蔥白提取物通過(guò)PPARγ/HO-1途徑對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂異常和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

范鴻儒,王 棟,張 帆,楊 力,易春峰,賀立群

湖北省武漢市第一醫(yī)院/武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖北武漢 430022

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ),表現(xiàn)為慢性血管炎癥性疾病,其過(guò)程涉及動(dòng)脈內(nèi)壁巨噬細(xì)胞富集脂質(zhì),血管平滑肌細(xì)胞與纖維基質(zhì)增生,導(dǎo)致內(nèi)膜局部不對(duì)稱增厚,終形成阻礙血流的斑塊。這些斑塊的形成與破裂可能引起血管狹窄、器官缺血乃至梗死,并可能觸發(fā)血栓生成[1-2]。目前,AS的治療主要依靠他汀類藥物、抗血栓藥物和手術(shù)干預(yù),但是藥物不良反應(yīng)和手術(shù)并發(fā)癥的存在使得AS的臨床治療效果達(dá)不到預(yù)期[3]。因此,發(fā)掘新的治療方法對(duì)于改善AS患者的預(yù)后至關(guān)重要。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類核受體,調(diào)控糖脂代謝和炎癥反應(yīng),對(duì)抗AS的發(fā)展發(fā)揮著重要作用[4]。血紅素氧合酶1(HO-1)是一種抗氧化應(yīng)激酶,也是PPARγ的下游效應(yīng)之一,其上調(diào)可保護(hù)血管免受氧化損傷,減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[5]。蔥白提取物(FOB)含有豐富的活性成分,已知具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多種生物活性[6-8],提示了它在心血管疾病中潛在的治療價(jià)值。相關(guān)研究報(bào)道,FOB具有抗AS的作用[9],但FOB干預(yù)AS的作用機(jī)制尚未完全明確。鑒于FOB在抗炎和調(diào)節(jié)血脂等方面的潛力,筆者推測(cè)FOB可能通過(guò)激活PPARγ/HO-1途徑來(lái)發(fā)揮作用。因此,本研究探討FOB對(duì)AS大鼠模型血脂異常和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,以及PPARγ/HO-1途徑在其中的潛在機(jī)制,為開(kāi)發(fā)新型AS治療策略提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量180～220 g,6～8周齡,購(gòu)自北京天誠(chéng)醫(yī)藥科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2021-0066]。本研究通過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：2022-0603)。大鼠自由飲水進(jìn)食,飼養(yǎng)于濕度50%～60%、溫度18～24 ℃、12 h光暗交替的動(dòng)物房。

1.2主要試劑與儀器 FOB(純度：98 %,規(guī)格：10 mg)購(gòu)自深圳卓越生物醫(yī)藥科技公司;PPARγ抑制劑GW9662(純度：98 %,規(guī)格：10 mg)購(gòu)自武漢科斯坦生物科技公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海齊源生物科技公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、油紅O染色試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒均購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程公司;Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博科技公司;兔抗PPARγ、HO-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自上海鈺博生物科技公司。

XSP-GX14C熒光顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器六廠;DT-380全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自盛世東唐江蘇生物科技公司;LD-96A多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自山東萊恩德智能科技公司;YT-PCR1熒光定量PCR檢測(cè)儀購(gòu)自山東云唐智能科技公司;6400 Advanced電泳儀購(gòu)自深圳市凈康科技公司;KETA GL全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京好億科技發(fā)展公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型構(gòu)建 大鼠適應(yīng)環(huán)境后,參照文獻(xiàn)[10]的方法,給予高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)10周,喂養(yǎng)1周后腹腔注射60萬(wàn)U/kg維生素D3溶液(注射1次),光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠主動(dòng)脈組織上有粥樣斑塊形成,血管壁和內(nèi)膜明顯增厚,表明AS大鼠模型構(gòu)建成功。

1.3.2動(dòng)物分組及給藥 40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組(AS組)、FOB組和FOB+GW9662組,每組10只。對(duì)照組大鼠給予正常飼料喂養(yǎng),其余各組大鼠均建立AS模型。參考文獻(xiàn)[11]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定給藥劑量,FOB組大鼠灌胃600 mg/kg的FOB溶液;FOB+GW9662組大鼠灌胃600 mg/kg的FOB溶液,并尾靜脈注射1 mg/kg的GW9662;AS組和對(duì)照組大鼠均灌胃等劑量生理鹽水。每天1次,連續(xù)給藥8周。

1.3.3標(biāo)本采集 末次給藥結(jié)束后,采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集大鼠腹主動(dòng)脈血液,用TD5A臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)在4 ℃以3 500 r/m離心10 min后,收集血清,—80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｂ樽硖幩来笫?分離大鼠胸主動(dòng)脈組織,清洗后取根部主動(dòng)脈制作冷凍切片,其余主動(dòng)脈組織保存于—80 ℃條件下備用。

1.3.4大鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)評(píng)估 取大鼠主動(dòng)脈冷凍切片,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別行油紅O染色、HE染色實(shí)驗(yàn)。顯微鏡下觀察大鼠胸主動(dòng)脈血管壁上脂質(zhì)斑塊面積以及血管壁情況。

1.3.5大鼠血脂水平檢測(cè) 取大鼠血清,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI),AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.3.6大鼠血清炎癥因子水平檢測(cè) 取大鼠血清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.3.7qRT-PCR法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平 以Trizol試劑抽提大鼠胸主動(dòng)脈組織總RNA,定量RNA濃度后,嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。PPARγ正向引物序列：5′-ACAGACCTCAGGCAGATCGT-3′,反向引物序列：5′-GGGTGAAGGCTCATGTCTGT-3′;HO-1正向引物序列：5′-GGAACGTGTGCAGGTTGGAT-3′,反向引物序列：5′-TCTCCAGCAGTGCCATCTCT-3′;GAPDH正向引物序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′,反向引物序列：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.3.8Western blot法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平 將大鼠胸主動(dòng)脈組織用RIPA緩沖液裂解提取總蛋白質(zhì),使用BCA試劑盒對(duì)提取物中蛋白質(zhì)的水平進(jìn)行定量。取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h,然后用一級(jí)抗體PPARγ(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育膜過(guò)夜,清洗膜,加入HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL試劑顯色,凝膠成像儀采集圖像,進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化及脂質(zhì)沉積情況 對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)膜光滑、形態(tài)正常,無(wú)脂質(zhì)沉積;AS組大鼠胸主動(dòng)脈管壁明顯增厚,內(nèi)皮細(xì)胞脫落結(jié)構(gòu)不完整,內(nèi)膜下可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞堆積,脂質(zhì)斑塊形成;FOB組大鼠胸主動(dòng)脈管壁增厚有所減輕,內(nèi)皮細(xì)胞較為完整,內(nèi)膜下存在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫樣細(xì)胞聚集,脂質(zhì)斑塊變小,大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化較AS組明顯改善;FOB+GW9662組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化和脂質(zhì)斑塊較FOB組明顯加重。見(jiàn)圖1、圖2。

注：A為對(duì)照組;B為AS組;C為FOB組;D為FOB+GW9662組。

注：A為對(duì)照組;B為AS組;C為FOB組;D為FOB+GW9662組。

2.2各組大鼠血脂水平及AI比較 與對(duì)照組相比,AS組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著降低,HDL-C水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血脂水平及AI比較

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與對(duì)照組相比,AS組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.4各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,AS組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,AS組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);與AS組相比,FOB組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);與FOB組相比,FOB+GW9662組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

AS作為一種血管炎癥疾病,在老年人中尤其普遍,對(duì)老年人生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重不良影響。目前AS治療主要集中在中晚期,以抗血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、控制血壓和血糖等綜合治療為主[12]。然而,預(yù)防AS進(jìn)展比改善疾病預(yù)后更有意義。FOB在中醫(yī)中被廣泛用于發(fā)汗解表、通陽(yáng)利竅、溫中行氣和解毒消腫,臨床上常與其他藥物配伍,治療風(fēng)寒感冒、鼻塞、麻疹、消化不良和瘡瘍等多種疾病,同樣也具有抗炎抗氧化的功能[13]。FOB含有多種生物活性成分,這些成分被廣泛研究,因其在抗炎中展示的潛在益處而受到關(guān)注。例如,FOB主要成分硫化物具有減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的功能,可以對(duì)抗病毒引起的免疫過(guò)度激活[14]。研究表明,FOB在治療心肌缺血引起的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化、心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡以及纖維化中均表現(xiàn)出潛在的益處[15-17]。亦有研究證明FOB可以抑制AS進(jìn)展[18]。本研究在既往研究基礎(chǔ)上分析FOB抗AS的作用機(jī)制,通過(guò)建立AS大鼠模型,觀察大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué),結(jié)果顯示,AS大鼠胸主動(dòng)脈管壁明顯增厚,存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)堆積,斑塊形成。該結(jié)果與人類AS的病理結(jié)果一致,表明AS大鼠模型建立成功。

脂質(zhì)代謝異常是AS的危險(xiǎn)因素和主要特征,血清中的膽固醇可通過(guò)受損的血管內(nèi)皮滲入到動(dòng)脈壁,進(jìn)而在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚形成脂質(zhì)斑塊[19]。異常脂質(zhì)譜的特征通常是血液TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低。馮云霞等[20]研究報(bào)道,FOB可以明顯降低高脂血癥大鼠血清TG、LDL-C水平,升高血清HDL-C水平。本研究中,與對(duì)照組相比,AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI均顯著升高,HDL-C水平顯著降低;FOB干預(yù)有效降低了AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及AI,有效升高了HDL-C水平。表明FOB能夠通過(guò)調(diào)控血脂水平減輕大鼠AS。炎癥存在于整個(gè)AS過(guò)程中,是AS發(fā)展的關(guān)鍵因素。白細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)的積累是AS從開(kāi)始到晚期的突出特征。巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)積累誘發(fā)炎癥,炎癥促進(jìn)和增強(qiáng)AS的發(fā)展,炎癥和AS病變的發(fā)展形成正反饋回路。因此,抗炎治療是延緩AS斑塊發(fā)展并穩(wěn)定晚期病變的有效途徑之一[21]。研究數(shù)據(jù)顯示,AS中炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為T(mén)NF-α、IL-1β、IL-6以及黏附分子水平異常升高[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,AS大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明顯升高,FOB干預(yù)降低了AS大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。提示FOB在AS中通過(guò)調(diào)控炎癥因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

PPARγ是核激素受體超家族的成員之一,該超家族被認(rèn)為在各種病理?xiàng)l件下介導(dǎo)許多信號(hào)通路[23]。在被特異性配體激活后,PPARγ被易位以進(jìn)一步激活PPAR應(yīng)答元件以啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,PPARγ的激活被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)都有保護(hù)作用[24]。HO-1是一種應(yīng)激響應(yīng)蛋白,可將促氧化血紅素降解為游離鐵、膽綠素(膽紅素)和一氧化碳,HO-1通過(guò)這些酶促反應(yīng)發(fā)揮其各種生物活性[25]。鷹嘴豆芽素A通過(guò)激活PPARγ/HO-1途徑抑制脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防AS[26]。夏雯等[27]報(bào)道,FOB能夠促進(jìn)AS大鼠胸主動(dòng)脈中PPARγ蛋白表達(dá)。本研究在此基礎(chǔ)上探究PPARγ/HO-1信號(hào)通路是否參與FOB抗AS過(guò)程,結(jié)果顯示,FOB干預(yù)后,AS大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA表達(dá)水平以及PPARγ和HO-1的蛋白表達(dá)水平均升高。提示FOB干預(yù)提高了AS大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1的mRNA以及蛋白表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步應(yīng)用PPARγ抑制劑GW9662發(fā)現(xiàn),GW9662干預(yù)逆轉(zhuǎn)了FOB對(duì)AS大鼠胸主動(dòng)脈組織中PPARγ和HO-1表達(dá)的促進(jìn)作用,同時(shí),GW9662干預(yù)減弱了FOB對(duì)AS大鼠血脂水平和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。上述結(jié)果表明FOB可能通過(guò)激活PPARγ/HO-1信號(hào)通路對(duì)AS發(fā)揮治療作用。

綜上所述,FOB能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血脂異常和抑制炎癥反應(yīng)緩解高脂飲食誘導(dǎo)的AS,其作用機(jī)制可能與激活PPARγ/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。本研究在以往研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)FOB是治療AS的潛在候選藥物,但其具體作用劑量及潛在作用機(jī)制仍需開(kāi)展大量實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明確。