乳香提取物調控Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌細胞侵襲轉移的作用機制研究 *

鄧 蘭 楊嘉欣 李志明 吳輝淵

（江西中醫藥大學附屬醫院腫瘤科，江西 南昌 330000）

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球的發病率和病死率排名第三，嚴重危害人類健康［1-3］。研究［4］表明，在70%的CRC患者中發現了家族性腺瘤息肉?。ˋdenomatous polyposis coli，APC）基因的截斷突變。突變后的APC 無法與β-catenin結合以下調其水平，異常激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進了細胞的增殖、分化，導致CRC 的發生。因此Wnt/β-catenin信號通路在CRC的增殖、轉移以及血管生成中具有十分重要的作用［5，6］。

中藥乳香是五環三萜酸類化合物［7］，其最強成分是乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（Acetyl-11-keto-betaboswellic acid，AKBA）［8］。已有研究［9］證實，AKBA 在胃癌中通過下調Wnt/β-catenin 信號通路抑制癌細胞生長。而其在結直腸癌中能否通過調控Wnt/β-catenin 信號通路，發揮抑制腫瘤細胞增殖轉移的作用，值得進一步研究。故本研究以人結腸癌細胞株HCT-116 為研究對象，旨在確定AKBA 是否能通過調控Wnt/β-catenin 信號通路抑制該細胞侵襲轉移，從而阻止結直腸癌的發生和發展。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器（1）細胞株：人結腸癌HCT-116 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。（2）主要試劑：AKBA（美國Sigma 公司），四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），青霉素、鏈霉素（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），DMEM 培養基（美國Gibco公司），PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司），Wnt 信號通路特異性阻斷劑DKK1（德國默克生物科學公司），乙醇（上?？泼鸦瘜W科技有限公司），胰酶（上海碧云天生物技術有限公司），CCK-8 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Matrigel（美國BD Biosciences 公司），β-catenin［艾博抗（上海）貿易有限公司（Abcam）］，鼠抗GAPDH 單克隆抗體［艾博抗（上海）貿易有限公司（Abcam）］，顯影液［長沙維世爾生物科技有限公司（Well Biology）］。（3）主要儀器：超凈工作臺（上海鼎科科學儀器有限公司），二氧化碳培養箱（濟南鑫貝西生物技術有限公司），離心機（上海尚普儀器設備有限公司），酶標儀［山東博科生物產業有限公司（BIOBASE）］，光學顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將HCT-116 細胞加至含有10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素）的DMEM培養液中，在含5%CO2的37 ℃孵箱培養。使用無血清DMEM溶解AKBA，配置成1 mmol/L濃度的儲存液；將AKBA 儲存液加入培養基中，使其終濃度達到0 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L。取10 μL的Wnt信號通路特異性阻斷劑DKK1預處理細胞24 h后，加入AKBA。

1.2.2 CCK-8檢測AKBA對細胞增殖影響將100 μL（約2×103個）細胞懸液加至5 個平行孔的96 孔板中，37 ℃孵24 h；將100 μL 不同濃度的含AKBA 完全培養基加至培養皿中，繼續培養箱溫育48 h；每個孔加入CCK-8 溶液10 μL，繼續培養箱溫育1～4 h；酶標儀測定波長450 nm處的吸光度。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力標記筆水平放在6 孔板背面，間隔1 cm、橫過孔畫線，每孔至少3條。將細胞接種在畫線6 孔板中，以培養至完全融合后饑餓24 h，用10 μL 槍頭垂直于背部的橫線劃痕。用PBS 洗滌3 次，去除劃痕細胞。加入不同濃度的含AKBA 無血清培養基，或Wnt 信號通路特異性阻斷劑DKK1（5 μL）預處理12 h。拍照并標記照片點。將6孔板置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養48 h，再次拍攝照片。

1.2.4 Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲性用無血清DMEM 稀釋Matrigel 凝膠（1∶10），以每孔40 μL的量鋪在Transwell（18 μm）的上腔內；將腔置于24 孔板內，放細胞培養箱孵育24～48 h，讓基質凝膠完全干燥。在細胞接種前30 min，將40 μL 無血清DMEM 加入到凝膠室中，使基質凝膠水合。細胞消化前饑餓24 h，用PBS 洗滌3 次，加入胰蛋白酶消化，使用無血清DMEM 重懸，計細胞數。上室中加入200 μL 細胞懸液（2×105個），建立對照組和實驗組，實驗組上、下腔加入AKBA（100 nmol/L）。Wnt 信號通路特異性阻斷劑DKK1（5 μL）處理12 h 后，加入AKBA。空白組作為對照組。37 ℃孵育48 h。從上室抽取液體，棉簽輕輕擦拭上室上部未受侵犯的細胞；下室加入500 μL 甲醇并固定15 min，加入500 μL 的0.1%結晶紫，將固定的小室置于其中并染色15 min；將小室浸入去離子水中濕潤，洗滌多次，風干；顯微鏡下，直徑上取4 個視野，照相并計數。

1.2.5 Western blotting檢測細胞中相關蛋白表達將分離凝膠填至電泳槽適當高度，加入飽和正丁醇覆蓋凝膠表面，室溫下放置25～40 min，等待凝膠凝固后倒出正丁醇，用雙蒸水（ddH2O）沖洗，吸干；將濃縮凝膠裝滿電泳槽后插入取樣梳，室溫下放置25～50 min 至凝膠凝固。將預先制備好的樣品注入梳孔中，加入蛋白質標記物；以80 V 恒定電壓電泳30 min，以110 V 恒定電壓電泳直至溴酚藍到達凝膠下邊緣。將聚偏氟乙烯（PVDF）膜切成與凝膠相同大小，浸入膜轉移緩沖液中至少2～5 min；將膜轉移裝置的黑色面向下，逐一加入濾紙、海綿、PVDF 膜及凝膠；以300 mA 恒定電流轉膜2 h，取出PVDF 膜，用TBS-T 洗滌3 次，每次10 min。將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉（由TBS-T 制備）中，室溫下封閉至少1 h。將PVDF 膜放入Flotillin-2 抗體稀釋液（1∶1000 稀釋）中，孵育過夜或12～14 h；TBS-T 洗膜3 次，每次8～10 min。加入二抗稀釋液并孵育過夜或12～14 h；加入第二抗體稀釋液封閉溶液（HRPconjugated Goat-anti-Rabbit IgG，1∶5000 稀釋），37 ℃孵育1 h；用TBS-T 洗膜4 次，每次8～10 min。使用增強型化學發光反應（ECL）顯色，用Fluor Chem 5500 檢測雜交信號。

1.2.6 熒光定量PCR 提取細胞總RNA，酶標儀定量，稀釋至250 ng/μL；RNA逆轉錄反應后，通過實時熒光定量PCR反應檢測mRNA表達。

1.3 統計學方法本研究所有數據采用SPSS 26.0 統計軟件分析，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，組間比較行非配對t檢驗，兩組以上數據采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AKBA對細胞遷移侵襲的影響與AKBA 0 nmol/L組比較，各組細胞48 h 遷移能力、48 h 過膜細胞數及劃痕愈合率均降低，且隨著劑量增加而降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與AKBA 100 nmol/L 組比較，AKBA 100 nmol/L+DKK1組細胞的48 h遷移能力、48 h過膜細胞數及劃痕愈合率均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度AKBA影響人結腸癌HCT-116細胞遷移侵襲能力比較 （± s）

表1 不同濃度AKBA影響人結腸癌HCT-116細胞遷移侵襲能力比較 （± s）

注：與0 nmol/L組比較，1）P＜0.05；與5 nmol/L組比較，2）P＜0.05；與10 nmol/L組比較，3）P＜0.05；與50 nmol/L組比較，4）P＜0.05；與100 nmol/L組比較，5）P＜0.05。

劃痕愈合率/%65.43±4.38 60.72±5.32 48.34±5.121）2）36.69±5.131）2）3）28.32±4.251）2）3）4）20.17±4.311）2）3）4）5）19.32±4.341）2）3）4）5）組別0 nmol/L組5 nmol/L組10 nmol/L組50 nmol/L組100 nmol/L組200 nmol/L組100 nmol/L+DKK1組重復次數6666666 48 h遷移能力91.43±4.32 88.33±3.89 62.19±4.891）2）43.69±5.081）2）3）28.32±2.231）2）3）4）16.48±2.561）2）3）4）5）14.32±1.831）2）3）4）5）48 h過膜細胞數/個77.53±6.64 71.39±6.06 62.72±6.061）2）40.77±5.781）2）3）21.88±5.631）2）3）4）14.35±3.191）2）3）4）5）10.32±3.831）2）3）4）5）

2.2 AKBA對細胞增殖的影響CCK-8 法檢測不同濃度AKBA 對人結腸癌HCT-116 細胞增殖的影響，結果見圖1。隨著劑量的增加，AKBA對人結腸癌HCT-116 細胞增殖的抑制率顯著增加，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 不同濃度AKBA對人結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率影響比較

2.3 AKBA對C-Myc、β-catenin蛋白表達的影響與AKBA 0 nmol/L 組比較，各組細胞C-Myc、β-catenin 蛋白表達均降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度AKBA影響人結腸癌HCT-116細胞C-Myc、β-catenin蛋白表達比較

2.4 AKBA對C-Myc、β-catenin mRNA表達的影響與AKBA 0 nmol/L 組比較，各組細胞C-Myc、β-catenin 的mRNA 表達均降低，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度AKBA影響人結腸癌HCT-116細胞C-Myc、β-catenin mRNA 表達比較

3 討論

AKBA 具有抑制細胞增殖、誘導分化、促進凋亡等抗癌作用，可抑制多種惡性腫瘤細胞生長［10］。Wnt信號在細胞內有2 條通路，其一便是經典Wnt/β-catenin 通路，β-catenin 在該信號通路中起關鍵作用，是其中的核心元件。Wnt 蛋白通過影響由結直腸腺瘤性息肉蛋白等組成的降解復合物的磷酸化作用，調控胞質內β-catenin的濃度，參與Wnt 信號通路的激活。Wnt/β-catenin 下游靶基因眾多，其中包括原癌基因C-Myc；而原癌基因CMyc的表達可促進細胞過度增殖，抑制細胞凋亡［11］。

本研究發現，隨著AKBA 劑量的增加，HCT-116 細胞增殖抑制率上升，細胞48 h 遷移能力、48 h 過膜細胞數及劃痕愈合率均降低；DKK1 抑制Wnt/β-catenin 信號通路后，侵襲數量接近AKBA 200 nmol/L 組；此外，AKBA 作用使細胞中C-Myc、β-catenin 蛋白表達及mRNA表達均降低。

綜上所述，AKBA 能夠通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活性，對人結腸癌細胞株HCT-116 產生抗腫瘤作用。此結果可為進一步研究AKBA 應用于結直腸癌或其他癌癥的治療提供依據。