共表達分子伴侶蛋白提高III 型普魯蘭水解酶在短小芽孢桿菌中的分泌表達及發酵優化

曾 靜，郭建軍，王 通，袁 林

（江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096）

III 型普魯蘭水解酶（EC 3.2.1.1/41）能夠同時水解淀粉中α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，是具有α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的雙功能酶[1-4]。III 型普魯蘭水解酶在淀粉加工工業、烘焙食品工業等工業領域具有重要應用價值。其中，嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶在淀粉酶法制糖工業具有巨大的應用潛力[5-6]。嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶可在淀粉酶法制糖工業的液化條件下將淀粉完全酶解為淀粉糖，使淀粉酶法制糖工藝的液化過程和糖化過程合二為一，大大簡化淀粉酶法制糖工藝，降低生產成本，提高生產效率。來源于極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensis的嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶（TKPUL）是目前已報道的水解活性最高的III 型普魯蘭水解酶[7-10]。TK-PUL 屬于糖苷水解酶類的第13 家族（GH13_20），具有優良的熱穩定性和高溫活性，并且其熱穩定性和高溫活性均不依賴于Ca2+，可以完全水解淀粉為淀粉糖。已有研究表明，將TK-PUL以1 mg/g 淀粉干物質的使用濃度加入30%玉米淀粉乳中，100 ℃反應10 min，然后于90 ℃反應96 h后，玉米淀粉乳完全轉化為淀粉糖，產物中DP1～DP7 所占比例為80.5%，DP7+所占比例為8.3%，DPn所占比例為11.2%[9]。

TK-PUL 已在大腸桿菌表達系統和枯草芽孢桿菌表達系統中進行表達。重組TK-PUL 于大腸桿菌表達系統中表達時，其主要位于重組大腸桿菌的胞內可溶成分中，從重組大腸桿菌獲取TK-PUL 的純化過程復雜[8]。此外大腸桿菌的外膜成分含有脂多糖，具有一定的致病性。重組TK-PUL 于枯草芽孢桿菌表達系統中分泌表達，重組枯草芽孢桿菌的胞外酶活僅為29.10 U/mL[11]。目前為止，TK-PUL 的異源表達策略難以滿足工業應用要求。為滿足TK-PUL 的工業應用要求，需選用其他合適的表達系統來實現TK-PUL 的異源高效分泌表達。

短小芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）具有卓越的蛋白質合成與分泌能力，其胞外蛋白質濃度可達30 g/L，并且其胞外蛋白酶活性低[12-14]。因此短小芽孢桿菌作為優良的異源表達系統被用于各種目的蛋白質的異源分泌表達，比如來源于Bacillus megaterium的α-淀粉酶、來源于Pyrococcus horikoshii的纖維素酶、來源于Bacillus deramifcans的普魯蘭酶等[14]。此外，已有較多研究闡述了一系列提高目的蛋白在短小芽孢桿菌中重組表達水平的策略，比如優化基因表達啟動子、優化分泌表達信號肽、優化目的蛋白質序列、提高表達載體的穩定性和拷貝數、共表達分子伴侶蛋白質以及發酵優化等[14]。本研究擬將嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶（TK-PUL）于短小芽孢桿菌表達系統進行異源分泌表達，并探索通過共表達分子伴侶蛋白質以及發酵優化實現TK-PUL 在短小芽孢桿菌中的高效分泌表達，從而為TK-PUL 的應用提供了理論基礎，并為其他目的蛋白在短小芽孢桿菌中實現高效分泌表達提供了參考策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3、大腸桿菌Escherichia coliJM109、重組載體pBE-S-Atkp、質粒pNCMO2、質粒pNY326 由本實驗室保存；LB 培養基（1 L）：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g 環凱生物科技有限公司；TM 培養基（1 L，pH7.0）：10 g 多聚蛋白胨、5 g 牛肉粉、2 g 酵母提取物、10 g 葡萄糖、0.01 g FeSO4·7H2O、0.01 g MnSO4·4H2O、0.001 g ZnSO4·7H2O 上海生工生物工程股份有限公司；KOD-Plus-neo DNA 聚合酶 日本Toyobo 公司；DNA 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker 美國Fermentase 公司；DNA 膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A.美國Omega Bio-tek 公司；In-Fusion? HD Cloning kit 日本Takara 公司；Ni-NTA 親和層析柱 德國QIAGEN公司；Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；實驗所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Mastercycler gradient 型PCR 儀 美國Eppendorf 公司；TY04S-3C 型凝膠成像系統 北京君意東方電泳設備有限公司；SP-752PC 型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；iMark 酶標儀 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒pNCMO2-tkpulh的構建 基于TKPUL 的編碼基因tkpul的堿基序列，設計引物F1 和R1（表1），以重組質粒pBE-S-Atkp為模板，擴增基因tkpul。PCR 擴增條件為：98 ℃ 變性5 min；98 ℃變性 20 s，60 ℃ 退火20 s，74 ℃ 延伸2 min，30 個循環；74 ℃ 延伸10 min。擴增產物經BamH I 和XbaI 雙酶切，連接至經同樣雙酶切處理的載體pNCMO2，構建重組質粒pNCMO2-tkpulh。

表1 構建重組質粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

1.2.2 共胞外分子伴侶蛋白PrsA 的表達載體的構建從NCBI 網站搜索來源于芽孢桿菌屬的胞外分子伴侶蛋白的蛋白質序列和對應的基因序列：來源于短小芽孢桿菌B.choshinensis的PrsABc（蛋白ID：WP_203357373.1）、來源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilus的PrsAGs（蛋白ID：ALA709 49.1）、來源于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens的PrsABa（蛋白ID：ASF28240.1）、來源于地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的PrsABl（蛋白ID：AOP14207.1）、來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的PrsABs（蛋白ID：AIY96590.1）。以共表達分子伴侶蛋白PrsABc的表達載體為例，采用化學合成方法合成由來源于質粒pNY326 的P5 啟動子和PrsABc編碼基因組成的“P5+PrsABc”堿基序列，根據“P5+PrsABc”堿基序列和In-Fusion? HD Cloning kit 的說明書，設計引物F2 和BcR（表1），以合成的“P5+PrsABc”堿基序列為模板，進行PCR 擴增，獲得“P5+PrsABc”堿基序列的線性化片段。同時根據In-Fusion? HD Cloning kit 的說明書和重組質粒pNCMO2-tkpulh的堿基序列，設計引物F3 和R3（表1），以重組質粒pNCMO2-tkpulh為模板，進行PCR 擴增，實現重組載體pNCMO2-tkpulh的線性化。采用In-Fusion? HD Cloning kit 連接線性化“P5+PrsABc”堿基序列和線性化重組載體pNCMO2-tkpulh，并將連接產物轉化大腸桿菌E.coliJM109 感受態細胞，將轉化產物全部涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體平板上，于37 ℃過夜培養。提取轉化子中重組質粒pNCMO2-tkpulh/prsabc，將重組質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并與相應基因序列進行比對確認。載體pNCMO2、重組質粒pNCMO2-tkpulh以及重組質粒pNCMO2-tkpulh/prsa的質粒圖譜如圖1 所示。其他共表達分子伴侶蛋白PrsA 的重組質粒的構建參照如上構建方法。

圖1 重組質粒圖譜Fig.1 Map of recombinant plamids

1.2.3 重組短小芽孢桿菌的構建與發酵培養 采用電轉化法將重組質粒轉化入B.choshinensisHPD1-SP3[15]，獲得重組短小芽孢桿菌。挑取轉化子單克隆接種于含50 μg/mL 新霉素的10 mL TM 培養基中，于37 ℃培養12 h，獲得種子液。取0.5 mL 種子液，轉接入50 mL TM 培養基中進行搖瓶培養，于37 ℃、200 r/min，搖瓶發酵培養60 h，獲得重組短小芽孢桿菌發酵培養液。

1.2.4 生物量的測定 取1 mL 重組短小芽孢桿菌發酵培養液，于12000×g 離心5 min，收集菌體沉淀，并水洗三次后，于105 ℃烘干至重量不變，再將樣品進行稱重，即為細胞干重（dry cell weight，DCW）。

1.2.5 重組TK-PUL 的純化與酶活力測定 待發酵培養結束后，將重組短小芽孢桿菌發酵培養液于12000×g 離心5 min，收集發酵液上清，即為發酵液上清樣品。采用適量50 mmol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid，MES），pH6.5緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細胞。超聲波細胞破碎儀的參數設置為超聲波功率為25%、超聲波破碎時間3 s、間歇6 s。超聲波處理菌體細胞至菌體懸液變為均一的溶液，即為菌體沉淀處理樣品。

采用Ni-NTA 親和層析柱純化發酵液上清樣品中重組TK-PUL。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[16]檢測重組TK-PUL 的純度，根據蛋白質樣品在SDS-PAGE 圖譜上所呈現的帶型特點來判斷重組TK-PUL 的純度。采用活性印記分析[17]檢測TK-PUL 的α-淀粉酶酶活，并采用Bradford 法測定重組TK-PUL 的濃度[16]。

以1%（m/V）g/100 mL 可溶性淀粉為底物，測定發酵培養液上清樣品、菌體沉淀處理樣品或純化后重組TK-PUL 的α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性測定參照文獻[11]進行。酶活力單位（U）定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產生1 μmol 還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）[18]。

1.2.6 重組短小芽孢桿菌的發酵培養基優化 在TM 培養基的基礎上相應地改變碳源、氮源以及培養基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）進行單因素實驗。選用不同碳源（甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉）替代TM 培養基中碳源（10 g/L 葡萄糖），不同氮源（牛肉浸粉、多聚蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、棉籽粉、大豆蛋白胨、硫酸銨、氯化銨）替代TM 培養基中氮源（10 g 多聚蛋白胨、5 g 牛肉粉、2 g酵母提取物），分別添加質量濃度為0～15 g/L MgCl2·6H2O 或脯氨酸，研究不同碳源、氮源和培養基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）對重組短小芽孢桿菌發酵生物量及產酶的影響。根據單因素實驗結果，采用響應面分析法（response surface methodology，RSM）進一步優化重組短小芽孢桿菌的發酵培養基。選取發酵培養基中影響重組短小芽孢桿菌發酵產酶水平的4 個因素葡萄糖、酵母提取物、MgCl2·6H2O、脯氨酸為考察對象，以重組短小芽孢桿菌發酵液上清的酶活（Y）為響應值，采用Design-Expert 10.0.7 軟件設計4 因素3 水平的中心組合響應面試驗，響應面試驗因素水平表如表2 所示。

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Response surface test factor level design

1.2.7 重組短小芽孢桿菌的發酵條件優化 在“1.2.3”重組短小芽孢桿菌發酵培養條件的基礎上，選擇不同的發酵培養溫度（25、28、30、33、35、37 ℃）、不同的初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）以及不同的培養時間（48、54、60、66、72、78 h），分別培養重組短小芽孢桿菌，研究不同發酵培養條件對重組短小芽孢桿菌發酵生物量及產酶的影響。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，試驗結果用平均值±標準差表示，運用軟件SigmaPlot 14.0 和SPSS 對試驗數據進行統計分析并作圖。采用軟件Design-Expert 10.0.7 進行Box-Behnken 試驗設計以及試驗數據的響應面分析。

2 結果與分析

2.1 重組TK-PUL 于短小芽孢桿菌表達系統的分泌表達

短小芽孢桿菌B.choshinensis表達系統具有較強分泌外源蛋白的能力[12-13]。將重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh于37 ℃搖瓶發酵培養，其搖瓶發酵曲線如圖2 所示。當發酵培養48 h 時，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的細胞干重達到最大值；當發酵培養60 h 時，其胞外α-淀粉酶活性達到最大值。待重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh搖瓶發酵培養60 h 后，將發酵培養液于12000×g 離心5 min，分別收集發酵培養液上清和菌體沉淀。分別測定發酵培養液上清和菌體沉淀處理樣品的α-淀粉酶活性，結果顯示重組TKPUL 主要位于發酵培養液上清中，發酵培養液上清樣品的比酶活力達75.24 U/mL，菌體沉淀處理樣品的比酶活力僅為1.38 U/mL。

圖2 重組菌株B.choshinensis HPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh 的搖瓶發酵曲線Fig.2 Fermentation curve of B.choshinensis HPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh in shake flask

分別對重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2 和重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的發酵液上清進行SDS-PAGE 檢測和α-淀粉酶活性印記分析，結果如圖3 所示。重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2 的發酵液上清未檢測到α-淀粉酶活性，而重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh的發酵液上清檢測到明顯的α-淀粉酶活性。采用Ni2+親和層析純化重組菌株B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh發酵液上清中目的蛋白。SDS-PAGE檢測和和α-淀粉酶活性印記分析結果顯示重組TKPUL 的分子量約為84 kDa（圖3），其大小與TK-PUL的理論分子量相符[7-8]。

圖3 重組蛋白質的SDS-PAGE 檢測圖以及活性印記分析Fig.3 SDS-PAGE and activity staining analysis of recombinant proteins

2.2 共表達胞外分子伴侶蛋白PrsA 對TK-PUL 分泌表達的影響

來源于芽孢桿菌屬的胞外分子伴侶蛋白PrsA是常見的蛋白質折疊輔助因子[19-20]，其通過脂蛋白信號肽錨定在細胞膜的外側，可輔助跨膜轉運后的目的蛋白在細胞膜和細胞壁的間隙中正確折疊成具有生物活性的空間結構[21-23]。本研究選擇來源于B.choshinensis的PrsABc、來源于G.stearothermophilus的PrsAGs、來源于B.amyloliquefaciens的PrsABa、來源于B.licheniformis的PrsABl以及來源于B.subtilis的PrsABs作為胞外分子伴侶蛋白的考察對象，考察了共表達不同芽孢桿菌來源的胞外分子伴侶蛋白PrsA 對TK-PUL 于短小芽孢桿菌表達系統中分泌表達的影響，結果如圖4 所示。經搖瓶發酵驗證，共表達胞外分子伴侶蛋白PrsABa最有利于TK-PUL的分泌表達。其對應的重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa搖瓶發酵的胞外α-淀粉酶比酶活力為98.79 U/mL，提高了0.31 倍。

圖4 共表達胞外分子伴侶蛋白對TK-PUL 分泌表達的影響Fig.4 Effects of extracytoplasmic molecular chaperone co-express ing on the secretory expression of recombinant TK-PUL

已有研究表明，在枯草芽孢桿菌表達系統中共表達分子伴侶蛋白PrsA 可有效提高PrsA 依賴型目的蛋白的分泌表達水平[23-24]。例如，Chen 等[24]通過在枯草芽孢桿菌表達系統中共表達PrsABs，將α-淀粉酶AmyL 的分泌表達水平提高了2.2 倍。另外，不同來源的分子伴侶蛋白PrsA 具有一定的底物特異性。共表達分子伴侶蛋白PrsA 可能提高、降低或不影響目的蛋白質的分泌表達量。Yao 等[21]研究結果表明，共表達PrsABs和PrsABa有利于提高α-淀粉酶AmyS 在短小芽孢桿菌中的胞外表達水平，而共表達PrsABc和PrsABl導致α-淀粉酶AmyS 的胞外表達水平下降。本研究結果表明，在短小芽孢桿菌表達系統中共表達分子伴侶蛋白PrsABa、PrsABl、PrsABs均不同程度地促進了TK-PUL 的分泌表達，共表達PrsABc不影響TK-PUL 的分泌表達，而共表達PrsAGs導致TK-PUL 的分泌表達水平下降。本研究中共表達PrsABa最有利于TK-PUL 的異源分泌表達。Yao 等[21]研究結果以及Quesada-Ganuza 等[23]研究結果均表明，共表達PrsABa可以不同程度提高各種來源的α-淀粉酶的異源分泌表達水平。結合本研究結果，可以推測來源于B.amyloliquefaciens的胞外分子伴侶蛋白PrsABa具有較弱的底物特異性，在芽孢桿菌表達系統中共表達PrsABa有利于促進多種目的蛋白質的異源分泌表達。

2.3 重組短小芽孢桿菌的發酵培養基優化

2.3.1 單因素實驗法優化重組短小芽孢桿菌的發酵培養基 發酵培養基的成分會影響重組菌株的生長及其產酶水平。本研究中重組短小芽孢桿菌所采用的TM 培養基包括碳源（10 g/L 葡萄糖）、氮源（10 g/L多聚蛋白胨、5 g/L 牛肉粉、2 g/L 酵母粉）以及金屬離子等。碳源和氮源對重組短小芽孢桿菌的生長和蛋白質合成具有非常重要的影響，合適的碳源和氮源有利于促進菌體生長和蛋白質合成分泌[25-26]。另外，發酵培養基中金屬離子和其他重要組成部分如脯氨酸也會影響重組短小芽孢桿菌的生長和蛋白質合成[25-26]。

本研究在TM 培養基的基礎上相應地改變碳源、氮源以及培養基添加物（MgCl2·6H2O 或脯氨酸）進行單因素實驗，優化重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa的搖瓶發酵培養基，結果如圖5 所示。由圖5A 和圖5B 可知，采用葡萄糖作為碳源時，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量以及產酶水平最高。并且當葡萄糖的濃度為20 g/L 時，發酵生物量達到4.88 g/L，發酵液上清的酶活達到105.64 U/mL。圖5C 和圖5D 顯示選用酵母提取物作為氮源時，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量以及產酶水平最高。當酵母提取物的濃度為22 g/L 時，發酵生物量達到5.67 g/L，發酵液上清的酶活達到127.84 U/mL。圖5E 顯示向培養基中添加12 g/L MgCl2·6H2O 時，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量以及產酶水平最高，發酵生物量達到5.02 g/L，發酵液上清的酶活達到117.19 U/mL。在短小芽孢桿菌表達系統中，Mg2+可通過抑制P2 啟動子的活性，降低目的蛋白質前體的合成，從而提供足夠的時間使目的蛋白質前體折疊成為具有正確分子結構的活性蛋白質。例如，Zou 等[27]將來源于B.deramificans的普魯蘭酶于短小芽孢桿菌表達系統中進行分泌表達。當表達B.deramificans普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌的發酵培養基中額外添加12 g/L MgCl2·6H2O 時，發酵液中B.deramificans普魯蘭酶的表達量降低了30.4%，而發酵液上清的普魯蘭酶活性提高了5.4 倍。即重組短小芽孢桿菌表達的B.deramificans普魯蘭酶中，更高比例的B.deramificans普魯蘭酶前體折疊成為具有正確分子結構的活性普魯蘭酶。圖5F 顯示向培養基中添加9 g/L 脯氨酸時，重組短小芽孢桿菌的產酶水平最高，此時發酵生物量達到5.99 g/L，發酵液上清的酶活達到168.79 U/mL。脯氨酸作為發酵培養基的重要組成部分，有利于維持短小芽孢桿菌細胞的完整性和活力，提高異源蛋白質的分泌表達水平[17,28]。Li 等[17]研究發現，通過向短小芽孢桿菌發酵培養基中添加脯氨酸來提高異源蛋白質的分泌表達水平具有普遍適用性。

圖5 碳源、氮源和培養基添加物對重組短小芽孢桿菌發酵生物量及產酶的影響Fig.5 Effects of carbon sources,nitrogen sources and medium additions on DCW and enzyme production of recombinant B.choshinensis

2.3.2 響應面試驗法優化重組短小芽孢桿菌的發酵培養基 根據單因素實驗結果，選取發酵培養基中影響重組短小芽孢桿菌發酵產酶水平的4 個因素葡萄糖、酵母提取物、MgCl2·6H2O、脯氨酸為考察對象，以重組短小芽孢桿菌發酵液上清的酶活（Y）為響應值，采用Design-Expert 10.0.7 軟件設計4 因素3 水平的中心組合響應面試驗，響應面試驗因素水平如表2 所示，Box-Behnken 試驗設計及試驗結果見表3。采用Design-Expert 10.0.7 軟件對29 個試驗點的響應值進行回歸擬合分析，響應面試驗二次模型的方差分析結果如表4 所示。

表3 Box-Behnken 試驗設計及試驗結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experimental

表4 響應面試驗二次模型的方差分析結果Table 4 ANOVA results for the response surface quadratic model

表4 中方差分析結果顯示：模型P值＜0.0001，這表示方程模型達到極顯著；失擬P值=0.8241，不顯著，說明該模型擬合程度好，可靠性高。因此該二次多項回歸模型成立，應用此模型可以預測重組短小芽孢桿菌發酵產酶水平以及優化發酵培養基。由P值可知，一次項A、B、交互項AB、AD、CD 以及二次項A2、B2、C2、D2對發酵產酶水平的影響達到極顯著程度（P＜0.01），一次項D 以及交互項AC、BD 對發酵產酶水平的影響達到顯著程度（P＜0.05）。此外，該二次多項回歸模型的復相關系數為0.9991，說明該方程模型與實際試驗結果擬合良好，試驗誤差小。根據表4，去掉對反應的影響不顯著的試驗因素，獲得描述顯著試驗因素與發酵液上清酶活（Y）之間關系的二次多項式方程（Y=181.11-1.80A-9.00B+0.72D+1.69AB+1.59AC+3.97AD+1.33BD+3.19CD-27.23A2-41.77B2-30.39C2-28.56D2）。以上二次多項回歸模型中二次項系數均為負值，說明該方程模型有極大值。

基于響應面試驗設計結果，最佳發酵培養基為：19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl2·6H2O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·4H2O、0.001 g/L ZnSO4·7H2O。在此條件下，重組短小芽孢桿菌發酵液上清的酶活為181.64 U/mL。采用最佳發酵培養基進行3 組驗證試驗，測得重組短小芽孢桿菌發酵液上清的酶活分別為180.16、182.47、180.39 U/mL，平均值為181.01±1.27 U/mL，與該條件下的理論值的相對誤差值小于1%，說明采用響應面法優化得到的制備工藝參數準確可靠。重組短小芽孢桿菌于最佳發酵培養基搖瓶發酵培養后的發酵上清液酶活相對于TM 培養基提高了1.41 倍。

2.4 重組短小芽孢桿菌的發酵條件優化

發酵培養溫度、發酵初始pH 和發酵培養時間也是影響重組短小芽孢桿菌發酵生物量和產酶水平的重要因素[29-30]。本研究也探究了發酵培養溫度、發酵初始及培養時間pH 對重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa發酵生物量和產酶水平的影響，結果如圖6 所示。由圖6A 可知，在25～35 ℃范圍內，隨著發酵培養溫度的升高，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平逐漸升高；溫度大于35 ℃后，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平下降。這表明35 ℃更適于重組短小芽孢桿菌生長和產酶，因此選取35 ℃為最適發酵培養溫度。圖6B 顯示，隨著培養基pH 的增加，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平均呈現先增加后減少的變化趨勢。發酵初始pH 為7.0 時，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平最高。這表明pH7.0 更適于重組短小芽孢桿菌生長和產酶，因此選取7.0 為最適發酵初始pH。圖6C顯示，當發酵培養時間由48 h 延長至66 h 時，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平持續增加；待發酵培養時間超過66 h 后，重組短小芽孢桿菌的發酵生物量和產酶水平略有降低。即隨著發酵培養時間的延長，受到碳源、氮源等能源物質的限制，重組短小芽孢桿菌的生長和產酶受限，其生物量和產酶水平不會一直持續增加。此外，在重組短小芽孢桿菌的發酵后期，細胞自身的裂解可能導致其生物量降低，并且其所產的胞外外源酶可能受其自身胞外蛋白酶的降解而導致其產量下降[21]。本研究顯示，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/ pNCMO2-tkpulh/prsaBa采用最佳發酵培養基于35 ℃、pH7.0下進行搖瓶發酵培養66 h 后，其細胞干重為5.69 g/L，發酵上清液酶活達到192.68 U/mL。

圖6 培養溫度、初始pH 和時間對重組短小芽孢桿菌發酵生物量及產酶的影響Fig.6 Effects of cultivation temperature,pH and time on DCW and enzyme production of recombinant B.choshinensis

3 結論

本研究通過共表達分子伴侶蛋白提高了嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶TK-PUL 在短小芽孢桿菌表達系統中的分泌表達水平，并進一步優化了重組短小芽孢桿菌的發酵培養基和培養條件。研究結果表明，通過共表達來源于B.amyloliquefaciens的胞外分子伴侶蛋白PrsABa，重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa的胞外酶活達到98.79 U/mL，提高了0.31 倍。重組短小芽孢桿菌的最佳發酵培養基為：19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl2·6H2O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·4H2O、0.001 g/L ZnSO4·7H2O。重組短小芽孢桿菌的最佳發酵溫度為35 ℃，最佳起始發酵pH 為7.0，最佳培養時間為66 h。重組短小芽孢桿菌B.choshinensisHPD1-SP3/pNCMO2-tkpulh/prsaBa采用最佳發酵培養基于35 ℃、pH7.0 下進行搖瓶發酵培養66 h 后，其細胞干重為5.69 g/L，發酵上清液酶活達到192.68 U/mL，提高了1.56 倍。本研究通過共表達分子伴侶蛋白和發酵優化實現了TK-PUL 在短小芽孢桿菌的高效分泌表達，為TK-PUL 的應用提供了理論基礎，并為其他目的蛋白在短小芽孢桿菌中實現高效分泌表達提供了參考策略。

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