF mainly involved hypoxia-inducible factor （HIF-1） signaling pathway， tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， advanced glycosylation end product （AGE）-receptor of advanced glycosylation end product （RAGE） signaling pathway， mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， etc. Animal experimental verification showed that XQF effectively alleviated the myocardial cell injury in MIRI rats， decreased the serum levels of CK-MB， LDH， MDA， TNF-α， and IL-6 （Plt;0.01）， increased SOD level （Plt;0.01）， and reduced JUN protein expression in the rat myocardial tissue （Plt;0.01）. Conclusion Xiongqi Formula may play a role in treating MIRI by inhibiting TNF-α， IL-6， JUN， and other targets to reduce myocardial inflammatory response in MIRI rats.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 myocardial ischemia-reperfusion injury; Xiongqi Formula; network pharmacology; mechanism of action; the method of benefiting qi and circulating blood; inflammatory factor

隨著人口老齡化加速，不健康飲食、身體活動不足和吸煙等與心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）密切相關的不良生活方式流行，我國CVD發病率和死亡率仍在升高，其中缺血性心臟病、出血性腦卒中和缺血性腦卒中是中國CVD死亡的三大主要原因[1]。目前，缺血性心臟病的主要治療方法仍然是及時恢復血液灌注以挽救缺血性心肌，并采用溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療快速恢復缺血性心肌的血液循環。但治療后，可能出現心肌抑制、心律失常，甚至不可逆的心肌損傷等進行性加重病理現象，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），其嚴重影響缺血性心臟病患者的治療效果。因此，如何減輕MIRI成為CVD治療亟須解決的重要問題[1-3]。

MIRI是多種病理、生理因素及多通路、多機制交互作用的結果，其發生發展機制目前尚未被完全闡明。臨床常用策略在MIRI的長期預后及終端器官的保護方面獲益甚微，而中藥及其復方具有廣泛的藥理活性，可以通過多靶點、多途徑預防和治療MIRI[4]。芎芪方原方名為川芎黃芪湯，源于《普濟方·損胎》，主治“傷胎腹痛，下黃汁”，黃芪與川芎等比配伍。課題組在原方的基礎上去秫米，用于臨床防治CVD療效顯著。課題組前期研究加味丹參飲組分抗MIRI發現，黃芪與川芎發揮效益明顯[5]，黃芪可能通過調節心肌細胞能量代謝、保護線粒體功能、減少細胞凋亡和鈣超載等方式發揮抗MIRI的作用；川芎可能通過降低再灌注損傷后全血肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶含量，減小大鼠心肌梗死面積，從而減輕MIRI[6-7]。氣虛血瘀證是MIRI臨床常見證型之一[8]，而芎芪方中黃芪與川芎相配伍，氣旺則血行，活血而不傷正，共奏益氣活血之功，在治療MIRI方面具有一定潛力，但其多環節、多靶點作用的確切機制還未明確。

網絡藥理學結合醫學、生物學等多學科理論與計算機科學技術對生物系統進行網絡數據分析，能夠系統、綜合、整體地反映藥物對疾病的干預機制[9-10]，這與中醫藥論治的整體動態性原則及復方多成分、多靶點、多途徑互相作用具有相同的特點，為進一步揭示中藥復方的科學內涵提供了有效的技術支持[5，11]。因此，本研究通過使用網絡藥理學技術方法，探究芎芪方調治MIRI的分子機制，并進行初步動物實驗驗證，為后續更進一步研究提供必要的理論與實驗基礎。

1 方法

1.1 "芎芪方有效成分-靶點網絡圖的構建

通過TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索黃芪、川芎藥物的活性成分、靶點，根據中藥成分藥代動力學參數篩選活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）閾值≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）閾值≥0.18為限定條件，得到芎芪方有效活性成分。使用SwissTargetPrediction數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）查找活性成分的靶點，得到芎芪方作用的蛋白靶點。再使用UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/uniprot/）規范靶點蛋白英文名，并統一為基因名稱。將結果導入Cytoscape 3.9.1，構建芎芪方組成藥物-藥物成分-靶點網絡圖。

以“myocardial ischemia reperfusion injury”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https：//www. genecards.org）、OMIM數據庫（http：//www.omim.org）和DRUGBANK數據庫（https：//www.drugbank.ca）搜索MIRI的蛋白靶點，合并以上３個疾病數據庫結果，并去除重復項后得到MIRI相關靶點。

1.2 "芎芪方有效成分-MIRI靶點網絡構建及核心靶點篩選

為明確芎芪方的活性成分、靶點與MIRI之間的交互作用，使用Venny 2.1工具取兩者交集靶點并繪制韋恩圖。將交集靶點輸入至STRING 11.5數據庫（https：//string-db.org）構建PPI網絡模型，并通過Cytoscape 3.9.1對數據進行可視化與數據分析，篩選核心靶點。

1.3 "芎芪方有效成分-MIRI靶點功能與通路的富集

在DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov）中進行GO和KEGG信號通路富集分析，選擇“Functional annotation tool”功能，物種設為“Homo sapiens”，將芎芪方調治MIRI的靶點輸入，獲取芎芪方治療MIRI相關的主要信號通路與生物學過程，采用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對數據結果進行可視化。

1.4 "芎芪方有效成分-MIRI靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.9.1構建芎芪方-MIRI-通路網絡圖，利用Cytoscape 3.9.1內置分析工具計算有效成分及靶點的網絡拓撲參數，并根據結果獲取核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 動物實驗驗證

2.1 "實驗藥物

芎芪方：黃芪20 g（批號：CK22090503）、川芎20 g（批號：CK22062708），飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室龔力民教授鑒定，均為正品。浸泡，煎煮，去渣，水煎濃縮至藥液濃度為1.8 g·mL-1（含生藥），于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 "實驗動物

于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購進36只雄性SD大鼠，SPF級，體質量（150±20） g，動物合格證號：430727221102522415，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心清潔級動物房（相對濕度50%～70%，溫度23～25 ℃，晝夜交替），普通飼料，自由攝食飲水。本實驗由湖南中醫藥大學倫理委員會批準，動物實驗倫理編號：LL2022080403。

2.3 "主要試劑及儀器

4%多聚甲醛通用型組織固定液、JUN抗體、GAP？鄄

DH抗體、ECL化學發光試劑（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BL539A、BM4168、BM1623、AR1196）；HE染色液（珠海貝索生物技術有限公司，批號：C210904）；大鼠肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：2210R19、2210R26、2210R23、2210R06、2210R12、2210R11）。

TGL-16型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；VE-180型電泳槽、VE-60微型垂直槽多板灌膠器、VE-186型轉移電泳槽、Tanon5200型全自動化學發光成像分析系統（上海天能科技有限公司）；SCIENTZ-1500F型超聲破碎儀、SCIENTZ-24型組織勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2.4 "動物分組及給藥

將36只雄性SD大鼠按照隨機數字表法分為3組：假手術組、模型組、芎芪方組，每組12只。于實驗室飼養，籠內適應性飼養1周后，芎芪方組按照成人與大鼠的體表面積換算等效劑量[12]，灌胃芎芪方3.6 g·kg-1，假手術組、模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續灌胃給藥14 d。末次給藥12 h后，進行造模。

2.5 "模型制備及取樣

手術造模制備MIRI實驗大鼠模型[8]，大鼠腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉，按照40 mg·kg-1進行麻醉，麻醉成功后，連接心電圖，切開氣管，于切口處接小動物呼吸機，沿左胸4、5肋間切開，暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐之間下約2 mm處進針，用6-0縫合線結扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min。左側心肌壁發白，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，QRS波群改變，J點偏移超過0.1 mV為結扎成功標志，結扎30 min后松開結扎線實現再灌注，ST段出現回落，可見梗死區心肌充血，表明再灌注成功，再灌注120 min，心電圖見圖1。假手術組僅穿線不結扎。腹主動脈取血，４ ℃、3 000 r/min（離心半徑5.5 cm）離心10 min后取血清用于指標檢測。完成腹主動脈取血后，立即取心臟組織，沖洗盡血液后，病理染色觀察所用樣本，用4%多聚甲醛液進行固定。

2.6 "指標檢測

2.6.1 "ELISA法檢測大鼠血清CK-MB、SOD、LDH、MDA、TNF-α、IL-6水平 "采用ELISA法檢測各組大鼠血清CK-MB、SOD、LDH、MDA、TNF-α、IL-6水平，實驗步驟按照試劑盒方法進行操作。

2.6.2 "HE染色觀察大鼠心肌組織損傷情況 "沿左心室冠狀面中部切取固定后的心臟組織環狀心肌組織塊，使用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋，切片烘干后再使用HE染色液染色，光學顯微鏡下觀察結果并采集圖像。

2.6.3 "Western blot法檢測心肌組織JUN蛋白表達

取100～200 mg組織樣本，切碎。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入酶抑制劑，每100 mg樣本加入1 mL的RIPA裂解液，用勻漿器充分研磨勻漿（在冰上進行），置冰上裂解1 h，轉至1.5 mL離心管，以4 ℃、10 000 r/min離心10 min（離心半徑 6 cm），取上清液。采用BAC法測定各樣本蛋白濃度，并調整一致；加入等體積蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性。依次進行SDS凝膠電泳、轉膜、抗原封閉，加入一抗JUN（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）孵育過夜。再加入羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。最后，加ECL工作液于印跡膜上30～60 s，吸干發光液，置印跡膜于成像分析儀自動成像。以GAPDH蛋白條帶灰度值為內參，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.7 "統計學分析

數據結果導入SPSS 25.0軟件進行分析，結果用“ｘ±s”表示，數據符合正態分布和方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 "芎芪方有效活性成分及藥物-成分-靶點網絡圖的構建

使用TCMSP數據庫檢索芎芪方組成藥物的活性成分，根據中藥成分藥代動力學參數篩選活性成分，獲得活性成分22種（表1）。通過SwissTargetPrediction數據庫查找活性成分的靶點，并使用UniProt數據庫將靶點蛋白英文名統一規范為基因名稱，獲得對應靶點458個。

運用Cytoscape 3.9.1構建芎芪方藥物-靶點網絡圖（圖2）。網絡分析表明，槲皮素連接度為146，介度為0.735，緊密度為0.631，預測槲皮素為復方的主要成分。其次為山柰酚，連接度為58，介度為0.132，緊密度為0.421。環氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）在網絡中的連接度為17，介度為0.055，緊密度為0.514，預測PSTG2為芎芪方的最主要靶點，核受體共激活因子2亦為相對重要的靶點。

3.2 "芎芪方-MIRI靶點PPI網絡構建及核心靶點篩選

通過GeneCards數據庫獲得MIRI靶點2 039個，從OMIM數據庫與DRUGBANK數據庫共補充獲得靶點51個，合并后去除重復值，最終得到1 807個MIRI疾病靶點。

將檢索處理后的芎芪方靶點與MIRI疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，得到交集靶點125個（圖3）。隨后將交集靶點輸入至STRING 11.5平臺，得到芎芪方-MIRI靶點PPI網絡（圖4），網絡圖包括125個節點，2 552條邊。將在STRING 11.5平臺獲取的結果文件導入Cytoscape 3.9.1中，使用內置分析工具對內容進行分析（圖5），從圖可看出蛋白激酶B1（akt serine/threonine kinase 1，AKT1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、PTGS2、原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）等在網絡中連接程度較高，說明這些靶點可能是芎芪方預防MIRI的關鍵靶點。

3.3 "芎芪方-MIRI靶點功能與通路的富集

通過DAVID數據平臺對芎芪方治療MIRI的核心靶點進行富集分析，GO功能分析結果顯示，生物過程（biological process，BP）289個，分子功能（molecular function，MF）61個、細胞組成（cellular component，CC）27個，KEGG信號通路111條，將log10（P）值排名前15的結果借助微生信平臺進行可視化處理。結果表明，芎芪方主要參與的BP包括：RNA聚合酶Ⅱ啟動子對pri-miRNA轉錄的正向調控、血管生成、基因表達的正向調控、缺氧應激反應、炎癥反應等（圖6）；其涉及的CC主要為大分子復合物、染色質、轉錄因子復合體、細胞質、細胞核、線粒體（圖7）；其涉及的MF主要集中在酶結合、蛋白質結合、轉錄因子活性、一氧化氮合成酶活性、細胞活性因子（圖8）；涉及的通路則包括低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end product，AGE）-糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycosylation end product，RAGE）信號通路及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等（圖9）。

3.4 "芎芪方有效成分-MIRI靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.9.1構建芎芪方有效成分-MIRI靶點-通路網絡（圖10）。通過Cytoscape 3.9.1內置的NetworkAnalyzer分析芎芪方治療MIRI網絡拓撲學參數，得到核心成分及作用靶點。Cytoscape網絡分析表明，PTGS2在網絡中的連接度為22，介度為0.058，緊密度為0.502，預測PTGS2為芎芪方治療MIRI的重要靶點。

3.5 "動物實驗驗證結果

3.5.1 "芎芪方對MIRI大鼠心肌病理變化的影響 "假手術組大鼠的心肌組織無明顯異常；模型組血管充血嚴重，心肌纖維排列紊亂且間隙擴大，局部呈波紋狀或部分斷裂，伴有炎性細胞點狀浸潤，心肌細胞結構模糊且排列紊亂；與模型組相比，芎芪方組大鼠心肌纖維紊亂、炎性細胞浸潤、心肌細胞走形及血管充血情況有一定程度減輕。詳見圖11。

3.5.2 "芎芪方對MIRI大鼠血清CK-MB、SOD、LDH、MDA表達的影響 "與假手術組相比，模型組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA、TNF-α、IL-6含量均明顯升高（Plt;0.01），SOD含量明顯降低（Plt;0.01）；與模型組相比，芎芪方組大鼠血清CK-MB、LDH、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯下降（Plt;0.01），SOD含量明顯升高（Plt;0.01）。詳見表2、圖12。

3.5.3 "芎芪方對MIRI大鼠心肌組織JUN蛋白表達的影響 "與假手術組比較，模型組大鼠JUN蛋白表達顯著上調（Plt;0.01）；與模型組比較，芎芪方組大鼠JUN蛋白表達明顯減少（Plt;0.01）。詳見圖13。

4 討論

中醫學根據MIRI的臨床癥狀將其歸為“胸痹”“真心痛”“心悸”范疇，“心脈痹阻”為其基本病機，其病理性質為本虛標實，以氣虛為本，以血瘀為標。電子醫療數據分析、橫斷面調查等研究提示氣虛血瘀為冠心病臨床主要證型[13]。清代王清任《醫林改錯·論抽風不是風》記載：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣必停留為瘀。”臨床常以益氣活血法治療氣虛血瘀證，芎芪方中黃芪與川芎相配，氣旺則血行，活血而不傷正，共奏益氣活血之功。

本研究結果顯示，槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分與MIRI蛋白靶點相互作用最多，提示可能在防治MIRI過程中起到關鍵作用。有研究發現，槲皮素可通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，減輕MIRI過程中的炎性反應；下調細胞間黏附分子-1表達，減少中性粒細胞浸潤和上調蛋白激酶Cε的表達，減輕氧化應激反應[14-15]。山柰酚可抑制張力蛋白同系物，提高Akt通路信號表達，降低細胞凋亡，進而保護MIRI[16]。芒柄花素可能通過上調核因子E2相關因子2與血紅素氧合酶1的表達，減輕MIRI過程中的炎癥反應和氧化應激水平[17]。

PPI網絡顯示，AKT1、IL-6、PTGS2、JUN等可能是治療MIRI的核心靶點。AKT1是影響心肌細胞生理功能的核心靶點之一，激活AKT1可以調控相關通路，影響細胞的增殖、凋亡、自噬等過程[18]。IL-6與炎性反應有關，可使中性粒細胞與血管內皮細胞發生黏附反應，誘導中性粒細胞滲出、浸潤，損傷心肌細胞[19]。PTGS2是前列腺素內源性過氧化物合酶（post-transcriptional gene silencing，PTGS）的兩個異構酶之一，PTGS及其產物參與血壓調節、炎癥反應、凝血平衡等多種生理病理過程[20]。JUN是激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的組成部分，AP-1與炎癥性疾病的發病進展有密切關系，多種生長因子、細胞因子可激活AP-1，活化的AP-1通過與含有佛波酯反應元件識別序列的靶基因結合，調控基因轉錄和蛋白質合成，參與調節細胞增殖、凋亡等生理病理過程[21-22]。

GO及KEGG通路富集分析結果顯示，芎芪方通過酶結合、蛋白質結合、轉錄因子活性、一氧化氮合成酶活性、細胞活性因子等過程參與MIRI的炎癥和免疫反應，主要涉及HIF-1、TNF、AGE-RAGE及MAPK等信號通路。HIF-1信號通路中的HIF-1α在MIRI中有重要的作用，降低HIF-1α過表達可下調NF-κB和胱天蛋白酶3表達，抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的釋放，抑制機體炎癥反應和心肌細胞凋亡，而HIF-1α沉默會加重心肌細胞的損傷[23]。TNF信號通路上的TNF-α主要由巨噬細胞和T淋巴細胞產生，TNF-α誘導大量中性粒細胞黏附心肌細胞，釋放細胞毒性物質損害心肌細胞，參與缺血后的多種病理反應，包括心肌細胞水腫、炎癥反應、細胞凋亡等[24]。MAPK信號通路中的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）在細胞增殖、凋亡和炎癥反應中起重要作用，心肌缺氧時產生的活性氧激活p38MAPK，與心肌細胞損傷密切相關，抑制p38MAPK蛋白磷酸化可減輕受損心肌組織細胞氧化應激和炎癥反應[25-26]。

綜合網絡藥理學研究結果，發現炎癥反應可能是MIRI過程中心肌損傷的主要機制之一，心肌細胞的正常生理功能依賴于促炎因子和抗炎因子之間的相互制約，在缺血心肌恢復灌注時，促炎因子IL-6、TNF-α會過度表達，促進白細胞黏附、聚集、浸潤，進而導致心肌細胞損傷[27-28]。動物實驗驗證芎芪方與炎性反應靶點。實驗結果顯示，芎芪方能減輕MIRI大鼠心肌纖維紊亂損傷、炎性細胞浸潤、心肌細胞走形及血管充血情況；芎芪方能降低MIRI大鼠血清CK-MB、LDH、MDA的含量，升高SOD含量，提示芎芪方能有效抗MIRI；芎芪方能降低MIRI大鼠血清TNF-α、IL-6的表達水平，提示芎芪方可能通過調控TNF-α、IL-6等核心蛋白靶點，減輕血清炎癥反應，從而保護缺血再灌注損傷心肌。芎芪方能降低MIRI大鼠心肌組織JUN蛋白的表達，可能通過影響AP-1抑制心肌炎性反應[21-22]。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法探究芎芪方的有效活性成分及其治療MIRI的潛在靶點和信號通路，并針對兩者間的炎性反應靶點進行實驗驗證，發現芎芪方可能通過槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分作用于IL-6、TNF-α、JUN等核心蛋白靶點，改善MIRI大鼠心室結構和功能，其機制可能與下調心肌炎性反應有關。課題組后續將進行芎芪方藥物黃芪、川芎的配比研究，并進一步完善動物實驗及細胞實驗對關鍵信號通路加以驗證。本研究體現了中醫藥防治MIRI的多靶點、多途徑的治療特點，為臨床應用提供了新的理論支撐，為闡明芎芪方防治MIRI的潛在作用機制提供了新的方向和思路。

參考文獻

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