鹽度漸變對日本囊對蝦非特異性免疫酶、ATPase 酶和抗氧化酶活力的影響

陳 鑫，何 杰，張東旭，俞學(xué)軍，平洪領(lǐng)，張 濤，史會來，李 彬

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

日本囊對蝦Penaeus japonicus 屬甲殼綱、十足目、對蝦科、對蝦屬，廣泛分布在我國沿海、日本北海道以南、東南亞、澳大利亞北部、非洲東部及紅海等地區(qū)[1]。日本囊對蝦肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，耐干露，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是我國重要的對蝦養(yǎng)殖品種之一。近年來，隨著日本囊對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對其生物學(xué)特性、繁育、養(yǎng)殖等各方面的研究日趨增多[1-7]。

我國日本囊對蝦養(yǎng)殖主要集中在福建及廣東沿海地區(qū)，然而每年受臺風(fēng)暴雨的影響，養(yǎng)殖水域的鹽度發(fā)生大幅度變化，導(dǎo)致大量對蝦死亡[8-9]。鹽度作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的水體環(huán)境指標(biāo)之一，與甲殼動(dòng)物生長、發(fā)育、免疫等息息相關(guān)[5-6,10-11]。斑節(jié)對蝦Penaeus monodon[6]、凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei[12]、日本沼蝦Macrobrachium nipponense[13]等相關(guān)的研究結(jié)果表明鹽度的變化會對蝦機(jī)體的代謝、免疫、滲透等功能產(chǎn)生顯著影響，當(dāng)外界鹽度發(fā)生變化時(shí)，對蝦機(jī)體會通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，其中，酶活力是重要的調(diào)節(jié)方式之一[14-15]。在養(yǎng)殖過程中，劇烈的鹽度變化會破壞對蝦的滲透壓平衡，在養(yǎng)殖過程中，劇烈的鹽度變化會破壞對蝦的滲透壓平衡，影響蝦類的代謝和能量收支平衡，導(dǎo)致對蝦的免疫機(jī)能顯著降低，影響蝦的存活[6,16]，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致較高的死亡率[17]。因此，養(yǎng)殖期間水體鹽度的穩(wěn)定是蝦類養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，也是蝦類維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡和進(jìn)行正常生理活動(dòng)的重要保障，對病害的免疫調(diào)控具有重要意義。

目前，國內(nèi)外研究多聚焦于鹽度驟變角度[17-18]，鹽度漸變相關(guān)研究較少[15]；而鹽度漸變對日本囊對蝦相關(guān)酶活力影響方面的研究亦未見報(bào)道。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中，養(yǎng)殖水體鹽度變化很難發(fā)生驟增驟減情況，臺風(fēng)等極端天氣帶來的暴雨影響下，養(yǎng)殖水體鹽度變化在一定程度上也是逐漸降低的漸變過程。因此，為探究臺風(fēng)暴雨天氣養(yǎng)殖水體鹽度的變化對日本囊對蝦抗氧化酶、非特異性免疫酶和ATPase 酶活力的影響，筆者采用鹽度漸變處理的方式，測定了各實(shí)驗(yàn)條件下日本囊對蝦超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、多酚氧化酶(PPO)、ATPase(包括Na+/K+-ATPase 和總ATPase(T-ATPase)，活力及總蛋白含量的變化，從而為日本囊對蝦健康養(yǎng)殖及資源保護(hù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于浙江省海洋水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)所用日本囊對蝦均取自于浙江省海洋研究所實(shí)驗(yàn)基地養(yǎng)殖塘，原初水體鹽度26。選擇結(jié)構(gòu)完整、體色鮮明、活力較好、規(guī)格大小均勻，體長(8±0.4) cm 的日本囊對蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d。

1.2 方法

以養(yǎng)殖自然海水(鹽度26)為基礎(chǔ)，通過向自然海水中不斷添加淡水實(shí)現(xiàn)鹽度漸變，以模擬臺風(fēng)天氣降雨及臺風(fēng)過后換水引起的養(yǎng)殖水體鹽度變化。漸變試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)鹽度梯度，鹽度梯度幅度為4 個(gè)鹽度[19-20]，分別為26、22、18 和14，其中26 為正常海水的鹽度，為對照組；每個(gè)鹽度梯度下設(shè)3 個(gè)平行。

試驗(yàn)在直徑1.2 m、深0.8 m 的圓桶中進(jìn)行，每桶放蝦60 只。其中，鹽度組22、18、14 的圓桶對應(yīng)的裝置有24 h 排水量分別為40、80 和120 L 的排水管，用于降鹽處理。實(shí)驗(yàn)開始前，26、22、18、14 4 個(gè)鹽度組對應(yīng)桶內(nèi)自然海水(26)水體為260、220、180 和140 L；同時(shí)打開22、18、14 鹽度組的排水管，添加淡水緩慢降鹽，開始試驗(yàn)。第2 h，同時(shí)關(guān)閉進(jìn)水管，降鹽停止，適應(yīng)至72 h 后，采取逐漸換水的方式，鹽度逐漸恢復(fù)，時(shí)長24 h。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)開始后，在0、6、12、24、48、72、96 和120 h 時(shí)記錄各桶日本囊對蝦的死亡情況并隨機(jī)取樣，每次取樣時(shí)從每個(gè)桶內(nèi)迅速撈出5 尾蝦，用1 mL 無菌注射器從每1 尾擦拭干凈的蝦的頭胸甲2/3 處插入，在心臟中抽取血淋巴液1 mL 置于1.5 mL 離心管中，此過程在碎冰上進(jìn)行，每組平行中的日本囊對蝦的血淋巴樣品為1 個(gè)單獨(dú)樣本，4 ℃條件下過夜，隨后取出凝固的血淋巴并搗碎，冷凍離心機(jī)4 ℃條件下5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液于1.5 mL 離心管中，-80 ℃冰箱保存，待檢。

1.4 樣本檢測

非特異性免疫酶、ATPase 酶和抗氧化酶酶活性檢測均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。采用磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性；采用可見分光光度法測定酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)活性；采用分光光度計(jì)法多酚氧化酶測定多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性；采用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性；采用南京建成生物工程研究所研制的ATP 酶試劑盒測定Na+/K+-ATP 酶活性；采用考馬斯亮藍(lán)法(南京建成試劑盒)測定總蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。不同鹽度組間采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度漸變對日本囊對蝦死亡率的影響

鹽度漸變下日本囊對蝦累計(jì)死亡率趨勢如圖1所示，日本囊對蝦總體累計(jì)死亡率隨鹽度脅迫強(qiáng)度的加強(qiáng)而上升，累計(jì)死亡率與鹽度脅迫總體呈正相關(guān)趨勢，鹽度漸變脅迫下各組累計(jì)死亡率為14＞18＞22＞26。在鹽度漸變脅迫的第6 h，14、18 鹽度組最先出現(xiàn)死亡；漸變脅迫12 h，22 鹽度組開始出現(xiàn)死亡，累計(jì)死亡率為14＞18＞22。各鹽度漸變組的累計(jì)死亡率自12 h 始表現(xiàn)出明顯的逐漸升高趨勢，且隨著脅迫時(shí)間的延長而增速加快，第72 h，14 鹽度組的累計(jì)死亡率達(dá)30%，增速較快；18 鹽度組累計(jì)死亡率達(dá)26%，增速僅次于14 鹽度組；22 鹽度組累計(jì)死亡率為22%，增速平緩；至96 h 隨著鹽度恢復(fù)至初始鹽度值后死亡率增長終止。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦累計(jì)死亡率與鹽度的變化息息相關(guān)，低鹽漸變脅迫下，日本囊對蝦的滲透鹽度呈高滲調(diào)節(jié)，鹽度越低則偏離等滲鹽度越大，造成日本囊對蝦機(jī)體用于免疫的耗能越多，死亡發(fā)生率越大。

圖1 不同鹽度下日本囊對蝦隨時(shí)間變化的累計(jì)死亡率Fig.1 Cumulative mortality of P.japonicus in different salinity over time

2.2 鹽度漸變對日本囊對蝦血清蛋白含量的影響

由圖2 可知，在0～24 h 鹽度漸變過程中，22 鹽度組日本囊對蝦的血清蛋白含量在12 h 內(nèi)總體平穩(wěn)，變化幅度不大；12 h 始，血清蛋白含量開始呈總體下降趨勢，在24 h 降至目標(biāo)鹽度后，血清蛋白含量呈現(xiàn)出隨著脅迫時(shí)間的延長而不斷下降的特點(diǎn)，并在72 h 降至最低值；18 鹽度組血清蛋白含量自0 h 始開始呈下降趨勢，至24 h 降至目標(biāo)鹽度后下降趨勢減緩，在24～72 h 內(nèi)血清蛋白含量變化不大；14 鹽度組血清蛋白含量自0 h 始呈現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間的延長而不斷降低的變化趨勢，并在72 h 降至最低值。72 h，14、18、22 鹽度組血清蛋白含量與對照組均有顯著性差異(P＜0.05)，且各鹽度組在72 h 均顯著低于0 h(P＜0.05)。72 h后，隨著鹽度回升，各鹽度處理組的日本囊對蝦血清蛋白含量均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。分析結(jié)果表明，鹽度漸變過程中，日本囊對蝦血清蛋白含量受鹽度脅迫強(qiáng)度及時(shí)長的影響顯著(P＜0.05)，總體呈現(xiàn)出鹽度漸變脅迫強(qiáng)度越強(qiáng)，血清蛋白含量變化幅度越大的特點(diǎn)；漸變脅迫過程中，日本囊對蝦血清蛋白含量與脅迫時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖2 鹽度漸變對日本囊對蝦血清蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of salinity gradient on protein content in serum of P.japonicus

2.3 鹽度漸變對日本囊對蝦血清ACP 活力的影響

由圖3 可知，22、18 鹽度組日本囊對蝦血清ACP 活力具有“降低—升高—降低—升高”的變化趨勢，14 鹽度組血清ACP 活力具有“降低—升高”的變化趨勢；72 h 后隨著鹽度逐漸恢復(fù)至原初濃度，各鹽度組血清ACP 活力均有所上升，呈誘導(dǎo)趨勢。0～24 h，22、18 和14 鹽度組血清ACP 活力隨著鹽度的逐漸降低而降低；24～72 h，14 鹽度組血清ACP 活力隨著脅迫時(shí)間的延長呈抑制趨勢；在24 h 和72 h，各鹽度組血清ACP 活力均顯著低于對照組(P＜0.05)；22 鹽度組在24 h 達(dá)到最低值，18 和14 鹽度組在72 h 達(dá)到最低值，其中14 鹽度組96 h 的ACP 活力與72 h 比上升顯著(P＜0.05)。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦血清ACP 活力具有明顯的鹽度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性，鹽度梯度上表現(xiàn)為鹽度組14＜18＜22＜26，在漸變脅迫過程中，ACP 活力隨時(shí)間的延長呈下降趨勢。

圖3 鹽度漸變對日本囊對蝦血清ACP 活力的影響Fig.3 Effect of salinity gradient on ACP activity in serum of P.japonicus

2.4 鹽度漸變對日本囊對蝦血清AKP 活力的影響

由圖4 可知，鹽度漸變脅迫后，22、18 和14 鹽度組日本囊對蝦血清AKP 活力具有先下降后上升的趨勢。22 鹽度組在18 h 達(dá)到最低值，后隨著時(shí)間的增加而逐漸上升，總體變化幅度不大，與對照組差異不顯著(P＞0.05)；18 鹽度組的AKP 活力在18 h 顯著高于其他組(P＜0.05)，72 h 達(dá)到最低值，顯著低于對照組(P＜0.05)，而后隨著鹽度的逐漸恢復(fù)而逐漸上升；14 鹽度組血清AKP 活力在18～96 h 均顯著低于對照組(P＜0.05)，且在48 h 達(dá)到最低值，之后隨時(shí)間的增加而逐漸上升。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦血清AKP 活力與鹽度脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間整體成負(fù)相關(guān)，且隨著鹽度的恢復(fù)，血清AKP 活力均有所上升，呈誘導(dǎo)趨勢。

圖4 鹽度漸變對日本囊對蝦血清AKP 活力的影響Fig.4 Effect of salinity gradient on AKP activity in serum of P.japonicus

2.5 鹽度漸變對ATPase(包括Na+/K+-ATPase 和T-ATPase)活力的影響

由圖5 可知，14 鹽度組的日本囊對蝦血清Na+/K+-ATPase 活力顯著高于其它鹽度組(P＜0.05)，整體呈先升高后降低的趨勢；22、18 鹽度組的日本囊對蝦血清Na+/K+-ATPase 活力均呈“升高—降低—升高”的變化趨勢。22 鹽度組酶活力在18 h 和48 h 分別達(dá)到最高值和最低值，18 鹽度組酶活力在48 h 和72 h 達(dá)到最低值和最高值，14 鹽度組酶活力在0 h 和72 h達(dá)到最低值和最高值。鹽度漸變過程中，22、18鹽度組Na+/K+-ATPase 活力總體呈波動(dòng)性下降趨勢，均在48 h 酶活力達(dá)到最低值，與對照組無顯著性差異(P＞0.05)；14 鹽度組酶活力隨著時(shí)間的增加而逐漸升高，表現(xiàn)為單峰曲線變化，在72 h 達(dá)到最高值，與其它鹽度組的差異顯著(P＜0.05)。24～48 h，各鹽度的Na+/K+-ATPase 活力十分平穩(wěn)，無明顯變化。72 h 后隨著鹽度的逐漸恢復(fù)，血清Na+/K+-ATPase 活力呈上升趨勢。分析結(jié)果表明，低鹽脅迫強(qiáng)度越大，日本囊對蝦Na+/K+-ATPase 活力的時(shí)間變化趨勢越明顯。

圖5 鹽度漸變對日本囊對蝦血清Na+/K+-ATPase 活力的影響Fig.5 Effect of salinity gradient on Na+/K+-ATPase activity in serum of P.japonicus

由圖6 可知，22 鹽度組血清T-ATPase 活力變化整體呈波動(dòng)性升降，升降幅度不大，24 h T-ATPase 活力達(dá)到最高值，與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。18、14 鹽度組T-ATPase 活力均呈先上升后下降的趨勢，均表現(xiàn)為單峰曲線變化，18 鹽度組T-ATPase 活力在48 h 達(dá)到最高值，顯著高于對照組(P＜0.05)；14 鹽度組T-ATPase 活力在12～96 h 均顯著高于其它鹽度組(P＜0.05)，并在72 h 達(dá)到最高值，與組內(nèi)各時(shí)段的酶活力相比具有顯著性差異(P＜0.05)。24 h 鹽度漸變結(jié)束，14 鹽度組血清T-ATPase 活力顯著高于其它鹽度組(P＜0.05)。鹽度脅迫24～72 h，各鹽度組的日本囊對蝦血清T-ATPase 活力表現(xiàn)為鹽度14＞18＞22＞26。72 h 后隨著鹽度逐漸恢復(fù)，22 鹽度組的T-ATPase 活力緩慢上升，呈誘導(dǎo)趨勢，18、14 鹽度組T-ATPase 活力均有所下降，呈抑制趨勢。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦TATPase 活力與鹽度脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間總體呈正相關(guān)，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，T-ATPase 活力隨脅迫時(shí)間的延長而升高。

圖6 鹽度漸變對日本囊對蝦血清T-ATPase 活力的影響Fig.6 Effect of salinity gradient on ATPase activity in serum of P.japonicus

2.6 鹽度漸變對超氧化物歧化酶的影響

由圖7 可知，鹽度漸變過程中，鹽度脅迫時(shí)長對日本囊對蝦SOD 活力影響顯著(P＜0.05)，各鹽度處理組SOD 活力均表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長而逐漸降低的抑制趨勢。降鹽0～24 h、脅迫24～72 h 和鹽度漸復(fù)的72～120 h 3 個(gè)時(shí)段內(nèi)，22 鹽度組的SOD 活力始終高于18、14 鹽度組，3 個(gè)鹽度處理組的SOD 活力表現(xiàn)為鹽度22＞18＞14；降鹽18 h 和24 h，各鹽度處理組的SOD 活力顯著低于對照組(P＜0.05)，組間SOD 酶活力差異顯著。鹽度脅迫至72 h，各鹽度處理組的SOD 活力均達(dá)到最低值。72 h 后，隨著鹽度的逐漸恢復(fù)，各鹽度處理組的SOD 活力表現(xiàn)均有所上升，呈誘導(dǎo)趨勢。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦SOD 活力與鹽度脅迫強(qiáng)度之間呈負(fù)相關(guān)，低鹽脅迫的強(qiáng)度越強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長，其SOD 活力與對照組的差異越顯著(P＜0.05)。

圖7 鹽度漸變對日本囊對蝦血清SOD 活力的影響Fig.7 Effect of salinity gradient on SOD activity in serum of P.japonicus

2.7 鹽度漸變對日本囊對蝦血清PPO 活力的影響

由圖8 可知，22 鹽度組的日本囊對蝦血清PPO 活力0～6 h 表現(xiàn)穩(wěn)定，6 h 開始總體呈“降低—升高—降低—升高—降低”的變化趨勢，在18～24 h 變化幅度顯著(P＜0.05)，24 h PPO 活力達(dá)到最高值；18 鹽度組的PPO 活力0～6 h 表現(xiàn)穩(wěn)定，6 h 開始呈“升高-降低-升高-降低”的變化趨勢，鹽度脅迫24～72 h，隨著脅迫時(shí)間的延長PPO 活力呈上升趨勢，72 h 達(dá)到最高值，與對照組差異顯著(P＜0.05)；14 鹽度組的PPO 活力呈先升高后降低的變化趨勢，呈單峰曲線變化。降鹽開始至48 h，PPO 活力隨時(shí)間延長逐漸升高，24～48 h 上升幅度顯著(P＜0.05)，48 h 達(dá)到峰值后逐漸下降。72 h，18、14 鹽度組PPO 活力顯著高于對照組(P＜0.05)，72 h 后隨著鹽度的逐漸恢復(fù)，各鹽度處理組的PPO 活力總體呈下降趨勢，下降幅度漸緩。分析結(jié)果表明，日本囊對蝦血清PPO 活力受鹽度脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間的影響顯著，鹽度脅迫強(qiáng)度越強(qiáng)，血清PPO 活力的變化趨勢越明顯。

圖8 鹽度漸變對日本囊對蝦血清PPO 活力的影響Fig.8 Effect of salinity gradient on PPO activity in serum of P.japonicus

3 討論

3.1 鹽度漸變對日本囊對蝦死亡率的影響

鹽度是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，日本囊對蝦具有一定的廣鹽性，主要通過離子調(diào)節(jié)和滲透調(diào)節(jié)來適應(yīng)鹽度的變化，但在不同鹽度環(huán)境下的生長率、存活率等也不盡相同，日本囊對蝦的存活受鹽度影響較大。在養(yǎng)殖過程中，鹽度作為影響蝦類正常生理活動(dòng)的重要因子之一，當(dāng)鹽度發(fā)生改變，機(jī)體的免疫功能會受到影響，鹽度過高或過低會引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，此過程中免疫機(jī)能大大降低，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致較高的死亡率[11,19,21]。潘魯青等[22]研究了不同鹽度對日本囊對蝦仔蝦的生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明隨著向低鹽度變化仔蝦的存活率和增重率明顯下降。蔣湘等[23]研究鹽度對日本囊對蝦生長與存活率的影響，結(jié)果表明日本囊對蝦生長的最適鹽度為17～32，鹽度為27 條件下存活率最高，低鹽度下的存活率與高鹽度和中間鹽度相比最低。水柏年[24]研究日本囊對蝦蝦苗對若干環(huán)境因子的適應(yīng)性研究，結(jié)果表明日本囊對蝦蝦苗適應(yīng)鹽度范圍為18～30。楊其彬等[25]在鹽度對斑節(jié)對蝦存活率的研究結(jié)果表明最適鹽度為20～30。筆者的研究中鹽度漸變脅迫下各鹽度組日本囊對蝦的累計(jì)死亡率呈現(xiàn)出隨著鹽度逐漸降低以及脅迫時(shí)間的延長而上升，截至96 h 各鹽度組恢復(fù)至正常鹽度時(shí)，鹽度漸變脅迫下各組累計(jì)死亡率為14＞18＞22＞26，14 鹽度漸變脅迫死亡率最高，18 鹽度組死亡率次之，在22～26 鹽度內(nèi)存活率較高。鹽度脅迫24～72 h，各鹽度處理組的日本囊對蝦死亡率隨脅迫時(shí)間的增加而上升，單位時(shí)間內(nèi)14 鹽度組死亡率增加幅度最大。筆者的研究與以上研究結(jié)果基本一致，發(fā)現(xiàn)低鹽度脅迫對日本囊對蝦死亡率具有顯著影響，環(huán)境鹽度越低機(jī)體損傷越大，隨著向低鹽度的遞變?nèi)毡灸覍ξr存活率明顯下降，且隨著脅迫時(shí)間的延長死亡率也隨之上升。總體而言，在24 h 鹽度漸變至14 h，日本囊對蝦出現(xiàn)了較高的死亡率，說明鹽度漸變后對蝦需要進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)到一個(gè)新的滲透平衡狀態(tài)，當(dāng)超出了對蝦的滲透調(diào)節(jié)能力時(shí)引起死亡。因此，在日本囊對蝦的養(yǎng)殖管理中盡量保持水體鹽度的穩(wěn)定，做好養(yǎng)殖管理，降低因臺風(fēng)天氣帶來的鹽度變化過大而導(dǎo)致傷亡。

3.2 鹽度漸變對日本囊對蝦非特異性免疫酶的影響

水生動(dòng)物的生理代謝指標(biāo)會受到諸多因素的影響，如溫度、鹽度、飽食、生長、溶氧，這些指標(biāo)可以反映動(dòng)物機(jī)體的健康程度和生理反應(yīng)[26]。該研究中主要測定了血清總蛋白、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)的活性。血液蛋白質(zhì)的主要生理功能是維持膠體滲透壓，具有運(yùn)輸、免疫、修補(bǔ)組織和緩沖等作用，血清中蛋白質(zhì)含量與機(jī)體的免疫代謝和能量運(yùn)輸息息相關(guān)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成[27]。該研究中，日本囊對蝦的血清蛋白質(zhì)含量受鹽度漸變脅迫的影響呈現(xiàn)出明顯的鹽度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性，各鹽度處理組的血清蛋白質(zhì)含量波動(dòng)幅度表現(xiàn)為鹽度組14＞18＞22＞26，且14、18 鹽度組的蛋白質(zhì)含量自鹽度漸變0 h 始即表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，并在72 h 達(dá)到最低值，22 鹽度組則是鹽度漸變12 h 后開始出現(xiàn)下降趨勢，說明低鹽脅迫下日本囊對蝦血清蛋白質(zhì)含量受鹽度脅迫強(qiáng)度影響顯著，鹽度越低，日本囊對蝦機(jī)體內(nèi)外的滲透壓力越大，機(jī)體血清蛋白質(zhì)含量的下降幅度越大。72 h，各鹽度處理組的血清蛋白質(zhì)含量均幾近最低值，與對照組差異顯著(P＜0.05)，說明在鹽度漸變脅迫中，日本囊對蝦血清蛋白質(zhì)含量的變化具有明顯的時(shí)間相關(guān)性，且與脅迫時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，這與葉建生等[28]在鹽度突變對凡納濱對蝦血清蛋白含量影響的研究結(jié)果中所發(fā)現(xiàn)的血清蛋白含量呈現(xiàn)隨時(shí)間逐漸下降趨勢，且鹽度突變值越大，血清蛋白含量越低的研究結(jié)果具有一致性。72 h 后，各鹽度處理組的血清蛋白質(zhì)含量隨著鹽度的恢復(fù)而逐漸回升，回升幅度依次為鹽度組22＞18＞14，其中，14 鹽度組的血清蛋白質(zhì)含量回升幅度明顯低于18、22 鹽度組(P＜0.05)，說明鹽度漸變幅度越大，對機(jī)體免疫造成的脅迫性損傷越大，當(dāng)鹽度恢復(fù)至對照鹽度時(shí)，鹽度漸變幅度大的日本囊對蝦機(jī)體恢復(fù)速度要遠(yuǎn)慢于鹽度漸變幅度小的。

酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)是衡量機(jī)體免疫機(jī)能和代謝狀況的重要指標(biāo)，在蛋白(酶)的去磷酸化過程中起著十分重要的作用[29-30]，機(jī)體中這兩種磷酸酶的含量越高，機(jī)體的免疫功能越強(qiáng)。它們不僅參與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運(yùn)輸，而且還是生物體內(nèi)重要的解毒體系[31]，能通過產(chǎn)生水解酶體系對侵入體內(nèi)的異物等進(jìn)行破壞和消除，從而在甲殼類的生存生長過程中發(fā)揮著重要作用。因此，該研究通過對ACP 和AKP 活性的探討分析有助于了解鹽度對日本囊對蝦的營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、運(yùn)輸以及生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響。劉存歧等[32]研究了金屬離子對中國對蝦體內(nèi)AKP 活力的影響中發(fā)現(xiàn)AKP 活力隨外界環(huán)境因子發(fā)生改變，認(rèn)為其高低變化可以作為判斷機(jī)體免疫能力的衡量指標(biāo)。在該研究中，日本囊對蝦血清磷酸酶活力表現(xiàn)出具有明顯的鹽度相關(guān)性和時(shí)間相關(guān)性，各鹽度組磷酸酶活力總體均呈現(xiàn)出先下降后升高的趨勢，22 鹽度組ACP 和AKP 活力分別在24、18 h 降至最低值，18 鹽度組ACP 和AKP 活力分別在72、48 h 降至最低值，14 鹽度組磷酸酶活力均在72 h 降至最低值，與對照組差異顯著(P＜0.05),各鹽度組的磷酸酶活性在18～72 h 先后達(dá)到最低值，低鹽度顯著降低了日本囊對蝦的非特異性免疫功能，此時(shí)段內(nèi)日本囊對蝦機(jī)體損傷較大，由此推測這可能也是該時(shí)段內(nèi)日本囊對蝦累計(jì)死亡率升高較快的原因之一。在0～72 h 的低鹽漸變脅迫中，血清磷酸酶活力呈現(xiàn)出隨鹽度降低而降低的抑制性趨勢，2 種酶活力總體均呈現(xiàn)出14＜18＜22 的鹽度相關(guān)性。隨著脅迫時(shí)間的延長，ACP 和AKP 活力顯著降低，72 h 后，隨著鹽度的逐漸恢復(fù)，各鹽度組的ACP 和AKP 活力均呈上升趨勢，以14 鹽度組的升高幅度最大。該研究結(jié)果表明，日本囊對蝦血清磷酸酶活力受鹽度影響顯著，各鹽度組ACP 和AKP 活力均隨脅迫時(shí)間延長而呈下降趨勢，低鹽脅迫對磷酸酶的活力具有抑制作用，這與喬雁冰等[17]在鹽度對克氏原螯蝦血淋巴中ACP 和AKP 活性的影響的研究結(jié)果一致。鹽度恢復(fù)后，隨著鹽度升高其活性也逐漸上升，這與趙玉超等[12]在高鹽脅迫對凡納濱對蝦仔蝦體內(nèi)ACP 和AKP 活性的影響中發(fā)現(xiàn)隨鹽度升高，ACP 和AKP 的活性均逐步升高的研究結(jié)果相似。

3.3 鹽度漸變對日本囊對蝦ATPase 酶活力的影響

經(jīng)過長期不斷地進(jìn)化，水生生物形成了一套依靠自身特有的平衡調(diào)控機(jī)制來適應(yīng)目前的生存環(huán)境，以此來維持機(jī)體的正常代謝[33]。其中廣鹽性甲殼動(dòng)物為了適應(yīng)環(huán)境的改變，主要通過調(diào)控血淋巴的滲透壓維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)以保證維持正常的生命活動(dòng)。機(jī)體血淋巴中滲透壓的調(diào)節(jié)主要通過對鈉離子和氯離子的調(diào)控實(shí)現(xiàn)[34]。離子調(diào)控主要靠鰓上皮細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶來實(shí)現(xiàn)，其中Na+/K+-ATPase 是維持機(jī)體Na+、K+離子平衡的關(guān)鍵酶[35]。近年來，針對不同條件下甲殼動(dòng)物的Na+/K+-ATPase 活性變化已開展了大量研究，研究普遍認(rèn)為Na+/K+-ATPase 對血淋巴滲透壓具有重要的調(diào)節(jié)和維持作用[36-37]。李玉全等[15]在鹽度變化對脊尾白蝦ATPase 活力影響的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度漸變對Na+/K+-ATPase 和T-ATPase 活力具有極顯著影響，高鹽或低鹽滲透壓力下機(jī)體為維持Na+、K+離子平衡所消耗的Na+/K+-ATPase 會增加，機(jī)體Na+/K+-ATPase 活力會提高。該研究中，鹽度從26 漸變至22、18 的過程中，Na+/K+-ATPase 活力呈波動(dòng)性下降趨勢，T-ATPase 活力呈波動(dòng)性上升趨勢，但兩者的波動(dòng)幅度均不大，說明此鹽度范圍內(nèi)對日本囊對蝦造成滲透壓力未超出自身承受范圍，可快速調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+、K+平衡。鹽度從26 漸變至14 的過程中，Na+/K+-ATPase 和TATPase 活力均呈上升趨勢，Na+/K+-ATPase 活力在6 h 顯著高于對照組(P＜0.05)，24 h 2 種酶的活力值顯著高于26、22 和18 鹽度組，且隨時(shí)間延長與對照組差異越來越大，72 h 兩種酶的活力值均達(dá)到峰值，與各鹽度組差異極顯著。該研究結(jié)果表明14 鹽度下的對蝦機(jī)體滲透壓力顯著增加，機(jī)體需消耗大量Na+/K+-ATPase 來維持滲透平衡，此時(shí)機(jī)體調(diào)節(jié)平衡在離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中消耗的ATP 大大增加，使得T-ATPase 活力隨之升高。研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)鹽度在18～26 范圍內(nèi)漸變對日本囊對蝦造成的滲透壓力較小，未超出日本囊對蝦自身的耐受范圍，鹽度低于18 h，日本囊對蝦機(jī)體滲透壓力增大，這也與顧宇[6]在研究鹽度對斑節(jié)對蝦血淋巴滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATPase 的影響中的斑節(jié)對蝦鹽等滲點(diǎn)在鹽度20 左右，在鹽度20～25 的水體中有較好的適應(yīng)性的研究結(jié)論具有一致性。

3.4 鹽度漸變對日本囊對蝦抗氧化酶活力的影響

鹽度作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要環(huán)境因子，直接影響蝦類的多種生理活動(dòng)，鹽度的波動(dòng)會引起水生生物調(diào)節(jié)自身滲透壓以應(yīng)對環(huán)境壓力，而在此過程中往往會伴隨抗氧化酶活性的變化。SOD 作為動(dòng)物機(jī)體重要的抗氧化酶之一，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線[38]，在消除自由基、防御生物分子損傷方面發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究[39]表明機(jī)體在受到輕度的污染脅迫時(shí)SOD 會被激活，超出一定范圍后，活力呈現(xiàn)抑制趨勢。葉建生等[28]研究表明鹽度脅迫對凡納濱對蝦SOD 值影響顯著(P＜0.05)，鹽度突變值越大，SOD 活性越小。本研究中，0～72 h 鹽度漸變脅迫過程中SOD 活力值均表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長逐漸降低的抑制趨勢，日本囊對蝦SOD 活力與鹽度脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間總體呈負(fù)相關(guān)，低鹽脅迫的強(qiáng)度越強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長，其SOD 活力與對照組的差異越顯著，24～72 h 組間SOD 活力差異顯著(P＜0.05)，表現(xiàn)為鹽度14＜18＜22＜26。這與葉建生等[28]在凡納濱對蝦上的研究結(jié)果具有一致性。此外，本研究中22、18 鹽度組SOD 活力在6 h 均略高于對照組，之后均低于對照組，這與BJ?RN HENRIK HANSEN,et al[39]研究中得出的機(jī)體在受到輕度的脅迫時(shí)SOD 會被激活，超出一定范圍后，活力呈現(xiàn)抑制趨勢的結(jié)論相一致。

多酚氧化酶(PPO)是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類銅結(jié)合酶，可催化醌和單寧的合成，醌類參與細(xì)胞壁物質(zhì)的合成及代謝，能與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成聚合物，限制病原菌的擴(kuò)展，與抗病性表達(dá)有關(guān)。甲殼動(dòng)物酚氧化酶在入侵微生物的刺激下被激活，參與機(jī)體的防御反應(yīng)，與機(jī)體的免疫相關(guān)[40]。相關(guān)研究[41]表明PPO 在蝦類防御體外物質(zhì)入侵過程中,伴隨顆粒細(xì)胞的脫顆粒和酚氧化酶原的激活被釋放，酶活化后可以迅速黏附到異物表面,以便達(dá)到識別和調(diào)理的功能。VARGAS-ALBORE,et al[42]在研究中發(fā)現(xiàn)加利福尼亞對蝦幼蝦的血細(xì)胞中酚氧化酶原在鹽度降低時(shí)減少，酚氧化酶活力增加。葉建生等[28]在鹽度突變對凡納濱對蝦PO 活性的研究中發(fā)現(xiàn)，血清PO 活性受低鹽突變影響顯著，隨著鹽度降低呈上升趨勢，且鹽度突變值越大，PO 活性上升越明顯(P＜0.05)。本研究中，PPO 活力受鹽度漸變強(qiáng)度和脅迫時(shí)間的影響顯著，不同鹽度組間PPO 活力表現(xiàn)為鹽度漸變的強(qiáng)度越大，PPO 活力隨脅迫時(shí)間的變化趨勢越明顯，且組間差異明顯(P＜0.05)，各鹽度組間PPO 活力變化幅度表現(xiàn)為14＞18＞22＞26；各鹽度組內(nèi)PPO 活力變化亦具有明顯的時(shí)間性特征，脅迫時(shí)長對PPO 活力有顯著影響，14 鹽度組PPO 變化趨勢呈單峰曲線，48 h 達(dá)到峰值，18 鹽度組PPO 變化趨勢呈雙峰曲線，72 h 達(dá)到峰值。其中，在24～72 h 脅迫時(shí)段內(nèi)，14 鹽度組的PPO 活力72 h與48 h 比有所下降，可能是鹽度漸變幅度過大，隨著脅迫時(shí)間延長使得日本囊對蝦機(jī)體的滲透壓力劇增和代謝加速對能量的需求增加，引起機(jī)能協(xié)調(diào)失衡和免疫防御能力降低，48 h 時(shí)脅迫壓力已達(dá)到機(jī)體免疫酶承受限度的臨界點(diǎn)，72 h 體現(xiàn)在PPO 活力上表現(xiàn)出下降趨勢，但詳細(xì)的內(nèi)在機(jī)理尚未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。此外，鹽度26 漸變至22、18 鹽度過程中，6 h 后PPO 活力值才開始發(fā)生變化，而26 漸變至14鹽度過程中，PPO 活力在0～6 h 已呈上升態(tài)勢，且隨著脅迫時(shí)間的延長逐漸升高，自12 h 始PPO 活力均顯著高于對照組(P＜0.05)，72 h 14 和18 鹽度組的PPO 活力顯著高于對照組，表明了鹽度漸變幅度越大，PPO被激活的越早，其活性變化也越顯著。這些與葉建生等[28]在凡納濱對蝦上的研究結(jié)果相一致。

相關(guān)研究表明，當(dāng)養(yǎng)殖水環(huán)境的相關(guān)理化因子發(fā)生變化幅度超過對蝦的機(jī)體承受能力時(shí)，免疫系統(tǒng)會崩潰，各種免疫相關(guān)酶活力會發(fā)生強(qiáng)烈變化，嚴(yán)重時(shí)會造成對蝦大規(guī)模死亡[12,23,25,43]。因此，在日本囊對蝦的實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中，維持養(yǎng)殖水環(huán)境鹽度的相對穩(wěn)定具有十分重要的意義。