海洋來源低溫果膠酶產生菌篩選、鑒定與酶學性質研究

趙子琪，劉燁瑀，于 爽，遲雪梅，金書寒，陳立功,4，張慶芳，王曉輝,*

（1.大連大學醫學院，遼寧大連 116000；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連 116622；3.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116622；4.深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司，廣東深圳 518000）

果膠是一種廣泛存在于植物細胞壁中的復雜多糖，主鏈是通過α-1,4-糖苷鍵聚合而成的D-吡喃半乳糖醛酸，側鏈則由各種多糖組成，如L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖等[1]。果膠酶（pectinase）是指能降解果膠物質的多酶復合體系，能夠降解果膠的多種結構[2]。根據果膠酶對果膠物質中半乳糖醛酸骨架的作用模式，可將該酶分為聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyase，PL）與果膠甲酯酶（pectin methyl esterase，PE）三大類[2]，不同的果膠酶切割果膠中不同類型的α-1,4-糖苷鍵[3-4]。根據最適酶活性pH 又可將其分為堿性和酸性兩大類[5-7]。堿性果膠酶主要應用于食品生產過程中，幫助分解果膠，改善產品的質地和口感[8]，對于胃腸道疾病患者來說，果膠的有效降解可以減輕胃腸道的負擔，改善消化吸收。此外，果膠酶還可以用于治療炎癥和腫瘤等疾病，其降解果膠的能力可以幫助減輕炎癥反應、促進腫瘤細胞的死亡[9-10]；在酒類釀造過程中分解果膠，促進酒液的澄清和過濾；預處理食品加工業中含果膠的廢水[11]，酸性果膠酶則主要用于提取和澄清果蔬汁和果酒，降低產品的渾濁度和黏度、選擇性水解組織中間薄片的多糖來保持植物細胞的完整性從而提高單細胞產品質量，單細胞產品可用作嬰兒制品、乳制品的成分[12]。

在果膠酶的天然來源中，微生物因其具有廣泛的適應性、多樣的代謝途徑、高效的酶系統以及生長周期短、培養條件易控制、分布廣等優勢而成為了果膠酶的主要來源[13]。其中真菌、細菌、放線菌和酵母菌等都能產生果膠酶[14-15]，尤其以曲霉屬最為常見[16-17]。目前，全球果膠酶市場正處于快速增長階段，幾乎占據全球酶市場的25%[18]。這主要得益于果制品行業的發展，以及人們對優質健康食品的需求增加。然而，相比于國外，我國對果膠酶的研究起步較晚[19-20]，無論是在研究水平、領域、手段方面還是開發應用方面與國外都存有一定差距[19-21]。尤其是缺乏產高活性酶的菌種，目前能應用于工業中的果膠酶多來源于真菌[22]，其大多存在產酶活性較低、能耗過高等問題，因而無法滿足工業生產上的需求，導致效價高的商品果膠酶產量仍很低。因此，找到一種新型優質菌種來制備果膠酶是非常有必要的，海洋環境具有高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養等特點，能很大程度上賦予微生物果膠酶新的代謝機制與基因特性，有利于優勢菌株的篩選。

本研究從海洋底泥樣品中篩選到一株高產低溫堿性果膠酶的放線菌，通過形態學、生理生化及16S rDNA 序列測定并構建系統發育樹分析確定該菌菌屬，并研究了其相關酶學性質，旨在發現新的優質低溫酶源微生物資源，推動相關行業發展，同時該研究為后續提取果膠酶基因進行克隆表達和高效、低能耗大批量生產果膠酶提供了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥樣品 中國遼寧省大連市渤海海域（121°78′85.74′ E，39°01′79.06′ N）60～100 m 深度處海底泥；果膠 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

Bioscreen C 自動微生物鑒定分析儀 Biolog 公司；CI－L 型顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司；BPC-150F 型培養箱 上海茸研儀器有限公司；Multiskan 1510 酶標儀 芬蘭Labsystems 公司；D-37520 低溫冷凍離心機 Thermo 公司；CRY-2112 恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司；DK-S600 電動恒溫水浴鍋 上海景洪實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 初篩培養基[21,23]（g/L）：果膠30.0，NaNO33.0，K2HPO4·3H2O 3.3，KCl 0.5，Fe2（SO4）30.01，（NH4）2SO420，MgSO40.24，CaCl20.15，KH2PO43.8，溴酚藍 0.2，瓊脂粉20.0，pH 自然。

基礎培養基（g/L）：酵母浸膏粉5.0，蛋白胨8.0，氯化鈉10.0，pH7.0。

發酵培養基[24]（g/L）：果膠2.0，K2HPO40.01，MgSO40.05，FeSO40.001，（NH4）2SO42.0，pH 自然。

1.2.2 菌株分離純化與初篩 稱取海泥10.0 g，置于裝有若干玻璃珠和90 mL 無菌水的250 mL 錐形瓶中，放于恒溫搖床，30 ℃、160 r/min、2 h 充分打散。再從上述錐形瓶取1 mL 加入到99 mL 基礎培養基中，25 ℃、180 r/min 富集培養24 h。用0.85%（m/V）無菌生理鹽水對菌懸液進行10 倍梯度稀釋，將梯度為10-1～10-7的樣品稀釋液各取200 μL 涂布到初篩培養基上（每個梯度做3 組平行實驗），25 ℃倒置培養48 h。待長出菌落后，及時挑取長勢良好、外觀不同的單菌落進行分離純化，后將純化過的菌株點種在初篩培養基上（每株菌做三組平行實驗），25 ℃倒置培養48 h。使用游標卡尺準確測量培養基上的黃色水解圈直徑（Dp）和菌落直徑（Dc）[21]，挑選出Dp/Dc 值較大的6 株菌株作為復篩的目標菌株[22]。

1.2.3 產果膠酶菌株的復篩 挑取初篩得到6 株單菌落分別接種于基礎培養基中，25 ℃、180 r/min培養24 h。以接種量為2%（v/v）將活化24 h 的培養物接種到發酵培養基（100/250 mL）中，25 ℃、180 r/min 發酵72 h。發酵液4 ℃、8000 r/min 離心20 min 后，取等量上清液適當稀釋作稀釋粗酶液，使用3,5-二硝基水楊酸法（DNS 法）[25]制作葡萄糖標準曲線并測定酶活進行復篩，底物為0.5%的果膠液。酶活力單位定義（U）：在25 ℃，pH 為7.0 的反應條件下，每分鐘釋放1 μmol 還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量。發酵液酶活力單位定義為每毫升發酵液含酶活單位（U/mL）。選取酶活最高的菌株，用甘油管保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 菌株生長曲線及產果膠酶活性曲線測定 粗酶液的制備：取復篩選出的菌株接種于基礎培養基25 ℃、180 r/min 培養24 h。以接種量為2%（v/v）將活化24 h 的培養液接種到發酵培養基（100/250 mL）中，25 ℃、180 r/min 培養72 h。將發酵液4 ℃、8000 r/min 離心20 min 后取上清液適當稀釋即為粗酶液。

挑取上述酶活最高菌株的單菌落于基礎培養基（100/250 mL）中在25 ℃、180 r/min 培養條件下培養，以未接種單菌落的基礎培養基為空白對照，當培養液的OD600 值達到0.5 時，以接種量為1%（v/v）接種于發酵培養基中培養。使用自動微生物鑒定分析儀（每孔250 μL，25 ℃）進行振蕩培養，每隔8 h 檢測一次OD600，連續檢測4 d，得到連續時間節點處的OD600 值并繪制生長曲線[26]。

在每次檢測OD600 的同時，吸取1.7 mL 質量分數為0.5%的果膠底物溶液于具塞比色管中，加入0.3 mL 稀釋酶液，25 ℃水浴準確反應30 min 后取出，加入3 mL DNS 試劑，充分混勻后立即用沸水浴30 min 滅活，然后定容至25 mL；以高溫煮沸滅活10 min 后的酶稀釋液作為空白對照[27-28]，各取200 μL于96 孔板中，用酶標儀在540 nm 處測OD值，實驗組與空白對照組各做3 次平行實驗取平均值，兩者的差值即為還原糖的產生量，后根據OD540 差值計算酶活大小并繪制產酶活性曲線。

1.2.5 菌株的形態鑒定 將復篩所得的最高酶活的菌株進行平板劃線分離純化，25 ℃培養24 h 后觀察菌株生長狀況、菌落形態以及革蘭氏染色鏡下結果。

1.2.6 菌株的生理生化鑒定 利用Biolog 自動鑒定儀檢測該菌株對碳源的利用率。參照文獻[15]所用方法。

1.2.7 菌株的16S rDNA 序列測定及同源性分析將保存的菌株平板送往大連寶生物公司并對菌株進行16S rDNA 分析鑒定：采用PCR 擴增目的片段，記錄擴增序列結果并進行電泳檢測，采用數據庫同源對比法，利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將目的菌株LY-1 的16S rDNA 序列與Gen-Bank/DDBJ/EMBL 數據庫中菌的16S rDNA 序列進行比較鑒定，找出與目的菌株基因序列同源性較高的已知分類地位的菌種。采用Mega X 構建系統發育樹[29]。結合上述Biolog 自動微生物鑒定分析系統結果，進行分析，得到準確鑒定結果。

1.2.8 酶學特性研究

1.2.8.1 最適溫度和熱穩定性分析 在pH 為7 的條件下，將待測果膠酶液樣品分別在5～80 ℃的水浴環境下與果膠底物進行酶反應30 min，以DNS 法測定果膠酶酶活力，以最高酶活為100%計，繪制果膠酶最適反應溫度的相對酶活曲線，得到最適反應溫度。將果膠酶液樣品分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80 ℃下保溫處理2 h，后置于最適溫度的條件下進行酶解反應30 min，測定酶活力。以最大酶活值定義為100%，繪制果膠酶熱穩定性的相對酶活曲線，每個溫度檢測3 組平行。

1.2.8.2 最適pH 和pH 穩定性分析 分別配制不同pH3.0～12.0 的緩沖溶液，pH3.0～5.0 的Phosphate citrate 緩沖液、pH6.0～10.0 的Tris-HCl 緩沖液、pH為11.0～12.0 的Na2HPO4-NaOH 緩沖溶液。用不同pH 的緩沖溶液稀釋粗酶液并配制相應pH 的果膠底物，用DNS 法在20 ℃條件下測不同pH 的果膠酶酶活力，將最大酶活值定義為100%，計算相對酶活力，繪制果膠酶最適反應pH 的相對酶活曲線，得到酶的最適pH。將待測果膠酶液樣品在不同pH 緩沖液中放置2 h，再將其置于最適pH 條件下酶解反應30 min，以最大活力為100%計，繪制果膠酶pH 穩定性的相對酶活曲線。每個pH 檢測3 組平行。

1.2.8.3 兩種濃度下的不同金屬離子對酶活的影響 在溫度20 ℃、pH 為8 的情況下，在酶活測定反應體系中分別加入終濃度為1 和5 mmol/L 且含有Co2+、Na+、Mn2+、Zn2+、Ba2+、Hg2+、Cu2+、K+、Mg2+、Ca2+的金屬離子試劑，在對照組中添加相應體積的緩沖液PB，并在測量酶活性后計算其相對活性。每種金屬離子檢測3 組平行。

1.3 數據處理

所有實驗均為三組平行。使用 GraphPad Prism9.5.1軟件對篩菌結果、菌株生長量以及酶活性高低等數據進行處理與統計學分析。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株初篩結果

如表1 所示，計算出培養基中菌株的Dp/Dc 值，并挑選出Dp/Dc 值較大的6 株作為目標復篩菌株并繼續培養。其編號分別為LY-1，LY-6，LY-7，LY-9，LY-11，LY-16。其中LY-11 的Dp/Dc 值最大為5.28±0.35，LY-7 的Dp/Dc 最小為3.15±0.35。

表1 產果膠酶菌株初篩結果Table 1 Results of the initial screening of pectinaseproducing strains

2.2 產酶菌株復篩結果

根據DNS 法制作葡萄糖標準曲線，線性回歸方程為y=0.9614x+0.0276（R2=0.9880），表明線性擬合良好可用于果膠酶活力的計算。挑取上述初篩得到的Dp/Dc 值較大的菌株LY-1，LY-6，LY-7，LY-9，LY-11，LY-16 進行平板劃線得到單菌落后接種于發酵培養基，用DNS 法對其粗酶液進行酶活檢測，每株菌進行三次平行實驗。因為酶活力和測定的吸光度值呈正比例線性關系，故用吸光度值的大小來代表其粗酶液的酶活力的大小酶活檢測，結果如圖1 所示，其中編號為LY-1 的菌株酶活力（30.56 U/mL）顯著高于其他5 個菌株（P＜0.05）。

圖1 6 株菌的酶活測定Fig.1 Enzyme activity assay of 6 strains of bacteria

2.3 菌株生長曲線及產酶活性曲線

復篩選出的Dp/Dc 值最大且酶活性最高的菌株LY-1 為目的菌株，對該菌株進行生長曲線的測定并用其制取的酶液進行酶活性測定，結果如圖2，菌株LY-1 接種發酵24 h 內為遲緩期。接種后24～56 h 達到對數增長期，生長曲線上的活菌數呈線性增加，而酶活相對于生長曲線表現出了一定的滯后性，在32～64 h 內呈線性增長趨勢，此時的菌株的形態、染色、生物活性都很典型，對外界環境因素的作用敏感，因此研究菌株的性狀以此時期為最好[30]。56 h 后進入平穩期，菌群的生長總數處于較平坦的階段，酶活也在此段時間內達到最高值。接種72 h后為衰落期，酶活性也開始同步減小，故確定接種后培養64 h 為最佳培養時間。

圖2 LY-1 菌株生長曲線與產酶活性曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production activity curve of LY-1 strain

2.4 菌株的形態與鑒定

2.4.1 菌株的形態 如圖3a 所示在固體種子培養基上培養的菌株LY-1，單菌落形態為點或圓形，邊緣呈波狀，顏色為淺白或乳白色，表面扁平，無光澤，無氣味，表面干燥，不透明，菌落部分聚生，上似有一薄層“干粉”狀物質，且菌株的革蘭氏染色實驗為陽性，可初步鑒定為放線菌。圖3b 為菌株LY-1 的顯微形態，可見單菌株多呈球形或者橢球形，其分布特點大致為多菌聚集狀或單菌分散狀。

圖3 菌株LY-1 在平板上的菌落形態及在顯微鏡下的菌體形態Fig.3 Colony morphology of strain LY-1 on a plate and cell morphology under a microscope

2.4.2 LY-1 號菌株生理生化鑒定 通過Biolog 細菌自動鑒定儀對菌株的碳源利用率以及化學敏感程度進行檢測，結果如表2 所示，對比鑒定后初步判斷該菌種為鏈霉菌屬Streptomycessp.LY-1，PROB 值為0.929，Organism Type 為革蘭氏陽性鏈霉菌。

表2 菌株LY-1 碳源利用實驗Table 2 Strain LY-1 carbon source utilisation experiments

用GenⅢ微孔板測試LY-1 菌株碳源利用度以及相關酶學特征實驗結果見表1。由表2 可知，該菌株充分利用了D-葡萄糖、柳醇、i-肌醇、D-甘露醇、山梨醇、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、果膠，也可以部分利用松三糖、D-半乳糖等碳源，而蔗糖、L-鼠李糖、棉子糖、海藻糖等其他碳源的利用率比較差。淀粉水解強，不產生硫化氫，不分解纖維素。明膠液化，牛奶凝固并胨化。

2.4.3 LY-1 菌株16S rDNA 序列分析與系統發育樹的構建 菌株LY-1 的16S rDNA 測序長度為1396 bp。如圖4 所示，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜結果中可以看到擴增后的目的基因條帶介于1000 bp 和2000 bp 之間，與16S rDNA 測序結果相符。

圖4 菌株LY-1 的16S rDNA 電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic profile of 16S rDNA of strain LY-1

通過菌落形態以及鏡下特征可以初步鑒定出所得的菌株LY-1 為放線菌，并結合其生理生化鑒定結果和培養特性的綜合比較，最終確定菌株LY-1 為鏈霉菌屬。將獲得的序列結果通過與Gen-Bank/DDBJ/EMBL 數據庫中的已知基因序列進行同源對比分析，發現菌株LY-1 與放線菌橄欖灰鏈霉菌（Streptomyces olivogriseus）標準菌株AB184486.1 的相似度達到99.79%，表明兩者的親緣關系最近，結合上述菌株的形態及生理生化特征可以鑒定LY-1 為放線菌橄欖灰鏈霉菌，基于菌株16S rDNA 基因構建的菌株LY-1 的系統發育樹如圖5 所示。

圖5 基于菌株16S rDNA 基因構建的菌株LY-1 的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain LY-1 constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.5 酶學特性

2.5.1 最適溫度以及溫度穩定性 如圖6 中a 所示，菌株LY-1 從低溫至20 ℃區間酶活性呈上升趨勢，在15～25 ℃區間內具有較高的酶活性，相對酶活高達90%以上，在20 ℃時菌株酶活達到最高值，故酶的最適反應溫度在20 ℃左右，從20 ℃開始，隨著溫度的升高，酶活性開始緩慢下降，45 ℃以后，活性開始下降至80%以下。根據Marx 等[31]的定義，通常把最適催化溫度在30 ℃左右而在0 ℃仍然具有催化效率的酶稱為低溫酶。真菌來源果膠酶最適作用溫度一般在30 ℃左右，如Sudeep 等[32]發現的Aspergillusspp.Gm 最適作用溫度為30 ℃，細菌果膠酶最適溫度相對于真菌果膠酶而言較高，能夠達到50～60 ℃。而上述結果表明該菌株所產果膠酶的最適作用溫度為20 ℃具有良好的低溫耐受性并且對常溫也有一定的抵抗能力；對酶的熱穩定性研究如圖6 中b 所示：當溫度升至60 ℃時保存2 h 其酶活性仍在70%以上，說明此酶對溫度的適應性較強[32]，更適合工業生產。

圖6 發酵溫度對果膠酶活力的影響（a）及果膠酶的熱穩定性（b）Fig.6 Effect of fermentation temperature on pectinase activity(a) and thermostability of pectinase (b)

2.5.2 最適pH 及pH 穩定性 對酶的最適pH，pH 穩定性分析，結果如圖7 中a 所示，酸堿度會極大影響酶的的活性和穩定性，隨著pH 的逐步升高，酶活力逐步上升，當pH 為8.0 時，酶活達到最大，故此果膠酶的最適pH 在8.0 左右，即弱堿性環境下酶活達到最大，pH 過高或者偏低的情況下，酶活較低，當pH 小于7.0（大于9.0）時，酶活性下降的較快。如圖7 中b 所示，果膠酶表現很高的pH 穩定性，在pH為7.0～9.0 范圍內保溫處理2 h，酶的殘余活力均在90%以上，在堿性環境（pH 為8.0～10.0）中隨著pH逐步升高酶的穩定性在緩慢下降，但在pH 為10 的環境下仍能穩定在80%以上。說明該果膠酶在較寬的堿性范圍內是非常穩定的。

圖7 初始pH 對果膠酶活力的影響（a）及果膠酶的pH 穩定性（b）Fig.7 Effect of different initial pH on pectinase activity (a) and pH stability of pectinase (b)

2.5.3 金屬離子對酶活的影響 不同金屬離子對果膠酶酶活影響不同。如圖8 所示，在果膠酶酶解反應過程中加入不同金屬離子，1 和5 mmol/L 的Cu2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、k+、Co2+處理組相對酶活（%）均顯著大于對照組（P＜0.001），對果膠酶起促進作用，Ba2+、Mg2+、K+和Ca2+在海洋中含量豐富，研究也表明其對海洋低溫酶活性有顯著促進作用。其中Cu2+、Ba2+最為顯著（P＜0.001）且高濃度下的促進作用較為明顯，在濃度為5 mmol/L 的條件下相對酶活達到了150%以上，可能是由于Ba2+、Cu2+與酶結合后改變了酶的空間結構，穩定了酶蛋白活性的構象，進而提高酶活力[33]。而Mn2+、Zn2+、Hg2+、Na+處理組相對酶活力（%）小于對照組（P＜0.001），對果膠酶的酶活起抑制作用且高濃度下的抑制作用也較為明顯。由于Hg2+具有氧化巰基抑制酶活的特性，說明該果膠酶活性中心附近可能有半胱氨酸殘基[34]。而Mn2+、Zn2+抑制酶活性可能是由于這兩種離子破壞了該酶的三維構象，使其更易發生失活所導致的，所以Mn2+、Zn2+、Hg2+對該果膠酶有顯著的抑制作用。

圖8 不同濃度及種類的金屬離子對LY-1 菌株酶活的影響Fig.8 Effects of different concentrations and types of metal ions on the enzyme activity of LY-1 strain

3 結論

以果膠為唯一碳源，利用透明圈法和DNS 法從渤海灣底泥中篩出一株高產低溫果膠酶的菌株LY-1，經過形態學、生理生化分析以及16S rDNA 測序分析，并在NCBI 等數據庫中進行比對Mega構建系統發育樹，最終確認為是橄欖灰鏈霉菌（Streptomyces olivogriseus）。經過酶學特性研究，發現此菌產果膠酶的最適溫度為20 ℃，在4 ℃下仍能保持70%以上的酶活力，與大部分真菌、細菌等來源的果膠酶相比具有明顯的低溫酶特性及冷適應性，在60 ℃保存2 h 酶活仍在70%以上，表明該低溫酶也具有一定的熱穩定性；最適酶反應pH 為8.0，在pH 為7.0～9.0 處理2 h，其酶活力均可維持80%以上，表明該果膠酶的堿耐受性較好；金屬離子Cu2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、K+、Co2+對果膠酶活性有促進作用，以Ba2+、Cu2+最為顯著（0.0001＜P＜0.001），而金屬離子Mn2+、Zn2+、Hg2+對果膠酶活性則有明顯的抑制作用。后續研究中可對其進行基因克隆、酶蛋白修飾等從而進一步提高酶活性，為開發更高效、環境友好的生產工藝及低溫堿性果膠酶在食品工業中的應用提供參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).