華蟾素調控PI3K/AKT通路逆轉卵巢癌A2780/DDP細胞順鉑耐藥的作用機制

舒美玲,吳 悅,葉映泉,張爽爽,張 梅

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一,致死率位居其中首位[1]。手術和以鉑或紫杉醇為基礎的化療是卵巢癌的初始治療[2]。但多數患者會發生化療耐藥出現腫瘤復發轉移且后續治療效果不佳,這是導致卵巢癌病死率較高的主要原因之一。華蟾素(cinobufagin,CBG)是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥表皮和腺體分泌物中通過水提醇沉法提取出來的生物活性成分,目前廣泛應用于抗惡性腫瘤治療,在肝癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均表現出顯著的抑癌效果[3]。已有研究[4]顯示CBG能抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲促進其凋亡。但對于CBG能否逆轉卵巢癌細胞對順鉑(cisplatin,DDP )的耐藥性以及其機制研究的報道較少。現利用CBG處理A2780/DDP細胞探討CBG對卵巢癌鉑耐藥的逆轉機制,以期為CBG治療卵巢癌提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人卵巢癌細胞株A2780和人卵巢癌細胞株順鉑耐藥株A2780/DDP購自中國科學院上海細胞生物所;順鉑注射液(貨號:H2001074)購自江蘇豪森藥業集團有限公司;CBG注射液(貨號:國藥準字Z34020273)由安徽華潤金蟾藥業股份有限公司提供;PI3K/AKT-IN-2抑制劑(貨號:2684412-41-5)購自美國MCE公司;RIPA1640培養基(貨號:C11875500BT)和胎牛血清(貨號:A5670701)購自美國Gibco公司;ABW 基質膠(貨號:0827045)購自上海諾娃醫藥科技有限公司;EdU試劑盒(貨號:C0071S)和Hoechst試劑盒(貨號:C0003)均購自碧云天生物技術有限公司;磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase, PI3K)(貨號:R27768)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT) 又名蛋白激酶B (protein kinase B, PKB)(貨號:R23412)、E鈣黏蛋白(貨 號:340341)、 N鈣黏蛋白(貨號:380671)抗體購自成都正能生物技術責任有限公司;逆轉錄試劑盒 (貨號:Q111-02)和RT-qPCR 試劑盒(貨號:R222-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1人卵巢癌細胞株的培養 A2780和A2780/DDP細胞貼壁培養于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素和0.1%支原體清除劑的RIPA1640培養基中,置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中。細胞密度達80%時進行傳代。此外,A2780/DDP細胞在傳代貼壁后另給予1 μg/ml順鉑以維持耐藥性。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力 分別取對數生長期A2780和A2780/DDP細胞,按照8×103個/孔的密度接種于96孔板,細胞貼壁后按實驗設計分別給藥: DDP(2.5、5、10、20、40、80、100、160 μmol/L),CBG(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/ml)于24、36、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl,避光孵育1.5 h后讀取562 nm處光密度(optical density,OD)值。計算DDP對A2780和A2780/DDP細胞或CBG對A2780/DDP細胞的半數抑制濃度(median inhibitory concetration,IC50),并計算出A2780/DDP的耐藥指數(resistance index,RI)=IC50(A2780/DDP)/IC50(A2780) 。CBG(0、2、4、6 mg/ml)處理24 h后再加入梯度濃度DDP(2.5、5、10、20、40、80、100、160 μmol/L),24 h后加入CCK-8溶液10 μl,避光孵育1.5 h后讀取562 nm處OD值,計算CBG的逆轉指數(reversal fold,RF)=IC50(0 mg/ml )/IC50(2、4、6 mg/ml)CBG[5]。實驗獨立重復 3 次,設3個復孔。

1.2.3實驗分組 根據CBG的IC50值和逆轉耐藥指數設計實驗分組:對照組(12.5 μmol/L DDP)、低劑量組(12.5 μmol/L DDP+2 mg/ml CBG)、中劑量組(12.5 μmol/L DDP+4 mg/ml CBG)、高劑量組(12.5 μmol/L DDP+6 mg/ml CBG)、抑制劑組(12.5 μmol/L DDP+6 mg/ml CBG+6 μmol/L PI3K/AKT抑制劑)。

1.2.4平板克隆實驗評估細胞的克隆增殖能力 將A2780/DDP細胞按500個/孔的密度接種于6孔板中,待細胞貼壁生長后按分組更換含藥培養基。持續培養2周,期間每隔4 d換液。培養結束后,棄廢液,用PBS洗凈,每孔加入800 μl 4%多聚甲醛溶液固定細胞。40 min后吸棄多聚甲醛溶液,再每孔加入1 ml結晶紫染色,20 min后用PBS輕緩沖洗至6孔板無染料殘留,晾干后拍照。使用ImageJ軟件分析計算克隆形成率。每組設3個復孔,實驗重復 3 次。

1.2.5EdU和Hoechst法評估細胞的增殖和凋亡情況 將A2780/DDP細胞按1×104/孔接種于鋪有14 mm爬片的24孔板中,每孔含有500 μl完全培養基。待細胞貼壁生長后,按分組配制工作液進行換液。48 h后按照EdU試劑盒進行細胞的固定和標記。Hoechst實驗前期鋪板同EdU實驗,48 h后按照Hoechst試劑盒進行細胞的固定和標記。染色后在熒光顯微鏡下拍照。并采用ImageJ軟件統計增殖或凋亡細胞數量。每組設3 個復孔,實驗重復3 次。

1.2.6細胞劃痕實驗評估細胞水平遷移能力 將A2780/DDP細胞按6×105個/孔接種于6孔板,培養24 h后,用200 μl槍頭在細胞上劃“一”字劃痕,PBS洗滌3次,用無血清培養基配制各組培養液,進行換液。在0、24、48 h的時間點分別拍照,ImageJ軟件分析24 h和48 h的劃痕寬度比,細胞遷移率=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。每組設3 個復孔,實驗重復3 次。

1.2.7Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力 將A2780/DDP細胞懸浮于含2%血清的完全培養基中,按4×105個/孔接種于含100 μl不同工作液的Transwell小室。細胞貼壁后下室加入含10%血清培養液600 μl,繼續培養24 h后取出小室,用甲醛固定30 min,結晶紫染色30 min,PBS洗2次,用棉簽輕輕擦拭小室內部未穿膜過的細胞,室溫晾干。侵襲實驗前用基質膠將Transwell小室濕化(不含血清的培養液以1 ∶8比例稀釋基質膠,加80 μl/孔稀釋好的基質膠在小室中,放培養箱中靜置32 h),其余步驟同前法。最后將小室底部用顯微鏡拍照,采用ImageJ軟件統計遷移細胞數量。每組設3 個復孔,實驗重復3 次。

1.2.8Western blot檢測PI3K/AKT信號通路和EMT相關蛋白的表達 在1.2.3項實驗分組基礎上增加A2780細胞組(12.5 μmol/L DDP),藥物處理48 h后收集各組細胞的總蛋白,加入上樣緩沖液,100 ℃、5 min煮沸變性后室溫冷卻,-20 ℃保存待用。根據所測蛋白分子量配制相應濃度分離膠,加樣,電壓65 V 30 min后,轉150 V 60 min進行電泳,恒壓200 mA 120 min轉印至NC膜上,5%脫脂牛奶封閉60 min后與一抗(母液 ∶一抗稀釋液=1 ∶1 000)孵育過夜,TBST洗膜3次,與二抗(母液 ∶二抗稀釋液=1 ∶10 000)室溫孵育60 min后,TBST洗膜3次,使用的增強型化學發光試劑顯影并拍照。ImageJ軟件分析相對蛋白含量,用各條帶灰度值/內參條帶的灰度值表示,每組實驗重復3 次。

1.2.9RT-qPCR法檢測PI3K/AKT信號通路和EMT相關mRNA 的表達 使用總RNA提取試劑盒提取總RNA,采用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,參照SYBR-Green PCR試劑盒說明書進行RT-qPCR實驗。引物序列見表1,GAPDH作為內參,采用2-△△CT法分析目的基因在不同組別之間的表達差異,每組實驗重復3次。

表1 引物序列

2 結果

2.1 A2780/DDP細胞耐藥性的鑒定及CBG對A2780/DDP細胞耐藥性的影響如圖1A-1C所示,DDP作用于細胞24、36、48 h后,A2780/DDP的IC50值分別為68.89±0.269、62.743±1.071、52.433±0.176,A2780的IC50值為12.233±0.059、10.7±0.625、9.206±0.193,在DDP的各濃度作用下,A2780/DDP細胞的細胞活力明顯高于A2780細胞,差異有統計學意義(F=16,P<0.05 ),RI值分別為5.636、5.864、5.695。如圖1D顯示:CBG作用于細胞24、36、48 h后,對A2780/DDP的IC50分別為32.337±1.374、22.48±0.501、9.681±0.101,根據CBG作用A2780/DDP細胞48 h的IC50值與24 h 或36 h的IC50值相比顯著降低(F=540.4,P<0.05),選擇48 h為后續實驗工作時間,并將CBG對A2780/DDP細胞作用48 h后的20%(2 mg/ml)、40%(4 mg/ml)、60%(6 mg/ml)的抑制濃度作為逆轉耐藥實驗的低、中、高劑量。圖1E顯示:處理48 h后,低、中、高劑量的CBG對A2780/DDP耐藥的逆轉倍數分別為1.617、2.570、3.461。

圖1 A2780/DDP對DDP的耐藥性分析以及CBG對其耐藥性的逆轉作用(n=3)

2.2 CBG對A2780/DDP克隆形成能力的影響

A-C:DDP處理24、36、48 h后A2780和A2780/DDP細胞的活力曲線;D:CBG處理后不同時間點A2780/DDP細胞生長活力曲線;E:0、2、4、6 mg/ml CBG處理A2780/DDP細胞后DDP對細胞生長的活力曲線圖2顯示:與對照組的細胞克隆數目相比,CBG低劑量、中劑量、高劑量組的細胞克隆數目隨CBG藥物劑量增加而減少,其中抑制劑組的細胞克隆數目最少,差異有統計學意義(F=310.2,P<0.05)。

圖2 CBG抑制A2780/DDP細胞克隆形成能力(n=3)

2.3 CBG對A2780/DDP細胞遷移和侵襲能力的影響劃痕實驗顯示(圖3A) :CBG處理24 h或48 h后,與對照組相比,低、中、高劑量組的CBG呈時間和濃度依賴性地抑制了細胞劃痕愈合率,其中抑制劑組的細胞劃痕愈合率最低,差異有統計學意義(24 h:F=105.9,P<0.01,48 h:F=59.2,P<0.01)。Transwell實驗顯示(圖3B):與對照組相比,各組細胞處理24 h后,遷移和侵襲細胞數目呈現濃度依賴性的減少,其中抑制劑組細胞的遷移和侵襲能力顯著降低,細胞數目最少,差異有統計學意義(P<0.000 1)。

圖3 CBG抑制A2780/DDP的遷移和侵襲能力(n=3)

2.4 CBG對A2780/DDP細胞的凋亡和增殖能力影響EdU染色實驗結果顯示:與對照組相比,隨著CBG濃度升高,耐藥細胞的增殖率隨之降低,其中抑制劑組的細胞增殖率最低,差異有統計學意義(F=190.4,P<0.01)。Hoechst染色實驗結果顯示:與對照組相比,耐藥細胞的凋亡率隨著CBG濃度增加而上升,其中抑制劑組的細胞凋亡率最高,差異有統計學意義(F=389.6,P<0.01),見圖4。

圖4 CBG抑制A2780/DDP細胞增殖促進其凋亡(n=3)

2.5 CBG對A2780/DDP細胞PI3K/AKT信號通路以及EMT相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示(圖5):與 A2780細胞相比,對照組(A2780/DDP)細胞的P-PI3K/PI3K(t=8.115,P<0.01)和P-AKT/AKT(t=17.62,P<0.01)的蛋白水平相對比值更高,而E-cadherin(t=4.620,P<0.01)的蛋白表達水平更低,同時N-cadherin(t=6.126,P<0.01)、Vimentin(t=4.001,P<0.01)、Snail(t=17.333,P<0.01)的蛋白表達水平更高。此外,CBG呈濃度依賴性地抑制PI3K、AKT的蛋白磷酸化,與對照組相比,P-PI3K(F=268.5,P<0.01)、P-AKT(F=190.5,P<0.01)、N-cadherin(F=24.02,P<0.000 1)、Vimentin(F=57.65,P<0.01)、Snail(F=87.24,P<0.01)的蛋白表達量減少,其中抑制劑組上述蛋白的表達量最少。但在各濃度組CBG處理后A2780/DDP細胞中的E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高,在抑制劑組中表達量最多(F=135.8,P<0.000 1)。

圖5 卵巢癌A2780/DDP細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白和EMT相關蛋白的表達水平的影響(n=3)

2.6 CBG對A2780/DDP細胞PI3K/AKT信號通路以及EMT相關mRNA表達的影響RT-qPCR實驗結果顯示(圖6):CBG呈濃度依賴性地降低PI3K(F=101.1,P<0.01)、AKT(F=558.3,P<0.01)、N-cadherin(F=86.97,P<0.01)、Vimentin(F=105.9,P<0.01)、Snail(F=85.71,P<0.01),增加E-cadherin(F=80.96,P<0.01)的mRNA表達,其中抑制劑組的PI3K、AKT、N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表達量最少,E-cadherin的表達水平最高,差異有統計學意義。

圖6 A2780/DDP細胞中PI3K/AKT信號通路和EMT相關mRNA的表達水平的影響(n=3)

3 討論

CBG能抑制PI3K/AKT通路或EMT發揮抗腫瘤作用,Li et al[6]的研究表明CBG可顯著上調HepG2、SMMC-7721和SNU-368細胞中的E-cadherin并下調N-cadherin、Snail、slug和ZEB1的表達水平,從而抑制HepG2荷瘤小鼠的肺轉移。CBG不僅具有直接抗腫瘤增殖侵襲的作用,還能逆轉腫瘤耐藥性,在聯合放療、化療治療過程中發揮增敏作用[7]。Liu et al[8]報道了 CBG能抑制鼻咽癌中的 MYH9/GSK3β/β-連環蛋白及下游的腫瘤干細胞特性和 EMT信號,從而顯著抑制 EBV-miR-BART22 誘導的DDP耐藥性。Su et al[9]研究了CBG的有效成分蟾毒靈對卵巢癌耐藥的作用,結果顯示蟾毒靈能下調卵巢癌耐藥細胞中EMT相關蛋白表達,在體內抑制卵巢癌細胞的生長、遷移和侵襲,從而提高卵巢癌患者對DDP敏感性。此外,臨床基礎研究證實,CBG進入人體代謝活動,活化后對人體內存在的癌細胞具有很強的直接殺傷能力,目前CBG廣泛應用于多種腫瘤疾病的輔助或聯合用藥治療,并取得較好的臨床治療效果。林梅英 等[10]的meta分析結果顯示CBG注射液聯合療法能提高中晚期非小細胞肺癌患者近期療效和生存率、改善生活質量、緩解疼痛、降低不良反應。另一項來自袁福建 等[11]的研究顯示CBG能夠提高肝癌介入治療效果,改善患者的免疫功能、肝功能儲備和生存情況。

PI3K/AKT信號的過度激活與化療耐藥性和癌癥轉移密切相關,抑制PI3K/AKT信號可恢復卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[12-13],故抑制PI3K/AKT通路的藥物可能成為卵巢癌耐藥的逆轉劑。通過PI3K/AKT信號通路能調控下游EMT,而EMT的發生在卵巢癌耐藥過程中起到了重要的作用。Zhao et al[14]研究發現成纖維細胞生長因子受體3可促進表皮生長因子受體磷酸化并激活PI3K/AKT信號轉導,從而減少細胞凋亡并促進EMT過程,進而導致卵巢癌細胞對順鉑產生耐藥性。

本研究顯示CBG處理后能恢復A2780/DDP細胞的順鉑敏感性,降低RI,呈濃度依賴性地抑制耐藥細胞增殖、遷移和侵襲能力,促進其凋亡。平板克隆、Transwell、EdU實驗結果顯示CBG聯合PI3K/AKT抑制劑對耐藥細胞的抑制作用明顯優于單獨使用CBG組(P<0.05)。Western blot和RT-qPCR實驗結果表明相比于親本株,A2780/DDP細胞中的PI3K/AKT信號通路和EMT相關蛋白以及mRNA的表達水平更高(P<0.05),提示A2780/DDP細胞中存在PI3K/AKT信號的過度激活和EMT的發生,通過抑制PI3K/AKT信號可降低A2780/DDP細胞的抗藥性。此外,與對照組相比,不同濃度 CBG處理組細胞中的P-PI3K/PI3K及P-AKT/AKT的蛋白表達比值、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白和mRNA表達水平呈現隨著藥物濃度升高而下降的趨勢,相反E-cadherin表達量隨CBG濃度升高而增加(P<0.05),表明CBG能下調PI3K/AKT信號通路和抑制EMT過程。抑制EMT和PI3K/AKT信號通路的激活是逆轉卵巢癌順鉑耐藥的兩個重要作用靶點,而CBG能抑制EMT和PI3K/AKT信號通路,有望成為卵巢癌鉑耐藥的有效逆轉劑。

綜上所述,CBG能誘導人卵巢癌A2780/DDP耐藥細胞的凋亡,減弱其增殖、遷移和侵襲能力,其潛在的機制可能與調控PI3K/AKT信號通路和抑制 EMT過程有關。本研究有助于闡明CBG作為卵巢癌鉑耐藥逆轉藥物的可行性,同時為CBG逆轉卵巢癌鉑耐藥提供理論依據,以期為卵巢癌臨床治療方案提供新的思路。