骨髓間充質干細胞來源的外泌體靜脈移植對脊髓損傷的修復作用研究

馬 驄，李 剛，馬亮亮，李 想，張永潑

1.河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）康復醫(yī)學科，河南 鄭州 450003；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）小兒外科，河南 鄭州 450003；3.河南省組織細胞庫有限公司，河南 鄭州 450000

脊髓損傷是脊柱骨折的嚴重并發(fā)癥，從病理解剖上可將脊髓損傷分為原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷，主要表現(xiàn)為四肢功能活動障礙、大小便功能障礙等，容易給患者的脊髓造成嚴重的功能損傷［1］。脊髓損傷的主要危害為各系統(tǒng)都可出現(xiàn)臨床癥狀，且癥狀取決于損傷的部位，還有可能造成患者的下肢功能障礙，且神經(jīng)傳導通路最終都是傳到腦部，頸椎、胸椎和腰椎損傷也可能發(fā)生大小便控制障礙［2］。此外，患者還會出現(xiàn)疼痛、感覺異常、肢體痙攣，同時導致患者社會參與度下降，給患者的生存質量造成嚴重影響。干細胞研究是繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應用前景的生命科學領域。隨著我國醫(yī)療水平的不斷提升，骨髓間充質干細胞（BMSCs）不僅能夠有效抑制炎癥的產(chǎn)生，同時還能促進神經(jīng)軸突以及血管的再生，對于恢復患者的運動神經(jīng)功能具有較好的作用［3］。外泌體具有在體內進行生物信息傳輸?shù)淖饔谩Ｓ醒芯浚?］表明靜脈注射BMSCs對于治療外泌體具有較好的作用，且在各種腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷等治療及后續(xù)修復中具有較好的作用。基于此，本研究將以大鼠模型實驗為基礎，分析BMSCs 來源的外泌體靜脈移植對脊髓損傷的修復作用，以期為我國臨床外泌體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療提供一定的指導。現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年10 月—2014 年3 月河南省洛陽正骨醫(yī)院實驗室試驗的78 例大鼠為研究對象，大鼠體重為175～200 g，由省實驗動物中心提供。應用隨機拋球法將大鼠分為手術組（n=26）、對照組（n=26）、外泌體組（n=26）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗儀器及試劑

本實驗采用脊髓打擊器、倒置顯微鏡、CO2孵育箱、透射電子顯微鏡、光學顯微鏡、L-DMEM 培養(yǎng)基、外泌體提取試劑盒ExoQuick-TCExosomeIsolationReagent、CD9、CD63、LuxolFastBlue髓鞘染色液進行實驗。

1.3 方法

應用脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷模型后，對照組不作處理，手術組在對照組的基礎上實施切開減壓術，而外放體組在對照組的基礎上實施外放體移植，具體措施如下。（1）大鼠BMSCs 分離培養(yǎng)。采用全骨髓貼壁法進行BMSCs 的體外分離和培養(yǎng)，腹腔內應用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）、75%乙醇進行全身消毒。在無菌條件下分開兩個股骨脛骨，剪斷干骺端露出髓腔，將L-DMEM 培養(yǎng)液從骨髓中排出。經(jīng)1 000 r/min 離心5 min 后，將上清液用10%的體積含量的L-DMEM 培養(yǎng)液進行再懸浮，再用1×106/L 的濃度進行接種，在37 ℃、5%CO2的恒溫下培養(yǎng)。24 h 時進行第一次半量換液，其后2 d 進行全劑量換液。采用倒置顯微鏡對BMSCs 進行形態(tài)學觀察，在80%～90%的貼壁細胞中進行融合，0.25%的胰酶將其消化，以1∶2的比例進行傳代。（2）外泌體的分離及觀察。將用不含外泌體的血漿制備的P2 代MSCs 培養(yǎng)24 h。采集培養(yǎng)液，按照ExoQuick 推薦的方法取20 mL 培養(yǎng)液，用3 000 g 的相對離心力（3 000 倍重力加速度）離心15 min，將細胞殘渣除去，用5∶1/5 的上清液加入外泌體萃取液，混合均勻，4 ℃孵化一晚，放入離心機，1 500 g 離心30 min，去上清，底部沉淀即為外泌體。應用透射電鏡觀察并對其進行表征、PBS 重懸及BCA 蛋白含量的檢測。調整之后的濃度控制為200 μg/mL，放置于80 ℃的溫度中保存。保存完成之后放置于室溫中吸附多余的液體進行晾干。在造模24 h 后，取2 只外泌體大鼠經(jīng)4%戊二醛深度麻醉后，取T10脊髓節(jié)段，經(jīng)常規(guī)脫水、浸透等處理，電鏡下觀察外泌物是否已抵達脊髓［5］。（3）外泌體表面標志物鑒定。用20 mL 的細胞培養(yǎng)上清進行體外培養(yǎng)，然后放入300 μL 的溶解液混合冰溶解30 min，再放入4 ℃低溫超高速離心機10 000 r/min 離心5 min，將其上清分裝，用BCA 方法進行蛋白含量測定。提取30 μg總蛋白，將其放入1/4上樣緩沖液中，99 ℃水浴10 min。將30 μL 的樣品分離，再用半干燥方法將其電轉移至PVDF 膜上，37 ℃封閉2 h，CD9 和CD63（1∶1 000 稀釋）4 ℃過夜，用等滲緩沖鹽溶液沖洗薄膜5 min×4次，用辣根過氧化物酶標記的IgG（1∶1 000比例稀釋）37 ℃孵育2 h，PBS沖洗2次，增強化學發(fā)光法測定暗室曝光。

1.4 觀察指標

（1）分別采用BBB 評分、斜板實驗評價構造后1、3、7、14、21、28 d 的后肢功能情況［6］。BBB 評分共22 個等級：0 分為后腿完全麻痹；21 分為功能正常。采用兩位有經(jīng)驗的觀察者雙盲評定，主要觀察關節(jié)的活動，運動負荷和運動幅度，前肢、后肢和尾巴的協(xié)調。斜板實驗：將大鼠放在與平板垂直軸線相垂直的平板上，各測試傾斜板傾斜度每次增大5°，當大鼠在最大角度停留5 s 后，記錄斜板傾斜度為斜板實驗得分。由兩名經(jīng)驗豐富的觀察者對不同時間段的結果進行評分。（2）脊髓組織形態(tài)學觀察［7］：對脊髓損傷后28 d 各組大鼠進行心臟麻醉沖洗實驗，將4%的多聚甲醛注入大鼠心臟，并取出脊髓組織進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等處理。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，蘇木素染色5 min，水洗3次，鹽酸乙醇分色20 s，再用1%伊紅液在水中浸泡5 min；髓鞘（LFB）染色：用Luxol固藍液浸泡一夜，用95%乙醇浸泡3 min，用乙醇浸泡3 min，用0.05%碳酸鋰溶液浸泡15 min，再用70%乙醇進一步分化30 s，直至能清晰地辨別出灰白，觀察各組脊髓組織形態(tài)學改變。采用尼氏（Nissl）染色染色：用1%甲苯胺藍染色法對切片進行10 min 的觀察，然后用常規(guī)的梯度法進行脫水，觀察神經(jīng)元存活數(shù)目。所有指標觀察均取5張計數(shù)平均值進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗后，正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，組間比較行LSD-t檢驗，組內比較行單樣本t檢驗，偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

所有大鼠均在術前1 d、術后1 d 行BBB 評分，術前1 d 評分結果顯示所有大鼠的運動功能均能正常開展實驗，術后1 d評分結果顯示，所有大鼠均未出現(xiàn)異常死亡情況，可常規(guī)開展實驗。

2.1 BMSCs的形態(tài)觀察

在體外培養(yǎng)24 h后，觀察到部分細胞貼壁，細胞的大小和形狀以圓形居多，見圖1。培養(yǎng)4～5 d 后細胞壁的數(shù)量逐漸增多，且呈現(xiàn)出集落的增長趨勢。培養(yǎng)10 d后，細胞開始呈現(xiàn)出融合趨勢，且胰酶消化開始出現(xiàn)傳代，傳至2 代之后，細胞呈現(xiàn)出單一均勻趨勢，與BMSCs 的生長形態(tài)一致，見圖2。

圖1 體外培養(yǎng)24 h后的細胞形態(tài)

圖2 體外培養(yǎng)10 d后的細胞形態(tài)

2.2 三組大鼠的行為學評價情況

所有大鼠術前BBB 評分均為21 分，術后各時間點手術組后肢得分正常，術后1 d 對照組及外泌體組BBB 得分均為0，大鼠下肢功能減退，以臥式拖動方式運動，但隨著時間的增加，大鼠的BBB 評分逐一恢復。術后各時間點手術組大鼠BBB評分高于對照組和外泌體組，術后7、14、21、28 d外泌體組大鼠BBB 評分高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。手術組術后各時間點斜板評分高于對照組及外泌體組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 三組大鼠不同時間點的BBB評分情況（±s）

表1 三組大鼠不同時間點的BBB評分情況（±s）

a 表示與同一時間段手術組比較，P＜0.05；b 表示與同一時間段對照組比較，P＜0.05。

項目術前1 d術后1 d術后3 d術后7 d術后14 d術后21 d術后28 d手術組（n=26）21.00±0 19.80±0.75 20.30±0.67 20.90±0.33 21.00±0 21.00±0 21.00±0對照組（n=26）21.00±0 0±0a 0.90±0.87a 2.50±1.07a 6.90±0.98a 10.50±0.84a 12.50±1.07a外泌體組（n=26）21.00±0 0±0a 1.61±0.85a 6.30±0.94ab 12.70±1.58ab 16.60±1.07ab 17.01±0.68ab

表2 三組大鼠不同時間點的斜板實驗評分情況（±s）

表2 三組大鼠不同時間點的斜板實驗評分情況（±s）

a 表示與同一時間段手術組比較，P＜0.05；b 表示與同一時間段對照組比較，P＜0.05。

項目術前1 d術后1 d術后3 d術后7 d術后14 d術后21 d術后28 d手術組（n=26）80.00±0 75.00±3.32 78.80±2.41 79.00±2.12 80.00±0 80.00±0 80.00±0對照組（n=26）80.00±0 29.00±3.15a 30.00±2.35a 34.00±3.15a 43.00±4.21a 49.00±4.58a 52.50±4.25a外泌體組（n=26）80.00±0 30.00±3.32a 32.50±3.55a 43.00±3.51ab 55.50±4.37ab 62.51±2.65ab 65.00±3.32ab

2.3 脊髓組織形態(tài)學變化

術后28 d，手術組的脊髓組織HE 染色體等均正常，神經(jīng)元數(shù)目減少。術后28 d 脊髓組織HE 染色，見圖3。手術組脊髓組織結構完整，神經(jīng)細胞形態(tài)正常，神經(jīng)纖維排列規(guī)整，細胞基質較均勻，見圖4。對照組損傷區(qū)脊髓組織結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，見圖5。外泌體組損傷區(qū)脊髓組織炎性浸潤較少，組織較連續(xù)、結構較清晰，見圖6。

圖3 術后28 d脊髓組織HE染色

圖4 手術組脊髓組織HE染色

圖5 對照組損傷區(qū)脊髓組織HE染色

圖6 外泌體組損傷區(qū)脊髓組織HE染色體損傷

3 討論

脊髓損傷是當前臨床中較為常見的一種癥狀，嚴重時會出現(xiàn)完全性癱瘓、肢體功能喪失、大小便完全失禁等，增加患者的心理負擔和經(jīng)濟壓力。間充質干細胞（MSCs）是一類多能干細胞，是目前臨床上最常用的一種干細胞，結合造血干細胞移植可以增加移植成功率，加快造血再生［8］。在大劑量的化療后，BMSCs聯(lián)合造血干細胞一起注入，有利于患者的血液細胞恢復，而且副作用小、安全性高。有研究［10］表明，MSCs 相較于其他的細胞能夠分泌出更多的外泌體。

本研究結果顯示，體外培養(yǎng)24 h后，觀察到部分細胞貼壁，細胞的大小和形狀以圓形居多。有研究［11-12］的實驗結果表明，在實驗中使用CD9、CD63 進行陽性的檢驗，最終得出的實驗的提取物為MSCs，與本研究的結果一致。MSCs 外泌體是由MSC 分泌的具有脂質雙層膜結構的納米級細胞外囊泡。Zhang等［13］的研究結果提示，體外培養(yǎng)的骨髓基質細胞能抑制細胞因子、抑制NF-κBp65信號途徑，降低caspase-3、caspase-8、caspase-9 等細胞凋亡，進而抑制細胞凋亡。脊髓損傷后的運動功能恢復一直以來都是臨床重點關注的課題。本研究通過選擇大鼠實驗為研究對象，采用脊髓打擊器的方式對大鼠進行打擊并建構模型，分析術后的運動功能的恢復情況。本研究結果顯示，經(jīng)打擊后，大鼠的各項下肢功能有喪失的情況，且BBB 評分和斜板實驗評分急劇下降，后續(xù)有恢復的情況，但整體的恢復無法達到打擊之前的狀態(tài)。且本研究中對照組及外泌體組的BBB評分低于手術組；外泌體組的BBB評分高于對照組；外泌體組術后各項斜板評分高于對照組，提示外泌體靜脈移植對脊髓損傷具有一定的恢復作用。本研究中術后28 d，手術組的脊髓組織HE 染色體等均正常，神經(jīng)元數(shù)目減少。分析其原因為，通過外泌體靜脈移植BMSCs的外泌體可以通過血腦屏障進入組織損害，并能攜帶生物信息進行修復，而以滴鼻方式移植后6 h，可在大腦皮層、海馬等區(qū)域觀察到外泌體的存在［14］。

綜上所述，BMSC 外泌體靜脈移植對脊髓損傷有明顯的改善作用，可以提高患者的運動能力，減輕脊髓損傷，并能加速脊髓損傷的恢復。