基于HS-SPME-GC-MS 對不同等級雙井綠茶香氣物質的研究

趙志強，陳羅君，饒 雨，徐 璐，饒 軍，雷志勇，張 麗,3，高銀祥,3,*

（1.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江 332005；2.修水縣茶葉科學研究所，江西九江 332400；3.九江學院江西油茶研究中心，江西九江 332005）

茶是三大無酒精飲料之一，因其獨特的風味及保健功效受到全世界人民的喜愛[1-2]。根據加工工藝不同，茶可分為：綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶。綠茶作為一款非發酵茶，在我國茶葉生產銷售獨占鰲頭[3-4]。雙井綠茶屬于綠茶，產自江西省修水縣，因其外形卷曲細緊、翠綠多毫，形如鳳爪，湯色明亮，內質散發清香高雅，滋味醇厚甘美而聞名于世。雙井綠茶的加工工藝包括攤青、殺青、揉捻、初烘、做型、定型烘干、提香干燥等步驟，使其獲得獨特的風味品質[5]。

茶葉香氣是評價茶葉品質的關鍵因子，茶葉中香氣物質種類及其含量使茶葉呈現獨特香型[6]。茶樹品種、茶樹生長環境、茶葉加工工藝等影響茶葉香氣物質，其中采用的鮮葉原料是影響茶葉香氣的關鍵因素[7-9]。Peng 等[10]對不同等級的九曲紅梅香氣物質進行研究，結果表明有5 種揮發性化合物的相對含量與九曲紅梅茶等級呈正相關。丁玎等[11]對4 個等級的白茶中的香氣進行分析，共鑒定出51 種香氣組分，其中醇類物質和醛類物質占比高達70.54%的比例。綜上所述，不同等級茶之間的香氣物質存在明顯差異。

頂空固相微萃取（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是通過固相萃取頭涂層對茶葉香氣物質進行吸附，在氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）GC/MS進樣口用高溫將萃取頭香氣物質解吸附、進行進樣檢測；GC-MS 可以對茶葉中香氣物質進行快速分離，通過質譜信息、對比質譜數據庫進行鑒定，具有定性定量分析功能。GC-MS 和HS-SPME 聯用可快速地分析茶葉中的揮發性化合物，真實地反映茶葉香味物質特征[12-13]。

關于雙井綠茶香氣物質的組成特征的研究，目前尚未見相關報道，特別是不同等級雙井綠茶中的香氣物質有何差異還不清楚。本研究以江西省修水縣同一茶葉產地、同一加工工藝條件，不同芽葉制作的不同等級的雙井綠茶為研究對象，利用GC-MS 和HS-SPME 聯用技術，對不同等級雙井綠茶的香氣物質組成及含量進行分析，利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、熱圖分析等手段，研究不同等級雙井綠茶中香氣物質的組成及含量變化，分析關鍵香氣物質的分布變化規律，為雙井綠茶的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙井綠茶葉樣品 來自修水縣大椿茶廠，茶鮮葉來源于大椿茶廠自有茶園，經攤青、殺青、抖簸等9 道加工工序制成，每個雙井綠茶樣品分別取3 份，置于干凈無味的-20 ℃冰箱中；純凈水 華潤怡寶飲料（中國）有限公司；C7～C40 飽和烷烴混標 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司（Sigma-Aldrich）。

固相微萃取頭SPME 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美國Supelco 公司；20 mL 頂空螺紋瓶加磁吸式頂空瓶蓋 安捷倫科技（中國）有限公司；TG-5MS 氣相色譜柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm、TSQ 8000Evo 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀、TriPlus RSH 三合一自動進樣器 美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙井綠茶樣品分級 根據雙井綠茶芽葉形態及其相對含量，芽葉形態如圖1 所示，分為雙井銀毫（Yinhao Grade，YHG）、雙井綠茶特級（Shuangjing Green Tea Super Grade，SUG）、雙井綠茶一級（Shuangjing Green Tea First Grade，FG）和雙井綠茶二級（Shuangjing Green Tea Second Grade，SG）四個級別。雙井銀毫（YHG）：單芽和一芽一葉初展為原料，其中單芽相對含量＞85%；雙井綠茶特級（SUG）：一芽一葉初展和一芽一葉開展為原料，其中一芽一葉初展相對含量＞75%；雙井綠茶一級（FG）：一芽一葉開展和一兩葉為原料，其中一芽一葉開展相對含量＞75%；雙井綠茶二級（SG）：一芽二葉開展和一芽三葉為原料，其中一芽二葉開展小＜3 cm，相對含量＞80%。

圖1 茶樹芽葉形態Fig.1 Bud and leaf morphology of Camellia sinensis

1.2.2 樣品處理 所有樣品磨碎，過40 目篩，精確稱取1.50 g 茶粉末樣品，置入20 mL 樣品瓶，加4.50 mL 水（加入1.50 g 氯化鈉）。

1.2.3 固相微萃取條件 固相微萃取條件參考本實驗室之前的實驗方法[14]。60 ℃平衡30 min，平衡完成，插入已老化（或已解吸附）的纖維萃取頭，于茶樣上方頂空吸附（萃取溫度60 ℃，萃取時間60 min），后將萃取頭進樣解析（解析時間5 min，250 ℃）。

1.2.4 GC-MS 檢測條件 GC-MS 檢測條件參考本實驗室之前的實驗方法[14]。載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），恒流流速1.0 mL/min，質譜接口溫度280 ℃，不分流進樣，質譜條件：電子轟擊離子源（EI）溫度300 ℃。電子能量70 ev；質譜掃描范圍：m/z 33～550 amu。程序升溫條件：40 ℃（保持2 min），5 ℃/min，85 ℃（保持2 min），2 ℃/min，110 ℃（保持2 min），4 ℃/min，220 ℃（保持2 min），5 ℃/min，250 ℃（保持10 min）。

1.2.5 保留指數的測定及計算方法 C7～C40 混標檢測，正構烷烴混標濃度1000 μg/mL（1000 ppm），用正己烷（色譜級）稀釋至10 μg/mL（10 ppm）。手動進樣1 μL，濃度為10μg/mL C7～C40 混標進GC-MS檢測，用以計算保留指數。香氣物質的定性定量參考本實驗室之前的方法[14]。香氣組分質譜數據在NIST2014 庫以及自建庫中進行檢索，篩選出RSI 大于800 的化合物，計算化合物的保留指數RI，并與文獻中的保留指數，進行對比，通過RSI 和RI 進行香氣組分定性；香氣成分的相對含量采用峰面積歸一法計算。保留指數根據下式計算：

式中：RIX：化合物X 的保留指數（X 在正構烷烴Z 和Z+1 之間餾出）；RTX：化合物X 的保留時間；RTZ：碳數為Z 的正構烷烴的保留時間；RTZ+1：碳數為Z+1 的正構烷烴保留時間。

1.3 數據處理

本研究每個測定實驗均重復3 次，實驗數據采用IBM Statistics SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析，水平間比較用LSD 法和Duncan 法，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。采用TBtools 繪制熱圖，多元統計分析采用SIMCA-P 14.1 軟件。

2 結果與分析

2.1 不同等級雙井綠茶香氣組分GC-MS 分析

不同等級雙井綠茶經GC-MS 檢測，得到雙井綠茶總離子流色譜圖，如圖2 所示，本實驗采用的HSSPME 及GC-MS 梯度升溫方法可以有效提取分離檢測雙井綠茶香氣組分。香氣組分總離子流圖結果顯示，不同等級的雙井綠茶總離子流圖差異明顯，同一等級的雙井綠茶香氣總離子流圖結果更加相似。

圖2 不同等級雙井綠茶香氣組分總離子流色譜對比圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.2 不同等級的雙井綠茶香氣組分定性分析

利用GC-MS 并通過RSI 和RT 在4 種不同等級雙井綠樣品中共鑒定出了70 種香氣成分（表1），根據香氣組分主要官能團的不同，可分為7 大類，其中醇類17 種，醛類7 種，酮類5 種，酯類8 種，烯烴12 種，烷烴9 種，雜環類7 種，其它化合物5 種。鄧見田燁等[15]利用HS-SPME-GC-MS 分析檢測不同種類黑茶香氣物質，共檢測鑒定出56 個香氣成分。李沅達等[16]對不同加工工藝的紫鵑白茶的香氣組分進行檢測，共檢測鑒定出82 種香氣物質。不同的茶葉類型、不同的檢測儀器及不同的檢測方法會導致檢測結果差異。

表1 不同等級雙井綠茶香氣成分Table 1 Aroma components of Shuangjing green tea with different grades

2.3 不同等級雙井綠茶總香氣組分變化分析

TBtools 是一款用于高通量數據分析的工具[17]，利用TBtools 繪制熱圖，可以直觀地比較香氣組分含量的變化，如圖3 所示，色階顏色從藍到紅的變化代表了相對含量從低到高，從圖3 可以觀察到，在雙井銀毫、雙井特級（芽占比較高）中反式-β-金合歡烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、順式-香葉醇、2,6-二叔丁基對甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香葉酸、石竹烯、γ-依蘭油烯、2-甲基十三烷等香氣組分相對含量較高；隨著芽葉開展，在雙井一級、雙井二級（一芽二葉、一芽三葉占比較高）中相對含量較高的有苯乙醇、檸檬醛、順式-3-己烯醇、香葉醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-檸檬醛、苯甲醛、苯甲醇、順式-芳樟醇氧化物（呋喃類）及水楊酸甲酯等。

圖3 不同等級雙井綠茶香氣組分的熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.4 不同等級的雙井綠茶香氣組分主成分分析

由于茶葉中香氣成分復雜多樣，很難以單一的香氣成分和簡易的數據分析獲得有效變量，多元統計分析是一種綜合分析方法，通過分析雙井綠茶樣品的統計學規律，可以在多個對象和指標相互關聯時進行分析[18]。為了探索具有四種不同等級的雙井綠茶樣品鑒別的潛在化學標記，使用多元統計分析對所鑒定得出的70 種香氣成分進行差異性分析。

為了研究不同等級茶葉樣品中揮發性化合物組成的相似性和差異性，以這些檢測到的香氣物質相對含量為變量，進行了主成分分析（PCA），PCA 通過降維將多個變量轉化為幾個綜合變量，從而直觀地反映樣本的某些特征多變量、無監督的統計分析方法，被廣泛應用于茶葉揮發性成分研究[19]。如圖4 所示，根據不同等級的雙井綠茶香氣組分的相對含量構建的PCA 模型吻合程度（R2）和模型預測能力（Q2）分別為0.897 和0.751，這表明PCA 對數據具有較好的適應度，不同等級的雙井綠茶樣品區分明顯。

圖4 不同等級雙井綠茶香氣組分的PCA 分析圖Fig.4 PCA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

層次聚類分析（Hierarchical Clustering Analysis，HCA）是將對象根據其在多維空間中的接近程度分組成簇，將最大相似性的樣本為優先聚類[20]。如圖5 所示，四種不同等級雙井綠茶可以在聚類距離70 處被清晰地分成4 個聚類，其中第一組為雙井綠二級聚類，第二組為雙井銀毫，第三為雙井綠特級，第四組為雙井綠一級。隨著聚類距離增加，雙井特級和雙井一級距離更近，而雙井二級與其他3 組距離最遠，說明在四種不同等級的茶樣香氣組分，雙井特級與雙井一級的香氣物質更相似，而雙井二級香氣組分與其他3 組差異更大，說明芽葉生長直至完全展開，香氣組分變化很大，而芽中的香氣組分變化較小。

圖5 不同等級雙井綠茶HCA 聚類分析圖Fig.5 HCA clustering analysis of Shuangjing green tea with different grades

偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）是一種監督聚類的分類方法，可以彌補PCA 的不足，加強樣本之間的差異，并提供負責分離的關鍵香氣成分的指示[21]。采用PLS-DA 法比較了四種綠茶的香氣物質特征。在模型中不同等級雙井綠茶香氣組分之間存在顯著差異。參數（R2Y=0.991）具有很高的解釋能力，Q2=0.969 具有較強的預測能力。如圖6 所示，銀毫一級位于得分圖的右上方，雙井特級和雙井一級集中在右下方，雙井二級單獨位于得分圖的左下方。4 個不同等級雙井綠茶的樣品得到了很好的區分。

圖6 不同等級雙井綠茶PLS-DA 分析圖Fig.6 PLS-DA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

VIP 值可以量化PLS-DA 模型中香氣組分對樣本分類的貢獻大小，在判別過程中一般認為VIP＞1，影響樣本相似性的關鍵因素，P＜0.05 表示該組分具有統計學意義[22]。如圖7 所示：在本研究中VIP＞1共有19 種香氣物質：反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯甲醇、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、2,6,10-三甲基十三烷、芳樟醇、α-椰油烯、壬醛、（Z,E）-α-法呢烯、咖啡因、順式-3-己烯醇。其中VIP＞1，同時P＜0.05，如表2 所示，反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯、順式-3-己烯醇，這14 種香氣組分是不同等級雙井綠茶在香氣上產生差異的關鍵物質。這些變化的關鍵性香氣組分主要表現為花香、果香、木香、焦糖香及青香等[23-26]。

表2 不同等級雙井綠茶香氣組分差異關鍵物質Table 2 Key substances for different aroma components of Shuangjing green tea with different grades

圖7 不同等級雙井綠茶香氣組分PLS-DA 模型的VIP 得分圖Fig.7 VIP score diagram of PLS-DA model for aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.5 不同等級的雙井綠茶關鍵差異物質變化分析

根據PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共篩選出14 種關鍵差異物質，具體見表2，分別為反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃類）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及順式-3-己烯醇。為了呈現上述香氣化合物在不同等級雙井綠茶品質中的含量差異，以及探索它們之間的關系，將14 種關鍵差異物質香氣含量制成熱圖，如圖8 所示，結果表明以單芽為主的銀毫一級與雙井綠茶特級中呈現果香、木香為主的反式-β-金合歡烯、α-椰油烯、石竹烯、己酸乙酯相對含量較高；隨著芽葉開展，在雙井綠茶一級與雙井綠茶二級中呈現花香、青香為主的水楊酸甲酯、香葉醇、順式-3-己烯醇相對含量迅速增加；而芳樟醇、茉莉酮、反式-橙花叔醇含量從低到高，隨后含量又迅速下降。

圖8 不同等級的雙井綠茶關鍵差異物質熱圖Fig.8 Heatmap analysis of key aroma compounds of Shuangjing Green Tea with different grades

綠茶的特征香氣在很大程度上取決于關鍵香氣物質，并且茶葉中芳樟醇和香葉醇的含量對茶葉的香氣品質有一定影響[27-28]。茉莉酮具有典型的果香、花香和木香，水楊酸甲酯的杏仁香及焦香，橙花醇具有草木香、氧化芳樟醇（吡喃類）具有花香、苯乙醇具有花香，順式-3-己烯醇具有青草香[29-31]，這些香氣組分呈現了花香、果香、木香和青香等香型，這些香氣組分的種類和含量導致了雙井綠茶的整體的呈現的獨特的茶香。

3 結論

本研究基于HS-SPME-GC/MS 聯用技術對四種不同等級的雙井綠茶的香氣組分進行檢測分析，共鑒定出70 種香氣物質。結果表明，四組不同等級雙井綠茶樣品的香氣組分差異明顯。其中反式-β-金合歡烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、順式-香葉醇、2,6-二叔丁基對甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香葉酸、石竹烯、γ-依蘭油烯、2-甲基十三烷等在芽中的相對含量較高。苯乙醇、檸檬醛、順式-3-己烯醇、香葉醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-檸檬醛、苯甲醛、苯甲醇、順式-芳樟醇氧化物（呋喃類）及水楊酸甲酯等隨著芽葉開展，在一芽二葉、一芽三葉中相對含量較高。

其中反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃類）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及順式-3-己烯醇是不同等級雙井綠茶的關鍵差異性物質，這14 種香氣組分是不同等級雙井綠茶在香氣上產生差異的關鍵物質。

綜上，本研究揭示了不同等級雙井綠茶中香氣物質的組成，加深了關鍵香氣物質在芽葉中的分布規律的認識，為雙井綠茶的生產提供理論參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).