碳酸酐酶9在口腔鱗癌中的表達及其預后診斷價值

李曉宇,李麗娜,高瑞,馬欣

(1.河南省人民醫院 口腔科,河南 鄭州 450000;2.寧夏醫科大學總醫院 口腔科,銀川 寧夏 750000;3.鄭州市第七人民醫院 口腔科,河南 鄭州 450000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)起源于鱗狀上皮,其發生率在所有惡性腫瘤中排第9[1-2],且近些年其發病率有年輕化趨勢[3]。OSCC的致病因素眾多,除了先天遺傳因素外,煙、酒、檳榔為主要的后天致病因素[4]。據統計,全球每年新診斷口腔癌病例超過300 000例,且每年總死亡人數超過140 000例[5]。OSCC的預后與其分期密切相關,據統計,Ⅰ期5 a生存率為80%,Ⅱ期為65%,Ⅲ期和Ⅳ期5 a生存率分別為49%和30%[6-7]。因此,尋找有價值的生物標志物和治療靶點對于OSCC的預后至關重要。

碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CA9)是一種跨細胞膜金屬蛋白酶,在調節體內pH值和細胞生長、黏附方面發揮重要作用[8]。CA9通過催化二氧化碳合成碳酸氫鹽和質子,促進腫瘤環境酸化,導致腫瘤易發生轉移和對弱堿性抗癌藥物的化療耐藥[9]。研究表明,CA9在乳腺癌[10]、肺癌[11]、腎癌[12]等多種惡性腫瘤中表達異常。本研究通過生信分析和相關的實驗檢測探討CA9的表達水平與OSCC臨床病理參數的相關性及其預后診斷價值,為臨床OSCC的早期診斷和治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 標本收集

課題組成員于2017—2021年在河南省人民醫院口腔頜面外科隨機收取了86對已配對完成的OSCC組織及癌旁組織標本。5對新鮮的OSCC組織及其配對癌旁組織(癌灶外≥5 mm的正常組織)于2020—2022年隨機收集,EP管液氮罐轉運,置于-80 ℃冰箱中保存備用。所有患者均無糖尿病等嚴重并發癥,術前均未行放、化療,且均接受手術切除,術后配合適當的放療或化療。組織學診斷和OSCC臨床分級由本研究2名工作者共同判定。本研究內容已通過醫院醫學倫理委員會審查,所有受試對象知情同意。此外,通過腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載OSCC患者的mRNA表達譜信息(格式為TPM,平臺為RNAseq)。

1.2 細胞培養

口腔鱗癌細胞系(SCC-15、CAL-27、HSC-3、SCC-25)置于高糖DMEM培養基中培養,人正常口腔角質形成細胞置于無血清培養基中培養,補充1%(質量分數)角質形成細胞生長因子加上皮生長因子混合物。在全部培養基中按順序分別加入10%(體積分數)胎牛血清和100 U·mL-1青、鏈霉素,所有培養基均放置在37 ℃,含5% CO2的恒溫培養箱中孵育,注意按時換新的細胞培養液(2～3 d)。

1.3 定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)

取新鮮組織50～80 mg,提取總RNA。熒光定量PCR引物采用引物設計軟件Primer Premier 5.0,設計完成后用PubMed Blast程序對所有堿基對序列進行驗證。PCR反應過程在LightCyc1er480實時熒光定量PCR儀內完成,按照PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。按照說明書的反應條件進行,反應完畢后利用PCR儀中的軟件繪制擴增曲線和融解曲線,算得每個樣本的Ct值。每個樣本均重復檢驗3次。ΔCt求得組織中mRNA的相對量。引物設計:CA9上游引物5’-CGGCAAGTTGTCGGAGACG-3’,下游引物5’-CCTGGAGGTTGGGATGCTCT-3’;β-actin上游引物 5’-AGGGAAATCGT GCGTGAC-3’,下游引物5’-CGCTCATTGCCGATAGTG-3’。

1.4 免疫組化染色

將包埋好的蠟塊使用切片機沿矢狀長軸切片,制備5 μm切片,經脫蠟、水化后用內源性過氧化物酶進行阻斷處理,檸檬酸鈉鹽緩沖液修復抗原,滴加50 μL封閉液在組織切片上,放在濕盒之中在37 ℃條件下孵育30 min,滴加一抗、二抗,顯色,復染,濃度梯度逐漸升高的酒精(50%、75%、95%、100%)脫水,使用二甲苯洗凈切片表面,最后加中性樹脂1滴,蓋上玻片,封片,待干片后顯微鏡下拍照。

最終的染色結果由本院兩位病理科醫生通過雙盲法進行評估,隨機選取5個不同的視野,發現棕褐色的顆粒出現在細胞質或細胞核內為陽性表達,根據染色的強度和染色細胞的百分數分級。染色強度的分級如下:0,無染色;1+,淺色染色;2+,中度染色;3+,重染色。染色面積的分級如下:0,無染色;1+,<30%組織染色為陽性;2+,30%～60%組織染色為陽性;3+,>60%組織染色為陽性。以染色強度和染色面積的評分之和評估CA9表達,<3分為CA9低表達,≥3分為CA9高表達。

1.5 隨訪

患者手術后,每6個月隨訪1次,截至2022年6月,詳細記錄所有OSCC患者的總生存期,并保證所有OSCC患者(除死亡外)均接受3 a以上的隨訪,如有中途失訪者,則記錄最后一次隨訪時間。隨訪形式以致電患者本人或其家屬為主,以患者門診復診為輔。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 生物信息學分析CA9 mRNA在OSCC中的表達

在TCGA數據庫中,CA9mRNA在OSCC組織中的表達高于正常組織(P<0.001),見圖1A。在32例配對的OSCC組織和癌旁組織中,CA9mRNA在OSCC組織中的表達也高于其配對癌旁組織(P<0.001),見圖1B。為了進一步評估CA9mRNA在人類惡性腫瘤中的表達,分析了TCGA數據庫中CA9mRNA在泛癌中的表達水平,結果顯示CA9mRNA在浸潤性乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、胃腺癌等絕大多數惡性腫瘤中表達異常(P<0.05),見圖1C。

A為TCGA數據庫中CA9 mRNA的表達;B為32例配對的OSCC組織和癌旁組織中CA9 mRNA的表達;C為CA9 mRNA在泛癌中的表達;CA9為碳酸酐酶9。圖1 TCGA數據庫中CA9 mRNA在OSCC和其他腫瘤組織中的表達

2.2 qRT-PCR檢測CA9 mRNA在OSCC組織和癌旁組織中的表達

為了驗證TCGA數據庫的分析結果,通過qRT-PCR檢測CA9mRNA的表達水平,結果表明CA9mRNA在5對OSCC組織中的表達高于配對癌旁組織(P<0.01),見圖2。

CA9為碳酸酐酶9;OSCC為口腔鱗狀細胞癌;**表示P<0.01。圖2 qRT-PCR檢測CA9在5對OSCC組織和癌旁組織中的表達

2.3 免疫組化檢測CA9在OSCC組織和癌旁組織中的表達

OSCC組織中CA9蛋白的表達高于癌旁組織(P<0.05),見圖3。

A為癌旁組織中CA9蛋白表達;B為OSCC組織中CA9蛋白的表達;CA9為碳酸酐酶9;OSCC為口腔鱗狀細胞癌。圖3 CA9蛋白在OSCC組織中高表達

2.4 CA9在OSCC組織中的表達與臨床病理特征的相關性

根據免疫組化結果分為CA9低表達和高表達組,相關性分析結果表明,CA9的表達高低與淋巴結轉移、臨床分期相關(P<0.05),見表1。

表1 CA9在OSCC中的表達與患者臨床病理特征的相關性

2.5 CA9高表達與OSCC預后不良有關

Kaplan-Meier生存分析表明,CA9高表達組OSCC患者的總生存率低于低表達組(P<0.05),見圖4A。進一步分析CA9對OSCC預后的診斷價值,發現CA9高表達組中OSCC患者的總生存率、疾病特異性生存率均低于低表達組(P<0.05),見圖4B、C,受試者工作特征曲線的曲線下面積為0.966(95% CI:0.945～0.986),見圖4D,提示CA9高表達與OSCC預后不良有關,可能對OSCC有一定的診斷價值。淋巴結轉移、組織分化程度、CA9表達水平與OSCC患者的總生存率有關,見表2,且淋巴結轉移(HR=0.472,95% CI:0.294～0.756,P=0.012)、CA9表達水平(HR=5.269,95% CI:1.535～18.087,P=0.008)均是OSCC患者預后的獨立預測因素(P<0.05)。

表2 OSCC患者預后影響因素的單因素和多因素分析

A為CA9高、低表達組中OSCC患者的總生存率;B為TCGA數據庫中,CA9高、低表達組中OSCC患者的總生存率;C為TCGA數據庫中,CA9高、低表達組OSCC患者的疾病特異性生存率;D為生存曲線。圖4 CA9對OSCC的預后診斷價值

3 討論

OSCC是一種發病率和病死率均較高的惡性腫瘤,早發現、早治療對于提高OSCC患者的總生存率至關重要。近年來,靶向治療在惡性腫瘤中逐漸廣泛應用,在治療乳腺癌、胃癌和結腸癌上均取得了較好的效果[13]。然而,針對OSCC的特異性生物標志物尚未發現,臨床上針對OSCC的靶向治療并不成熟。因此,尋找針對OSCC治療、預后的生物標志物尤為重要。

檢測惡性腫瘤與其配對癌旁正常組織中差異基因的表達對腫瘤標志物的發現具有重要意義。所以本課題組首先對TCGA數據庫中OSCC的mRNA表達譜進行分析,發現CA9在OSCC組織中高表達。CA9作為碳酸酐酶家族成員之一,通常在腫瘤缺氧區域高表達,對細胞內pH值的調控發揮重要作用,使腫瘤細胞逃逸酸中毒,并可作為腫瘤細胞遷移、侵襲的驅動因子,促進惡性腫瘤的轉移[14]。Alyaqubi等[15]研究表明CA9可作為急性白血病預后的潛在早期標志物。Mcdonald等[16]發現CA9可通過調節細胞pH值和糖酵解促進胰腺癌的生長。另一項研究表明,上調CA9可促進食管鱗狀細胞癌的增殖和轉移[17]。Hu等[18]研究發現CA9高表達與鼻竇鱗狀細胞癌患者預后不良有關,可作為鼻竇鱗狀細胞癌的獨立預后標志物和治療靶點。此外,CA9在膀胱癌[19]、結直腸癌[20]、腎癌[12]等惡性腫瘤中也表達失調。

然而,關于CA9在OSCC中的研究較少,本研究通過qRT-PCR、免疫組化檢測了CA9在OSCC組織和癌旁組織中的表達,發現CA9在OSCC組織中的表達高于癌旁組織,證實了TCGA數據庫的分析結果,這提示CA9可能促進OSCC的發生發展。進一步的相關性分析結果表明,CA9的表達水平與OSCC臨床分期和淋巴結轉移具有相關性。Kaplan-Meier生存分析顯示,CA9高表達組OSCC患者的總生存期短于低表達組,表明CA9高表達與患者的不良預后相關。單因素分析結果表明OSCC預后與組織分化程度、淋巴結轉移、CA9的表達有關,而多因素分析表明CA9的表達和淋巴結轉移均是OSCC預后的獨立預測因子。最后,利用TCGA數據庫評估了CA9對OSCC的診斷價值,曲線下面積為0.966,表明CA9可能對OSCC具有一定的診斷意義。

4 結論

本研究結果表明CA9在OSCC中高表達,是OSCC的一個預后標志物,并且可能對OSCC具有一定的診斷意義。然而,本研究也有一定的局限性,并不清楚CA9是通過何種途徑促進OSCC的,且納入的研究對象較少,下一步可聯合多中心大樣本檢測,開展更進一步的細胞生物學實驗,探索CA9促進OSCC的相關分子機制。