基于網絡藥理學分析補腎與健脾藥配伍治療骨質疏松癥的作用靶點及作用機制 *

尹致遠 王世琦 蔡余力※

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院碩士研究生2020級，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院關節骨科，山東 濟南 250014）

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是因骨密度和骨質量降低，骨脆性增加，從而使脆性骨折發生風險增加的一種全身性骨病，多見于絕經后婦女及70 歲以上老年人，與年齡增長密切相關［1，2］。中醫學認為脾腎兩虛是OP的關鍵病機。通過查找相關文獻，選取使用頻率較高的補腎藥（巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎補、淫羊藿）與健脾藥（白芍、白術、黨參、黃芪、山藥）［3-6］。

網絡藥理學具有整體性和辨證論治的特點，為解決中藥成分復雜、主治多樣的難點提供了一種新的科學思路［7］，本研究基于網絡藥理學，探究補腎健脾中藥防治OP的可能機制，為補腎健脾法應用于OP提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料補腎藥（巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎補、淫羊藿）與健脾藥（白芍、白術、黨參、黃芪、山藥）的主要活性成分及作用靶點和機制。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取藥物有效成分利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），檢索巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎補、淫羊藿、白芍、白術、黨參、黃芪、山藥十味中藥并篩選活性成分，篩選標準設定為生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18［8］，將其整合去重后得到補腎藥活性成分與健脾藥有效成分。同時使用TCMSP搜集活性成分的相關作用靶點的蛋白名稱，并通過Uniprot數據庫將所得靶點的蛋白名稱轉化為官方名稱。

1.2.2 獲取補腎藥與健脾藥治療OP的潛在靶點將“osteoporosis”作為關鍵詞，分別通過DrugBank 數據庫、OMIM 數據庫、DisGeNET 數據庫、TTD 數據庫以及GeneCards數據庫進行檢索與篩選，得到OP疾病靶點。

1.2.3 構建藥物活性成分-靶點網絡使用Cytoscape 3.8.0繪制藥物活性成分-靶點網絡圖，采用軟件內“Network analyzer”選項對該網絡圖進行計算和分析，得到各活性成分的節點度值。

1.2.4 蛋白質互作網絡（PPI）構建將1.2.2 中所得補腎藥與健脾藥治療OP的潛在靶點導入數據庫，在Organism中選擇人類物種，并根據度值對結果進行篩選，獲得PPI網絡圖。

1.2.5 生物過程和通路富集分析使用R 軟件安裝Bioc-Manager，對1.2.2 中的潛在基因靶點進行基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，以pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05 為顯著性差異界定值。

2 結果

2.1 補腎藥與健脾藥活性成分將所得數據整合去重后得到補腎藥特有活性成分60個、健脾藥特有活性成分40個、補腎藥與健脾藥共有活性成分6 個；預測靶點共得到9709 個，將預測靶點的蛋白名稱轉化為官方名稱后，綜合篩選并保留惟一值，得到單純補腎活性成分的預測靶點199個、單純健脾活性成分的預測靶點195個。

2.2 藥物活性成分-靶點網絡分析通過Cytoscape 3.8.0軟件得到藥物活性成分-靶點網絡圖。見圖1。活性成分節點有106 個，潛在靶點節點有83 個。節點度值排前4位的活性成分分別為槲皮素、木犀草酸、山柰酚、柚皮素。

圖1 藥物活性成分-靶點網絡圖

2.3 配伍治療OP作用靶點的獲取結果通過OMIM 等5個疾病在線數據庫最終得到OP基因靶點1531個。補腎藥與健脾藥的預測靶點和OP 疾病相關靶點的交集共83個，其中補腎藥治療OP的特有靶點有6個，健脾藥治療OP的特有靶點有5 個，補腎藥與健脾藥共有的治療靶點有72個，體現了補腎藥與健脾藥治療OP時存在協同作用。

2.4 PPI網絡分析通過1.2.4 的操作，得到補腎藥與健脾藥配伍治療OP的PPI的核心靶點。見圖2。圖中節點大小代表Degree值大小，可見，腫瘤蛋白p53基因（TP53）、雌激素受體1（ESR1）、連環蛋白1（CTNNB1）為篩選中最顯著的基因，提示其在OP治療中發揮關鍵作用。

圖2 核心靶點網絡圖

2.5 GO富集分析與KEGG富集分析

2.5.1 通過R軟件對潛在作用靶點進行GO富集分析潛在靶點在生物過程中富集最顯著的是腺體發育、氧化應激反應、對類固醇激素的反應等。同時，在細胞組分中富集最顯著的是囊腔、膜筏、膜微區、膜區等；在分子功能中富集最顯著的是DNA 結合轉錄因子結合、受體配體活性、信號受體激活劑活性等。見圖3。

圖3 GO富集分析結果

2.5.2 KEGG通路富集分析前20 條通路主要涉及糖尿病并發癥中的高級糖基化終末產物-受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪應力（FSS）與動脈粥樣硬化（Atherosclerosis）等。見圖4。

圖4 KEGG富集分析條狀圖

3 討論

由圖1 可見，補腎藥與健脾藥的配伍可由多種成分通過多條通路作用于多個靶點，而非單一作用。槲皮素是能夠有效清除衰老的骨髓間充質干細胞的經典抗衰老活性成分［9］；木犀草素具有抗過敏、抗氧化等作用；山柰酚對OP 具有明顯的治療作用，現已被證實能夠增加骨密度、改善骨微結構［10］。山柰酚、槲皮素二者均具有類似植物雌激素抑制骨吸收的作用。FSS 在成骨細胞的增殖和分化過程中起著重要作用，能夠誘導內質網（ER）快速釋放鈣離子，產生鈣瞬變，進一步激活能量代謝信號通路。Atherosclerosis 和OP 是相互關聯的實體，具有相似的致病機制。

綜上所述，本文基于網絡藥理學研究方法展開預測，補腎藥與健脾藥配伍可通過“多成分-多靶點-多通路”達到防治OP 的目的，多種成分作用于相同靶點、相同通路協同起效。通過對補腎藥與健脾藥的多靶點機制分析為進一步研究補腎健脾法治療OP 提供了新的研究基礎和思路。