高表達UBE2B在食管癌中的臨床意義及其與免疫浸潤相關性*

錢曉瑜 盧志華 馮 洋 包一笑 許丁文

揚州市職業大學醫學院,江蘇省揚州市 225100

食管癌是常見的胸部惡性腫瘤,包括食管鱗狀細胞癌和腺癌。對可切除的食管癌病變,主要采用手術治療[1],但僅靠手術切除并不能達到滿意的療效。數據顯示,患者手術治療后局部復發和遠處轉移的概率較高,手術后近5年的生存率僅為30%左右[2]。隨著腫瘤免疫學研究的深入,免疫治療已成為降低食管癌患者總體死亡率的有效手段。免疫治療表現出特異性強、毒副作用小等優點,其可通過調節機體的特異性抗腫瘤免疫反應能力,起到消除腫瘤細胞擴散或轉移的作用[3],尋找食管癌的免疫治療靶點對于提高治療效果和增加生存率有重要意義。

組蛋白泛素化在調節DNA修復系統之間的相互作用中起著重要作用。UBE2B是泛素結合酶,參與RAD18介導的H2B和增殖細胞核抗原(PNCA)的泛素化,通過激活DNA聚合酶的DNA損傷耐受性繞過DNA復制介導的單鏈斷裂[4]。研究表明,UBE2B與多種腫瘤的發生發展密切相關。比如,UBE2B通過促進RAD18介導的ZMYM2單泛素化和穩定化促進食管癌生長[5]。在結直腸癌中,UBE2B的過度表達與術前患者的不良反應和低生存率有關[6]。UBE2B缺失通過抑制WNT/β-Catenin信號來破壞黑色素瘤表型的表達[7]。在三陰性乳腺癌中,UBE2B通過影響DNA跨損傷合成(translesion synthesis)介導順鉑耐藥[8]。但是關于UBE2B與食管癌的研究尚未明確。因此,本文運用生物信息學的方法,分析UBE2B對食管癌的作用,為食管癌治療靶點的挖掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 UBE2B在食管癌中的表達分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)工具中的 TCGA Gene analysis功能分析UBE2B在TCGA食管癌樣本中的表達情況,UBE2B的表達量以TPM(transcript per million)表示。

1.2 UBE2B表達量與食管癌患者預后相關性分析 通過PrognoScan(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)分析GEO數據庫中的GSE11595數據集高表達或低表達UBE2B與食管癌總體生存率相關性分析。利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析工具UBE2B的表達量與TCGA樣本中所有食管癌患者的總體生存率(OS)相關性。再通過Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis)進行高表達或低表達UBE2B與食管腺癌或者鱗癌患者OS相關性分析。

1.3 UBE2B在放化療食管癌患者中的表達以及化療敏感性分析 食管癌患者術后放療數據來自TCGA,通過cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)下載,利用非配對T檢驗進行分析。化療敏感及耐藥數據來自GEO公共數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE13525數據集,下載提取UBE2B表達數據后進行非配對T檢驗分析。運用DepMap平臺分析CCLE細胞數據庫 (https://depmap.org/portal/)食管癌細胞系中UBE2B的基因效應(gene effect)與常用的食管癌化療藥物敏感性的相關性[9]。

1.4 UBE2B表達與食管癌免疫浸潤相關性分析 利用HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org/)中Immune菜單分析UBE2B在HPA dataset和Monaco dataset兩個免疫細胞數據集中的表達。利用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析UBE2B表達與食管癌免疫細胞浸潤相關性,通過GEPIA在線工具驗證UBE2B與中性粒細胞標志分子CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)以及免疫檢查點(check points) PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4的相關性。

1.5 抑制UBE2B的化合物及藥物預測 通過比較毒物基因組學數據庫(Comparative Toxicogenomics Database,CTD base;https://ctdbase.org/)預測抑制UBE2B的表達或活性的化合物及藥物,然后通過cytoscape(https://cytoscape.org/)進行可視化。

2 結果

2.1 UBE2B在食管癌組織中的表達 通過UALCAN工具挖掘TCGA數據分析發現,UBE2B在食管癌中的表達顯著高于正常食管組織(P<0.05),見圖1a。而且,亞洲人種的表達要顯著高于高加索人種(P<0.05),見圖1b,食管癌的2、3、4分期要顯著高于1期的(P<0.05),見圖1c;淋巴結轉移的(N1、N2、N3)要顯著高于無淋巴結轉移(N0)的(P<0.05),見圖1d。

圖1 食管癌UBE2B mRNA表達分析

2.2 UBE2B與食管癌患者生存預后相關性分析 prognoscan分析GEO數據集GSE11595也顯示,UBE2B高表達與患者的低總體生存率(OS)顯著相關(P<0.05),見圖2a。通過GEPIA分析TCGA食管癌患者數據發現,UBE2B高表達與患者的低總體生存率顯著相關(P<0.05),見圖2b。進一步通過Kaplan-Meier Plotter分析發現,UBE2B高表達與腺癌患者的低總體生存率顯著相關(P<0.05),見圖2c,而鱗癌的低總體生存率無顯著性(P=0.081),見圖2d。

圖2 UBE2B表達量與食管癌患者生存率相關性

圖3 UBE2B與食管癌放化療效果相關性分 析

2.3 UBE2B與食管癌放化療相關性分析 腫瘤的治療是影響患者預后的重要因素。我們接著研究UBE2B對食管癌患者放療、化療影響。TCGA數據顯示,術后放療的患者UBE2B顯著低于未放療的患者(P<0.05),見圖3a,說明UBE2B可能是放療的靶基因。此外,GEO數據GSE45670顯示,放化療無反應(non-responder)的患者UBE2B顯著高于放化療有反應(responder)的患者(P<0.05),見圖3b,而且ROC曲線顯示UBE2B可以作為判斷食管癌患者放化療反應的有效標志物(AUC=0.77,P<0.05),見圖3c。此外,CCLE細胞數據庫也顯示,在食管癌細胞系中,UBE2B的基因效應(gene effect)與順鉑化敏感性顯著負相關(P<0.05),見圖3d,但是與5-氟尿嘧啶和紫杉醇無顯著相關(P>0.05),見圖3e～f。上述結果說明,UBE2B在食管癌中高表達可能通過影響患者的放化療效果而導致不良預后。

2.4 UBE2B與食管癌腫瘤中性粒細胞浸潤相關性分析 HPA數據庫中HPA數據集和Monaco數據集顯示,UBE2B在中性粒細胞中表達最高,具有相對特異性(見圖4a～b)。TIMER工具也顯示UBE2B與TCGA食管癌樣本的中性粒細胞免疫浸潤正相關(P<0.05),見圖4c,而且UBE2B的表達量與中性粒細胞的經典標志物CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)正相關(P<0.05),見圖4d～e。

圖4 UBE2B表達量與食管癌中性粒細胞浸潤相關性分析

2.5 UBE2B與食管癌腫瘤T淋巴細胞浸潤相關性分析 T細胞免疫干預是目前常用的免疫治療手段。本研究發現,UBE2B高表達與食管癌患者的CD8陽性T細胞顯著正相關(P<0.05),見圖5a,而與CD4陽性T細胞無顯著相關(P>0.05),見圖5b。此外,UBE2B 與腫瘤免疫治療靶點PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4正相關,其中PD-L1(CD274)、CTLA4具有顯著性差異(P<0.05),見圖5c～e。上述結果說明UBE2B與食管癌免疫浸潤相關,并且有可能作為食管癌免疫治療的潛在靶點。

圖5 UBE2B表達量與食管癌T淋巴細胞浸潤相關性分析

2.6 抑制UBE2B的化合物及藥物預測 為了提供通過干預UBE2B表達及活性來治療食管癌的線索,我們通過CTD base預測靶向于UBE2B的藥物。共篩選出23種化合物或藥物能降低UBE2B表達及活性(見圖6),這些化合物或者藥物可以作為后續干預UBE2B治療食管癌提供線索。此外,預測結果包括常用化療藥物順鉑(cisplatin),這也從側面驗證了2.3結果中高表達UBE2B與食管癌患者的放化療反應相關。

圖6 抑制UBE2B的化合物及藥物預測

3 討論

食管癌作為當今最常見的腫瘤之一,對它的治療已經從傳統的手術、放療、化療擴展到結合腫瘤免疫手段進行治療。以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點阻斷(Immune checkpoint blockade, ICB)治療可抑制負性調控信號,使T細胞從衰竭狀態中釋放出來,降低腫瘤免疫逃逸的可能性,逆轉免疫抑制微環境,從而顯著改善預后[10]。通過尋找耐藥或者免疫相關基因,可以為腫瘤的治療提供治療靶點。本文綜合利用表達分析、相關性分析、預后分析等生物信息學手段,首次證明了UBE2B在食管癌中高表達并且與患者的預后、放化療反應、腫瘤免疫浸潤顯著相關。

本研究通過權威數據庫TCGA分析發現UBE2B在食管癌中的高表達,而且高表達UBE2B與患者的多種臨床參數顯著相關,比如人種、分期、淋巴結轉移等,這意味著UBE2B一方面有可能在不同特征的食管癌中作用不同,一方面UBE2B的表達量有可能成為診斷不同臨床特征的食管癌亞型的標志物之一。高表達UBE2B與低總生存率顯著相關,這意味著UBE2B可能是食管癌的發病進程的促進因子,而且有可能作為食管癌預后的標志物。

腫瘤對治療的反應是影響患者預后的重要因素。食管癌的標準治療僅限于手術或內窺鏡切除和化學放射治療[11]。大約一半的食管癌患者有遠處轉移,這些患者主要通過化療方案進行治療,如5-氟尿嘧啶、順鉑和他汀類藥物的組合[12]。然而,由于食管癌的異質性,它本身就對化療有抵抗力。本研究發現UBE2B的表達量能夠被放療影響,而且可作為判斷放療、化療反應性的有效標志物。而且本研究也進一步在食管癌細胞系中發現UBE2B的基因效應與順鉑的敏感性成正相關。這就意味著我們也許可以通過干預UBE2B的表達實現改善食管癌患者放療、化療的效果,本研究最后也通過CTD base預測了能干預UBE2B的化合物和藥物,為下一步研究提供線索。后續研究需要運用分子生物學實驗技術驗證UBE2B對食管癌放化療的作用,比如細胞系中敲低或過表達UBE2B后觀察細胞對放化療的反應,同時需要進一步通過動物實驗、臨床試驗進一步驗證。UBE2B與紫杉醇、5-氟尿嘧啶的敏感性雖然也是負相關,但是無顯著性,這有可能是因為數據量不足引起,后續研究可以通過體外實驗,增加樣本量以確認UBE2B對紫杉醇、5-氟尿嘧啶的影響。

近年來,食管癌免疫療法一直在進行臨床前或臨床研究,包括腫瘤疫苗接種、免疫檢查點抑制和采用T細胞療法等[13],越來越多的研究表明,免疫治療與化療相結合抑制劑比單獨免疫治療或者單獨化療更有效[14]。本研究發現UBE2B與食管癌CD8陽性淋巴細胞浸潤相關,而且與PD-L1(CD274)、CTLA4相關。這意味著UBE2B與食管癌CD8陽性淋巴細胞免疫調節相關,而且有可能作為免疫治療的潛在靶點。此外,本研究發現,UBE2B在中性粒細胞中特異性表達,而且與食管癌中性粒細胞浸潤正相關。已經有研究表明食管癌患者圍手術期中性粒細胞的浸潤與患者的不良預后相關[15],而且食管鱗狀細胞癌周圍的中性粒細胞聚集與區域淋巴結轉移密切相關[16],因此UBE2B的高表達可能通過影響中性粒細胞的食管癌浸潤而影響疾病的發展及患者的預后。

綜上所述,本研究證明了UBE2B在食管癌中高表達,并且與患者的臨床參數、預后、放化療反應、免疫浸潤密切相關,為食管癌的病理基礎、診斷、化療以及免疫治療提供了參考。