東海烏參活性肽的制備及其抑制細(xì)胞遷移活性的研究

劉澤洋，蘇來金，高暢暢，朱琰麟，陳 蔭

(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316002；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325000)

生物活性肽(bioactivity peptides)是一類源于動植物和微生物蛋白質(zhì)的具有某些生物活性的化合物，是由氨基酸殘基通過不同的排列方式而組成的結(jié)構(gòu)簡單的線性二肽到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的環(huán)形多肽的統(tǒng)稱。袁坤山等[1]研究發(fā)現(xiàn)海洋生物活性多肽多嵌入蛋白質(zhì)序列中，通過酶解、發(fā)酵和消化等不同的加工過程釋放出來。蘇來金等[2]采用響應(yīng)面法優(yōu)化海地瓜膠原蛋白水提工藝，并發(fā)現(xiàn)活性肽的來源、提取方式、氨基酸序列以及分子量大小，賦予其生物活性的多樣性。

海參屬棘皮動物門Echinodermata，海參綱Holothuroidea，形似黃瓜的無脊椎動物，分布范圍廣，是一類具有重要商業(yè)價值的海洋水產(chǎn)食品。葉加蘭等[3]研究發(fā)現(xiàn)海參膠原肽結(jié)構(gòu)獨特，具有合成高分子不具備的生物降解性、生物相容性和低抗原性。趙芹等[4]研究發(fā)現(xiàn)海參多糖、海參皂苷、膠原蛋白等多種生物活性物質(zhì)，具有提高機體免疫力、抗腫瘤、促進造血功能、抗凝血和降血脂等多種生理功效。趙麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)海參肽具有良好的溶解性、極佳的穩(wěn)定性、抗氧化性、抑制炎癥、抗疲勞、抗菌、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞及促進傷口愈合等多種生物活性。朱燕芳等[6]研究表明東海烏參與其他高值海參營養(yǎng)成分較為相似，是一種高蛋白低脂肪的海產(chǎn)品，其天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量均超過1%，鈣、鐵含量也非常高。高遠(yuǎn)等[7]研究表明，巖藻糖化硫酸軟骨素的硫酸軟骨素與體壁膠原蛋白纖維共價相關(guān)。海參的膠原纖維是異型的，由多種類型的膠原組成。考慮到海參體壁的復(fù)雜分子組成，不同的酶解工藝可以造成酶解過程中分子的變化，得到不同性質(zhì)的海參多肽和不同得率的海參多糖。對海參酶解產(chǎn)物的研究將有助于海參水解產(chǎn)物中活性多糖和多肽的生產(chǎn)和質(zhì)量控制。

從浙江海域東海烏參活性多糖提取的副產(chǎn)物中，提取分離純化多肽，并對其生物活性進行評價，為東海烏參來源多糖和多肽聯(lián)合開發(fā)利用提供理論依據(jù)，使東海烏參變廢為寶，促進高產(chǎn)量低附加值的東海烏參資源的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗選取的烏參Acaudina leucoprocta 采自浙江沿岸海域。

木瓜蛋白酶上海聚源生物有限公司；Bio-gei p-4 美國Bio-Rad；Q SepharoseFast Flow 上海源葉生物科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基，特級胎牛血清(FBS)北京索萊寶科技有限公司；抗體β-actin，β-catenin，pho-β-catenin，C-myc，Cyclin-D1，HRP 辣根過氧化物酶(二抗)武漢愛博泰克生物科技有限公司；

實驗中Folin-酚試劑、乙醇、氫氧化鉀、冰醋酸、氯仿、氯化鈉、正丁醇、氫氧化鈉、硫酸銅、牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮(MTT)均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

YF-103 型中藥粉碎機瑞安市永歷制藥機械有限公司；TGL-16M 型高速離心機上海盧湘儀器有限公司；HL-2 型恒流泵上海滬西分析儀器廠有限公司；DBS-100 型部分自動收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；Easy-nLC 1200 型毛細(xì)管高效液相色譜儀Thermo Fisher Scientific (美國)；TI-FL 型倒置光學(xué)顯微鏡日本尼康有限公司；SeriesⅡWater Jacker 型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo Fisher(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏參多糖偶聯(lián)多肽的提取

東海烏參主要利用的活性成分為多糖和多肽。工業(yè)化生產(chǎn)過程中主要將東海烏參去除內(nèi)臟，清理體壁泥沙后粉碎均質(zhì)后進行蛋白酶進行酶解，采用膜分離技術(shù)將多肽和多糖分離。多糖由于分子量大，被截留在膜上。研究表明，海參多糖特別是海參糖胺聚糖是以糖蛋白的形式存在的，為進一步將多糖偶聯(lián)蛋白或者多肽進一步釋放，將膜截留部分加入1% KOH 溶液，56 ℃木瓜蛋白酶酶解2 h 后，進一步將多糖偶聯(lián)多肽釋放，濃縮提取液至原體積的1/10，加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃醇沉過夜后離心。酶解步驟參照闕凡迪等[8]的方法，沉淀為東海烏參多糖，而醇沉上清液中主要含有釋放的多肽。將上清液濃縮至原體積1/20，并使用100 Da 透析袋透析除鹽48 h，濃縮冷凍干燥稱重，得多糖偶聯(lián)多肽粗品。

1.3.2 烏參活性肽的分離純化

冷凍干燥得到的烏參多肽粗品，以0.1 mol·L-1NaCl 為流動相，使用Bio gel p4 凝膠色譜柱(2 cm×120 cm)根據(jù)分子量進行純化，按峰收集，自動流水透析(100 Da,48 h)后凍干得到初步純化的烏參多肽。

對凝膠滲透柱層析分離得到的各個組分進一步采用Q SepharoseFast Flow(QFF)強陰離子柱層析對烏參多肽根據(jù)離子強度進行分離，依次采用不同濃度的NaCl 溶液進行梯度洗脫，透析濃縮后，凍干備用，得到純化多肽。

1.3.3 烏參活性肽組分活性初篩

1.3.3.1 MTT 法檢測烏參活性肽對HCT116 細(xì)胞增殖抑制作用

將各純化樣品溶液按每孔25、50、100、200 μg·mL-1的濃度進行給藥，孵育箱中分別培養(yǎng)24 h，48 h 后加入MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后再加入150 μL DMSO 溶液，振搖15min 后，酶標(biāo)儀570 nm 處檢測吸光度OD 值。MTT 測定參照周超熙等[9]的方法。

1.3.3.2 細(xì)胞劃痕法檢測烏參活性肽樣品對HCT116 細(xì)胞的遷移抑制能力

用移液槍頭對6 孔板中的細(xì)胞進行豎直劃痕，用PBS 清洗6 孔板2 次，每孔加入1 800 μL 的完全培養(yǎng)基和200 μg·mL-1的樣品溶液，并在培養(yǎng)0、8、16、24 h 后對標(biāo)記部位進行拍照記錄。細(xì)胞劃痕法參照安曉靜等[10]的方法：

1.3.4 東海烏參活性多肽的序列鑒定

1.3.4.1 GT2-0 還原烷基化

將樣品溶解于ddH2O，并加入二硫蘇糖醇溶液，56 ℃水浴還原1 h。再加入碘乙酰胺溶液避光反應(yīng)40 min，進行還原烷基化。使用自填脫鹽柱脫鹽，收集脫鹽后的樣品，于45 ℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑。

1.3.4.2 LC-MS/MS 檢測

毛細(xì)管色譜條件：分析柱：150 μm i.d.×150 mm,PepMap RPLC C18,1.9 μm,100 ? 流動相A：0.1%甲酸；流動相B：0.1%甲酸，80% ACN；流速：600 nL·min-1；每個組分分析時間：66 min。

質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：70 000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：100 ms；Scanrange：300 to 1 800 m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：17 500；AGCtarget：1e5；MaximumIT：50 ms；TopN：20；NCE/stepped-NCE：28。

1.3.5 東海烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞抗腫瘤活性研究

為了探究烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞遷移抑制作用的影響，首先按1.3.4.1的方法進行MTT 實驗。然后按1.3.4.2 中的方法對HCT116 細(xì)胞進行劃痕實驗。劃痕后通過給藥預(yù)先配置好的濃度為25、50、100、200 μg·mL-1的GT2-0，間隔0、8、16 和24 h 后倒置熒光顯微鏡下觀察拍照細(xì)胞劃痕面積的愈合情況。

1.3.5.1 Transwell 法檢測烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞遷移抑制活性

取生長狀態(tài)良好的HCT116 細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至8×103培養(yǎng)基總體積為180 μL 的無血清細(xì)胞懸液接種至Transwell 上室小孔，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞稍貼壁后[11]，上室加入20 μL 預(yù)先配置的GT2-0 樣品溶液，GT2-0 最終濃度為25、50、100、200 μg·mL-1。給藥后的Transwell 板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，使用結(jié)晶紫進行染色，用熒光倒置顯微鏡拍照并觀察細(xì)胞遷移情況，與不加GT2-0 的空白組比較，通過GT2-0 給藥組結(jié)晶紫染色情況，來評價GT2-0 對HCT116 的抑制遷移活性。

1.3.5.2 HCT116 細(xì)胞集落形成實驗

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞接種與6 孔板中，CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)細(xì)胞12 h，帶細(xì)胞完全貼壁后[12]，每孔加入4 個濃度的GT2-0，使其終濃度為25、50、100、200 μg·mL-1，每兩天更培養(yǎng)基并給藥1 次直到細(xì)胞集落形成。

集落形成后，取出6 孔板，PBS 清洗2 次，每次1 mL，甲醇固定20～30 min，PBS 再次清洗，加入預(yù)先配置好的結(jié)晶紫染液，每孔2 mL，染色30 min 后，PBS 洗去染料，進行拍照。加入1%醋酸溶液，搖床振動15 min后，570 nm 測吸光度。

1.3.6 烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄組的影響

1.3.6.1 RNA 純度檢測通過NanoDrop2000 對RNA 純度和濃度進行檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA 完整性進行檢測。瓊脂糖凝膠濃度：1%瓊脂糖膠；電壓：5 V·cm-1；時間：28 min。

1.3.6.2 RNA 文庫的構(gòu)建及上機測序

用寡核苷酸作引物以片段mRNA 為模板合成cDNA 第一條鏈，之后將RNA 降解并以dNTPs 為原料合成第二條cDNA[13]。對得到雙鏈cDNA 進行純化和末端修復(fù)等操作后進行PCR 擴增并通過AMPure XP beads 純化得到文庫，并用Agilent 2100 bioanalyzer 對文庫進行檢測確保質(zhì)量，最后進行Illumina 測序。

1.3.6.3 差異表達(dá)基因組聚類分析

采用距離計算算法：樣本間為spearman 相關(guān)系數(shù)，基因間為pearson 相關(guān)系數(shù)，采用的聚類方法為hcluster(complete 算法)。將樣品組(GT2-0)和空白組(KB)顯著差異表達(dá)的RNA 基因進行聚類分析。

1.3.6.4 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析

通過KEGG 分析GT2-0 給藥和空白組中基因轉(zhuǎn)錄組信號通路的差異性變化，探究GT2-0 作用HCT116 發(fā)揮抗腫瘤效果的作用機制。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)檢測Wnt/β-catenin 通路

發(fā)生癌變的細(xì)胞主要特征表現(xiàn)在細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞周期的失控，據(jù)大量國內(nèi)外文獻(xiàn)報道[14-21]，在大部分的結(jié)腸癌初期，癌細(xì)胞利用Wnt 通路對于腸道干細(xì)胞復(fù)制和代謝的調(diào)控，促使Wnt 通路異常激活，隨著癌變細(xì)胞的不斷增生，細(xì)胞其他的致癌基因和抑癌基因也會發(fā)生突變，從而導(dǎo)致腫瘤形成。MORIN,et al[22]研究表明β-catenin 作為與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白之一，也是β-catenin 是Wnt 通路中的關(guān)鍵蛋白。本課題選取Wnt/β-catenin 通路通過Western blot 實驗來驗證腫瘤細(xì)胞遷移抑制相關(guān)蛋白表達(dá)。

HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，給藥組加入濃度分別為25、50、100、200 μg·mL-1GT2-0 溶液。恒溫培養(yǎng)24 h后，進行樣本的制備，然后進行DS 丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，最后進行化學(xué)發(fā)光顯影[23-25]，用Alpha View SA 進行定量分析結(jié)合SPSS 分析其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏參活性肽的分離純化

海參是重要的海洋食品和藥物資源，含有海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白肽、海參腦苷酯、神經(jīng)節(jié)苷酯等多種生物活性物質(zhì)，對人體的生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。其中海參多糖和海參多肽是海參活性物質(zhì)中實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的成分。本文以工業(yè)化生產(chǎn)中酶解膜過濾截留部分為原料，這部分原料以多糖為主，占比達(dá)到85%以上，而蛋白多肽占比約為10%。通過堿處理的β 消除作用和二次酶解，進一步將與海參糖胺聚糖偶聯(lián)的多肽釋放。

利用多肽可以部分溶解在醇溶液的特性，通過乙醇沉淀將二次酶解后的多肽與多糖分開。將東海烏參活多肽粗品通過聚丙烯酰胺Bio-gel P-4 凝膠柱進行分離純化。根據(jù)分子量的不同，先后得到4 個組分，層析色譜圖見圖1，結(jié)合峰型先后命名為GT1、GT2、GT3、GT4。

圖1 東海烏參多肽的凝膠色譜圖Fig.1 Gel-permeation chromatogram of sea cucumber peptides

將得到的4 個組分進一步根據(jù)離子強度進行QFF 陰離子柱層析分離，梯度洗脫見圖2，得到5 個組分，并將該5 個經(jīng)過不同濃度NaCl 溶液洗脫后得到的組分分別命名為GT1-0.5、GT2-0、GT2-0.5、GT3-0、GT4-0。

圖2 QFF 柱層析上的梯度洗脫圖Fig.2 Segment elution figure on QFF

2.2 烏參活性肽組分活性初篩

海參對抗癌有明顯療效，對惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用。海參中的多糖、皂苷、多肽等營養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)，這些營養(yǎng)成分具有防癌抗癌的功效，趙綠翠等[26]研究也表明其主要的機理大致有以下3 種：(1)增強細(xì)胞免疫活性；(2)抑制腫瘤細(xì)胞遷移；(3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

采用MTT 法檢測烏參活性肽對HCT116 細(xì)胞增殖抑制作用。如圖3 所示，與空白組比較，濃度為200 μg·mL-1的5個樣品組GT1-0.5、GT2-0、GT2-0.5、GT3-0、GT4-0，在給藥HCT116 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的增殖率分別為86.4%、80.55%、84.5%、76.5%、74.5%，表明東海烏參多肽均有弱的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。

圖3 GT 對HCT116 的增殖率Fig.3 The proliferation of GT to HCT116 for 24 h

通過查閱劉寶龍等[27]研究報道的有關(guān)miR-375 對結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及凋亡的影響，可推測海參活性成分不僅僅可以通過細(xì)胞毒活性如海參皂苷發(fā)揮抗腫瘤活性，還可以通過抑制腫瘤細(xì)胞遷移發(fā)揮抗腫瘤作用。采用細(xì)胞劃痕法檢測東海烏參多肽樣品對HCT116 細(xì)胞的遷移抑制能力。在濃度為200 μg·mL-1的GT1-0.5、GT2-0、GT2-0.5、GT3-0、GT4-05 個組分給藥劃痕后的HCT116 細(xì)胞，分別拍照并計算給藥24 h 后，HCT116 細(xì)胞劃痕的傷口愈合面積，并由此來衡量細(xì)胞在藥物作用下的遷移能力(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞劃痕面積Fig.4 Scratch area of six groups

將對HCT116 細(xì)胞劃痕愈合率換算成藥物對HCT116細(xì)胞的遷移抑制能力，如圖5 所示，實驗結(jié)果表明，200 μg·mL-1GT2-0 組給藥劃痕后的HCT116 細(xì)胞24 h，細(xì)胞劃痕的傷口愈合程度最低，對細(xì)胞的遷移抑制能力最強。因此，后續(xù)選擇GT2-0 組分進行進一步抗腫瘤活性研究。

圖5 不同樣品組的傷口愈合率Fig.5 Wound healing rate of six sample groups

2.3 烏參活性肽GT2-0 的序列鑒定

質(zhì)譜采集的raw 文件，經(jīng)過軟件Byonic 數(shù)據(jù)庫檢索，得到鑒定結(jié)果見表1，本次實驗僅概述其中含量前10 個組分的二級質(zhì)譜分析。

表1 GT2-0 氨基酸組成部分?jǐn)?shù)據(jù)Tab.1 Partial sequences of GT2-0

經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測分析得出，GT2-0 組分主要的氨基酸序列為PSSPVSPPGYQSPR，GSTGPAGPQGPAGDR，GAPGERGDPGVAG，QQFSIGSTTVTYTFT，GQGMDRGPSGP，LPGVGPKMAHIVMD，STGPAGPQGPAGDR，QGLPGPQGPPGESIP，PGASGPLG，IGQTGPVG。從測序結(jié)果可知，東海烏參糖胺聚糖交聯(lián)蛋白經(jīng)過酶解主要得到分子量在650～1 500 范圍內(nèi)的8 肽-15 肽，以13 肽和15 肽居多，而氨基酸組成中以甘氨酸和脯氨酸居多，其次絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺等，氨基酸組成符合膠原蛋白氨基酸組成的主要特征，表明東海烏參中和海參糖胺聚糖偶聯(lián)的蛋白屬于膠原蛋白，與趙芹等[4]研究報道相符。

2.4 烏參活性肽GT2-0 的抗腫瘤活性研究

2.4.1 烏參活性肽GT2-0 對HCT116 的增殖抑制作用

GT2-0 分別給藥HCT116 細(xì)胞24、48 h 后，探討不同濃度的GT2-0 對細(xì)胞增殖率的影響，將細(xì)胞增殖率轉(zhuǎn)換成細(xì)胞抑制率，結(jié)果見圖6，GT2-0 對細(xì)胞的增殖抑制活性表現(xiàn)為隨濃度增加和給藥時間的延長其抑制效果更明顯，為了避免因GT2-0 長時間給藥對細(xì)胞活性的抑制作用，所以后續(xù)的細(xì)胞劃痕實驗選擇25、50、100、200 μg·mL-14 個濃度的GT2-0，給藥時間為24 h。

圖6 GT2-0 對HCT116 作用24、48 h 的抑制率Fig.6 The inhibition rate of GT2-0 on HCT116 for 24,48 h

2.4.2 細(xì)胞劃痕法檢驗烏參活性肽GT2-0 對HCT116 的遷移抑制作用

分析比較不同藥物濃度和不同給藥時間對HCT116 細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果見圖7，control 組，劃痕0～24 h 內(nèi)，前8 h 內(nèi)劃痕愈合率為25%左右，隨后愈合率雖然隨時間而增加，但增長速度變緩。GT2-0 給藥8 h，control 組和低濃度組(25 μg·mL-1)濃度組，劃痕愈合率相差不大，而中高濃度組(50～200 μg·mL-1)劃痕愈合率降低，與control 組無顯著性差異。給藥16 h，與control 組比較，低濃度組和高濃度組的劃痕愈合率降低，且中高濃度組具有顯著性。給藥24 h，與control 組比較，低濃度組和中高濃度組的劃痕愈合率隨濃度依賴降低，且在中高濃度組降低具有顯著性差異。綜上所述，HCT116 細(xì)胞的劃痕愈合率隨著GT2-0 濃度的增加(50～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi))以及給藥時間延長(16～24 h 范圍內(nèi))而顯著降低，這也證明了GT2-0對HCT116 細(xì)胞具有遷移抑制效果。

圖7 空白組以及0、8、16、24 h 時不同濃度GT2-0 組分細(xì)胞的傷口愈合率Fig.7 Wound healing rate of GT2-0 cells in blank group and at 0,8,16 and 24 h

2.4.3 Transwell 法檢測烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞的遷移抑制作用

Transwell 實驗可以從結(jié)晶紫染色后顏色的深淺程度來評價細(xì)胞遷移的能力，結(jié)晶紫顏色與細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān)，即顏色越深則表明遷移能力越弱。如圖8 所示，可以明顯看出空白組中結(jié)晶紫顏色更深，說明空白組中HCT116 細(xì)胞遷移數(shù)量多，而加入烏參活性肽GT2-0 作用后顏色變淺，則說明細(xì)胞明顯遷移數(shù)量變少，且隨著GT2-0 濃度的升高，結(jié)晶紫染色越淺，說明GT2-0 對HCT116 細(xì)胞遷移的抑制能力具有濃度依賴性。可見Transwell 實驗也證實了GT2-0 對HCT116 細(xì)胞遷移能力的抑制作用。

2.4.4 HCT116 細(xì)胞集落形成實驗

陶弋婧等[28]研究發(fā)現(xiàn)HCT116 腫瘤細(xì)胞在適宜的環(huán)境中可以實現(xiàn)增殖和細(xì)胞遷移，細(xì)胞集落實驗可以檢驗藥物對活細(xì)胞增殖能力的影響，如圖9 所示，為HCT116 細(xì)胞結(jié)晶紫染色后的圖片，將吸光度換算成集落形成率，以control 組為對照，如圖10 所示，結(jié)果表明，高濃度的GT2-0 能顯著降低集落形成率，在25～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性，200 μg·mL-1濃度GT2-0 對細(xì)胞集落形成與100 μg·mL-1相比，細(xì)胞集落形成率雖然有所提高，但無顯著性(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明，GT2-0 對HCT116 細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

圖9 不同濃度GT2-0 給藥HCT116 的劑量形成圖片F(xiàn)ig.9 Colony formation pictures of HCT116 treated with different concentrations of GT2-0

圖10 不同濃度的GT2-0 對HCT116 細(xì)胞的菌落形成率Fig.10 Colony formation rate of HCT116 treated with different concentrations of GT2-0

2.4.5 烏參活性肽GT2-0 對HCT116 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄組的影響

2.4.5.1 差異表達(dá)

借鑒梁曾恩妮等[29]研究方法，采用DESeq 對基因表達(dá)進行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|＞1，顯著性＜0.05。不同分組之間的差異表達(dá)基因統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 空白組與GT2-0 給藥組基因的差異性表達(dá)Tab 2 The difference of Gene expression between KB and GT2-0

2.4.5.2 GO 功能注釋分析

參考關(guān)麗娜等[30]實驗分析方法對差異表達(dá)的基因的GO 富集進行結(jié)果分析，并且對每個GO 分類挑選出p-value 最小即富集最顯著的前10 個GO term 條目進行展示，結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，KB 組與GT2-0給藥組相比較，在生物學(xué)過程(BP)中，表皮生長因子以及ERBB 信號通路的都呈正向調(diào)節(jié)趨勢，說明GT2-0 可以抑制HCT116 增殖和遷移，與之前的MTT 實驗和劃痕實驗結(jié)果一致。

圖11 KB VS GT200 差異表達(dá)基因的GO 注釋圖Fig.11 GO Annotation of Differential Genes in HCT116

2.4.5.3 KEGG 富集分析

將空白組(KB)與GT2-0 給藥組中所有基因為參照對比差異性表達(dá)基因進行KEGG 富集分析。挑選FDR 值最小的即富集最顯著的前20 條KEGG pathway 進行展示，結(jié)果見圖12。結(jié)果表明，與KB 組比較，GT2-0 給藥后的HCT116 細(xì)胞，其機制與cGMP-PKG、NF-κB、T 細(xì)胞受體以及B 細(xì)胞受體等信號通路相關(guān)。

圖12 KEGG 富集通路Fig.12 KEGG pathway enrichment

2.4.6 Western blot 檢測對HCT116 細(xì)胞遷移抑制蛋白表達(dá)

通過基因轉(zhuǎn)錄組分析可知，與空白組比較，烏參活性肽GT2-0 給藥組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)與ERBB，NF-κB 等通路相關(guān)，而這些通路與細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞遷移運動相關(guān)，通過查閱羅歡等[31]研究也發(fā)現(xiàn)βcatenin 作為與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白之一，也是β-catenin 是Wnt 通路中的關(guān)鍵蛋白。本課題選取Wnt/βcatenin 通路通過Western blot 實驗來驗證腫瘤細(xì)胞遷移抑制相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.4.6.1 烏參活性肽GT2-0 對HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞中總β-catenin 蛋白的表達(dá)

實驗結(jié)果如圖13 所示，GT2-0 以25、50、100、200 μg·mL-1給藥細(xì)胞24 h 后，通過Western blot 檢測細(xì)胞遷移通路Wnt/β-cetenin 相關(guān)蛋白β-catenin、p-β-catenin、C-myc、Cyclin-D1 表達(dá)情況，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)總的β-catenin 下調(diào)，磷酸化的β-catenin 顯著上調(diào)，下游蛋白C-myc、Cyclin-D1 表達(dá)均呈濃度依賴下調(diào)趨勢。說明GT2-0 通過引起總β-catenin 蛋白磷酸化，使得細(xì)胞內(nèi)總的β-catenin 減少，β-catenin 入核降低抑制下游的靶基因C-myc、Cyclin-D1 抑制細(xì)胞遷移，從而發(fā)揮抗腫瘤效果。

圖13 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞遷移通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.13 The expression of proteins related to cell migration pathway was detected by western blot

3 總結(jié)與討論

該研究從東海烏參酶解醇沉上清液中，提取活性肽，經(jīng)過Bio gel P-4 凝膠柱層析，得到4 個組分后再進行QFF 強陰離子柱層析分離純化，得到純化后的5 個組分。通過HCT116 細(xì)胞劃痕活性初篩，結(jié)果表明，GT2-0 最具有HCT116 細(xì)胞遷移抑制活性，因此，對GT2-0 組分分別進行結(jié)構(gòu)分析和抗腫瘤實驗。LCMS 得出GT2-0 主要的氨基酸序列為PSSPVSPPGYQSPR，GSTGPAGPQGPAGDR，GAPGERGDPGVAG，QQFSIGSTTVTYTFT，GQGMDRGPSGP，LPGVGPKMAHIVMD，STGPAGPQGPAGDR，QGLPGPQGPPGESIP，PGASGPLG，IGQTGPVG。抗腫瘤活性試驗表明了GT2-0 對人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞具有增殖抑制以及遷移抑制活性，隨后空白組和GT2-0 給藥HCT116 細(xì)胞組比較分析其基因顯著性差異表達(dá)，并進行KEGG 通路富集，結(jié)果表明與空白組相比，GT2-0 參與細(xì)胞表皮生長因子，ERBB，NF-κB 等信號通路，發(fā)揮抗腫瘤的作用。實驗中，僅選取與細(xì)胞遷移相關(guān)的Wnt/β-catenin 通路進行Western Blot 實驗，結(jié)果表明，與空白組比較，GT2-0 可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)總β-catennin 蛋白表達(dá)，增加磷酸化β-catennin 蛋白表達(dá)，C-myc 蛋白以及Cyclin-D1 蛋白表達(dá)顯著降低。

綜上所述，該研究通過對東海烏參活性肽進行分離提取純化，結(jié)構(gòu)解析和抗腫瘤活性分析，表明該活性肽存在良好的抗結(jié)腸癌腫瘤活性，為將來東海烏參的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。