補(bǔ)腎活血湯經(jīng)miR-135b改善內(nèi)異癥大鼠子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制研究 *

劉馨竹 祝 佩 崔 英※

（1.江西省婦幼保健院中醫(yī)科，江西 南昌 330000；2.江西省中西醫(yī)結(jié)合婦科病診療中心，江西 南昌 330000；3.江西省中西醫(yī)結(jié)合女性生殖重點(diǎn)研究室，江西 南昌 330000）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種子宮內(nèi)膜組織生長在子宮腔以外的婦科疾病，常引起繼發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔痛和不孕等癥。這種疾病常見于育齡婦女，患病率約為10%［1］。該病難以治愈，且治療后易復(fù)發(fā)，消耗了大量的社會資源，也給女性身體健康及家庭經(jīng)濟(jì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。約50%的EMs 患者合并不孕，“EMs 相關(guān)性不孕”的概念為國外學(xué)者Buyalos 等人于2000 年首次提出，并闡明其是通過多個環(huán)節(jié)引發(fā)不孕的［2］。子宮內(nèi)膜容受性（Endometrial receptivity，ER）是指子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力，是影響胚胎著床的關(guān)鍵因素；正常情況下人體內(nèi)膜在排卵后6～10 d 呈最佳容受狀態(tài)，這一時(shí)期又稱“著床窗口期”［3］。EMs 患者內(nèi)膜在著床窗口期出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)改變以及細(xì)胞因子、黏附因子和基因的表達(dá)異常，降低了ER，從而影響胚胎著床，導(dǎo)致不孕。miR-135b 和HOXA10 mRNA 基因與ER 關(guān)系密切。本研究主要通過檢測miR-135b 和HOXA10 mRNA基因的表達(dá)，探討EMs對ER的影響機(jī)制及補(bǔ)腎活血湯改善EMs相關(guān)不孕癥患者ER的潛在機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物年齡70 d左右［平均體質(zhì)量（270±6）g］的SPF 級SD 雌性大鼠68 只，購于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SYXK（贛）2010-0002。

1.2 主要藥物補(bǔ)腎活血湯，由江西省婦幼保健院中藥房提供藥材；地諾孕素，由德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 EMs大鼠分組根據(jù)體質(zhì)量將大鼠編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、西藥組、中藥組、空白正常組和假手術(shù)組，各12只；EMs供體組8只。

2.2 EMs大鼠模型的建立將8 只供體大鼠以0.9%水合氯醛腹腔注射，進(jìn)行麻醉；常規(guī)消毒后切除子宮，剪成3 mm×4 mm 大小的子宮碎片，縫合于受體大鼠兩側(cè)腹壁及卵巢周圍腸系膜血管豐富處，左右各1 塊，內(nèi)膜面朝向腹腔，逐層縫合腹腔；假手術(shù)組于兩側(cè)腹壁及卵巢周圍腸系膜血管豐富處各縫合1 個線結(jié)，逐層縫合腹腔。術(shù)后大鼠均予青霉素鈉注射液腹腔注射10 000 IU。術(shù)后5 d腹部切口常規(guī)消毒?？瞻渍＝M無需處理。

造模1 周后，各組隨機(jī)選取2 只大鼠檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒?。若移植組織體積增大，異位病灶內(nèi)液體積聚，見硬質(zhì)透明小囊泡，內(nèi)含淡黃色透明液體，并與周圍組織呈不同程度的粘連；卵巢旁異位病灶與周圍緊密粘連、不易分離，可形成包裹性積液或血腫；HE 染色后，光鏡下見明顯的內(nèi)膜細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞、腺體，視為造模成功。

2.3 給藥方法模型建立2 周后給藥，5 d 為1 個周期，連續(xù)給藥3個周期。

2.3.1 中藥組予補(bǔ)腎活血湯。組方：桃仁15 g，丹參20 g，白芍15 g，炙甘草9 g，菟絲子10 g，當(dāng)歸10 g，紫河車10 g，川芎10 g，赤芍10 g；用500 mL蒸餾水將以上中藥材浸泡30 min，加熱沸騰后小火微沸30 min，煎煮兩次；將兩次藥液合并，紗布過濾，水浴鍋濃縮至生藥含量為1.09 g/mL的中藥液，裝于無菌小瓶中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。劑量?09 g/60（kg·d）×6.25=11.35 g/（kg·d）≈0.011 g/（g·d）

2.3.2 西藥組予地諾孕素。地諾孕素為白色或類白色片，每片含地諾孕素2 mg。用蒸餾水溶解藥片，制成溶液，調(diào)整濃度為含地諾孕素0.2 mg/mL 的藥液。劑量：2.0 mg/60（kg·d）×6.25=0.21 mg/（kg·d）≈0.0002 mg/（g·d）。

2.3.3 其他模型組、假手術(shù)組依據(jù)體質(zhì)量予等量蒸餾水灌胃。

2.4 標(biāo)本采集各組大鼠著床窗口期采用頸椎脫臼法處死，剖腹，完整取出雙側(cè)卵巢和子宮，用小鑷子仔細(xì)分離并剔除表面的脂肪，0.9% NaCl 注射液沖洗血漬，濾紙吸拭表面，放置于凍存管中，置于-80 ℃冰箱里保存，待檢測。

2.5 RT-PCR法檢測子宮內(nèi)膜miR-135b和HOXA10 mRNA表達(dá)量取手術(shù)切除的各組大鼠一半子宮內(nèi)膜組織，采用TRIzol 法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD 260/280 為1.8～2.1。按TaqMan microRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按TaqMan Universal PCR Master Mix 試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所有引物由哈爾濱賽拓生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

PCR 擴(kuò)增體系（10 μL）：2×TaqMan PCR Mix 5 μL+上下游引物各1 μL+模板cDNA 1 μL+蒸餾水2 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。

以U6 或GAPDH 為 內(nèi) 參，采 用2-ΔΔct法 計(jì) 算miR-135b、HOXA10 mRNA 相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，行單因素方差分析，組間比較并用邦弗倫尼法；以GraPhpad Prism 9.0 軟件作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

采用RT-PCR 法檢測結(jié)果顯示，空白正常組和假手術(shù)組著床窗口期子宮內(nèi)膜miR-135b 表達(dá)量顯著低于模型組、中藥組和西藥組，中藥組顯著低于模型組和西藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；空白正常組和假手術(shù)組的HOXA10 mRNA 顯著高于模型組、中藥組和西藥組，而中藥組和西藥組顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2、圖1、圖2。

圖1 miR-135b在各組的表達(dá)

圖2 HOXA10在各組的表達(dá)

表2 各組大鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜miR-135b、HOXA10 mRNA表達(dá)比較

4 討論

EMs 的亞型及導(dǎo)致的疼痛、炎癥、盆腔解剖結(jié)構(gòu)改變、粘連、卵巢儲備功能紊亂、子宮內(nèi)膜容受性同疾病的全身影響之間的復(fù)雜相互作用，可導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生［4］。研究［5］表明，EMs患者血清及腹腔液中白細(xì)胞介素-37（IL-37）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平比正常組顯著增高，干擾素-γ（IFN-γ）的分泌顯著降低。Bagot C N 等［6］的研究認(rèn)為，EMs通過降低小鼠HOXA10 mRNA的表達(dá)，影響胞飲突的發(fā)育從而降低ER。

miR-135 包括miR-135a 和miR-135b 兩種亞型，其表達(dá)與ER及著床密切相關(guān)。在正常子宮內(nèi)膜和EMs女性的月經(jīng)周期中，miR-135 表達(dá)譜存在顯著差異［7，8］。Riyanti A等［9］研究發(fā)現(xiàn)，不孕癥女性的子宮內(nèi)膜中miRNA-135b的表達(dá)高于能正常生育的對照組1.81 倍（P＜0.01），而HOXA-10 mRNA 的表達(dá)顯著低于對照組（P=0.047），結(jié)論與本研究類似。Petracco R 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，與正常女性相比，EMs患者增殖期子宮內(nèi)膜中miR-135a表達(dá)顯著升高，miR-135b在增殖期和分泌期都有較高表達(dá)且變化較小，且該研究還發(fā)現(xiàn)HOXA10 mRNA 基因在EMs 患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)受到抑制，故提示miR-135 的高表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜中HOXA10 mRNA 的表達(dá)，從而影響ER。本研究結(jié)果表明，miR-135a在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都抑制了HOXA10 mRNA 的表達(dá)，其促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲的能力被HOXA10 mRNA過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血瘀是本病的關(guān)鍵病機(jī)，瘀血積聚、腎精化源不足，導(dǎo)致腎虛血瘀；腎虛是基本病機(jī)，腎虛則氣血運(yùn)行不暢，血脈瘀積阻滯胞宮，形成腎虛血瘀，故腎虛與血瘀二者互為因果，相互影響［11］。本研究中已造模的三組大鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜miR-135b 表達(dá)量顯著高于空白正常組和假手術(shù)組，HOXA10 mRNA 表達(dá)量顯著低于空白正常組和假手術(shù)組，初步表明EMs 對ER 存在不良影響。中藥組大鼠在治療后子宮內(nèi)膜miR-135b 表達(dá)量比模型組顯著下調(diào)，HOXA10 mRNA 顯著上調(diào)（P＜0.05），表明補(bǔ)腎活血湯可通過抑制miR-135b的表達(dá)，上調(diào)HOXA10 mRNA，從而改善ER。

本研究首次報(bào)道了補(bǔ)腎活血可經(jīng)miR-135b 來改善EMs大鼠ER的機(jī)制，對進(jìn)一步的臨床治療及研究起到一定的啟示作用。