基于3種加倍方法下的玉米單倍體加倍效果研究

摘要：本試驗以3個誘導(dǎo)系吉科誘101、吉科誘108、吉科誘115作為父本，以吉科玉919為母本，進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)試驗。結(jié)果表明吉科誘115的誘導(dǎo)表現(xiàn)最為優(yōu)異，因此利用吉科誘115所誘導(dǎo)出的單倍體籽粒，分別進(jìn)行秋水仙素浸種、除草劑處理和自然加倍等處理，對比探究各處理的單倍體加倍效果。得出以下結(jié)果：用0.15%濃度的秋水仙素浸種12h的加倍效果最好，單倍體加倍率達(dá)到9.94%。

關(guān)鍵詞：玉米 單倍體 浸種加倍 除草劑加倍 自然加倍

玉米在雜種優(yōu)勢利用中起步較早，常規(guī)育種中自交系至少要經(jīng)過6個世代才能培育成功，而單倍體育種作為玉米育種核心技術(shù)之一，能夠在短時間內(nèi)培育出純合自交系[1-2]。自1996年單倍體育種被發(fā)現(xiàn)以來，已被廣泛應(yīng)用在選育良種、生產(chǎn)研究等方面。然而，作為目前唯一利用遺傳方法進(jìn)行單倍體規(guī)模化選育的農(nóng)作物，玉米單倍體加倍過程中普遍存在加倍率偏低和加倍效果不夠穩(wěn)定的問題。

目前被廣泛采用的單倍體加倍方式包括自然加倍、藥劑加倍和除草劑加倍等，不同處理的加倍效果不盡相同[3-4]。近年來隨著植物激素的發(fā)展，一些新方法被用于提高單倍體加倍率和擴(kuò)大種質(zhì)資源利用范圍。一般認(rèn)為使用化學(xué)除草劑加倍效果顯著、簡便易行、不損傷幼苗、藥害殘留較少[5-6]。本試驗在誘導(dǎo)材料和栽培條件一致的條件下，研究秋水仙素與化學(xué)除草劑（甲基胺草磷）在不同濃度梯度及不同處理時間條件下三種方法對單倍體加倍率效果的影響，為單倍體加倍技術(shù)對玉米育種的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）供試材料

本研究用遺傳基礎(chǔ)相同的吉科玉919作母本，用自主選育的誘導(dǎo)系吉科誘101、吉科誘108、吉科誘115作父本進(jìn)行雜交，從F1代果穗籽粒中鑒定篩選出單倍體，同時對誘導(dǎo)效率高的誘導(dǎo)系所誘導(dǎo)出的單倍體進(jìn)行進(jìn)一步的加倍試驗。同時，利用已獲得的高頻誘導(dǎo)系對準(zhǔn)單倍體再進(jìn)行加倍實驗。

（二）試驗方法

1. 雜交誘導(dǎo)試驗。2022年12月，在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院南繁育種基地，以自主選育的玉米品種吉科玉919為母本，以3個高頻誘導(dǎo)系吉科誘101、吉科誘108和吉科誘115為父本進(jìn)行雜交。采收脫粒后選擇籽粒尖端糊粉層呈紫色，但胚部或者胚芽尖無色，并且胚面變小，凹陷加深的種子作為準(zhǔn)單倍體，記錄其單倍體誘導(dǎo)率[9]。

2. 單倍體加倍實驗。吉科誘115在3個品種中展現(xiàn)出了最為顯著的誘導(dǎo)效果。2023年5月于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院玉米育種試驗田進(jìn)行栽培試驗，對吉科誘115成功誘導(dǎo)的單倍體籽粒分別設(shè)置秋水仙素浸種、除草劑加倍、自然加倍的不同處理試驗，每個處理設(shè)置單倍體籽粒400粒。后期栽培試驗設(shè)置每小區(qū)行長3.75m，寬0.6m，其他管理措施同大田。

秋水仙素浸種加倍實驗：用秋水仙素與二甲基亞砜溶液（DMSO）浸泡種子，秋水仙素制成三種不同濃度的（0.05%、0.15%和0.20%）溶液，每種溶液5L、配以2.0%DMSO溶液進(jìn)行浸泡（6h、12h、24h），觀測幼苗的生長發(fā)育情況。處理前清水浸泡種子12h，處理后清水漂泡6h后播種[7]。

除草劑加倍試驗：以1%的肥皂水、0.1%的吐溫80（TWEEN-80）溶液，分別配制30、50、90和150μmol/ L濃度的甲基胺草磷溶液。分別選取生長至三葉期及五葉期且生長發(fā)育狀況一致的單倍體幼苗，以每株1mL的處理于植株心葉處滴加配制好的除草劑溶液，觀察單倍體植株生長狀況。

自然加倍試驗：對準(zhǔn)單倍體籽粒不施藥劑，僅人工輔助授粉。

（三）測定項目

單倍體誘導(dǎo)率、雜株率、單倍體成活率和加倍率的測定按成鍇方法進(jìn)行。

二、結(jié)果與分析

（一）誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體效率

母本為具有相同遺傳基礎(chǔ)的玉米種質(zhì)，父本分別為誘導(dǎo)系吉科誘101、吉科誘108和吉科誘115，雜交后篩選部分果穗鑒定誘導(dǎo)率。由表1可見，母本為同一種質(zhì)時，3個誘導(dǎo)系中吉科誘115的誘導(dǎo)效果最好，達(dá)到10.79%，而吉科誘101誘導(dǎo)率最低，為5.89%。

（二）單倍體加倍率

1. 秋水仙素浸種加倍

由表2可知，在秋水仙素的不同處理下，單倍體成活率變幅在0-44.83%之間，并與浸泡時間及浸泡濃度成負(fù)相關(guān)。在處理的濃度與時間達(dá)最大值的情況下，單倍體的成活率與結(jié)實株數(shù)都為零。秋水仙素的濃度在0.05%時，24h處理單倍體的加倍率最大，達(dá)到6%，加倍率平均值達(dá)到4.16%;在0.15%濃度和12h處理下，單倍體加倍率達(dá)到9.94%，在所有處理下加倍效果最好，加倍率平均達(dá)到8.15%;在0.2%的處理濃度和6h的處理時間下單倍體的加倍率最大，達(dá)到3.26%，而平均加倍率只有1.70%。表明使用秋水仙素加倍單倍體過程中，不同濃度及浸泡時間帶來的結(jié)果相差很大，試驗中應(yīng)控制藥劑濃度及浸泡時間以防止幼苗中毒。

2. 除草劑加倍。由表3可見，甲基胺草磷溶液在不同濃度下處理準(zhǔn)單倍體籽粒整體成活率相差較小，最高為70.17%，整體成活效果好于秋水仙素。在不同濃度的處理下，其單倍體成活率為90μmol/Lgt;50μmol/Lgt;30μmol/Lgt;150μmol/L。表明準(zhǔn)單倍體籽粒在甲基胺草磷的不同濃度處理下加倍效果及成活率均有短暫先升高后降低的變化趨勢，且以90μmol/L時效果最好。

3. 自然加倍。對比表4可以看出，自然加倍成活株率在三種方法里中最高，達(dá)76.93%。但是單倍體的加倍率非常低，只有3.49%，加倍的效果沒有秋水仙素和除草劑的效果好。

三、結(jié)論與討論

（一）影響單倍體誘導(dǎo)率的因素

不同母本材料的單倍體誘導(dǎo)率及成活率亦存在顯著差異[7-8]。在此基礎(chǔ)上，栽培及種植條件的差異會顯著影響單倍體誘導(dǎo)率[9]。本研究將遺傳基礎(chǔ)相同的育種材料作為母本、誘導(dǎo)效率高的吉科誘108誘導(dǎo)系作為父本，采取完全一致的手段進(jìn)行人工雜交后篩選準(zhǔn)單倍體籽粒進(jìn)一步進(jìn)行加倍試驗，結(jié)果與王東[9]等的結(jié)論一致。

（二）化學(xué)試劑在加倍技術(shù)中的應(yīng)用

單倍體加倍的效率是單倍體育種至關(guān)重要的影響因素，生育前期生長溫度及細(xì)胞本身等因素均對單倍體自然加倍有不同程度地影響，大部分玉米品種的自然加倍率一般不超過10%，為了達(dá)到育種目標(biāo)，必須進(jìn)行人工加倍。秋水仙素通過阻止有絲分裂中期紡錘絲微管的收縮，阻止復(fù)制的染色體向細(xì)胞極性遷移，使染色體數(shù)量倍增，從而達(dá)到染色體加倍的目的而被廣泛應(yīng)用于單倍體育種。秋水仙素可以通過誘導(dǎo)植物的幼根、幼芽和幼苗等對植株進(jìn)行染色體加倍。孫貴星[10]和段民孝[11]的研究表明，對于單倍體籽粒的加倍，秋水仙素浸種處理和甲基胺草磷加倍處理均表現(xiàn)出顯著的效果。與除草劑處理相比，秋水仙素浸種處理具有操作繁瑣、費(fèi)用高昂等弊端，而使用除草劑則可減少環(huán)境污染、毒性低、易降解，同時也能降低單倍體死苗或畸形率。本試驗研究還表明，在除草劑甲基胺草磷溶液中，在不同濃度下，準(zhǔn)單倍體籽粒整體存活率顯著高于秋水仙素浸種;在除草劑甲基胺草磷溶液中，在不同濃度下，準(zhǔn)單倍體籽粒整體存活率顯著高于秋水仙素浸種。

（三）化學(xué)加倍的比較

試驗設(shè)置了秋水仙素不同濃度梯度和浸種處理時間，結(jié)果表明：當(dāng)濃度為0.15%時，浸泡12 h加倍率最大，達(dá)到9.94%;當(dāng)濃度為0.2%時單倍體加倍率最小，成活率為0;隨著劑量增加，植株生長速度加快，葉片變短變窄。采用甲基胺草磷加倍法建立不同濃度的除草劑處理，當(dāng)濃度為90μmol/L時，其加倍率高達(dá)8.68%，且單倍體的平均成活率明顯優(yōu)于秋水仙素浸種。本研究發(fā)現(xiàn)了用不同劑量甲基胺草磷對玉米幼苗進(jìn)行加倍處理后其植株生長狀況及生理指標(biāo)變化情況均發(fā)生改變。據(jù)惠國強(qiáng)等[12]人的研究，這是由于除草劑本身所具備的比秋水仙素更為顯著的優(yōu)點(diǎn)，以及植物染色體加倍的巨大潛力，再加上甲基胺草磷誘導(dǎo)細(xì)胞分裂中期微核更高效和更頻繁，這些因素共同作用的結(jié)果。

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基金項目：吉林省大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202311439015）;玉米遺傳育種科技創(chuàng)新團(tuán)隊。

作者簡介：陳蕊，吉林松原人，在讀本科，研究方向為玉米遺傳育種與高產(chǎn)栽培。

通訊作者：于海燕，吉林吉林人，高級實驗師，研究方向為玉米遺傳育種與高產(chǎn)栽培。