基于蛋白質組學技術對植物乳桿菌YP36細菌素的抑菌機制研究

王 婷，來歡歡，趙 微，3，崔美林，3，張秀紅，3*

（1.山西師范大學 食品科學學院，山西 太原 030032；2.山西師范大學 生命科學學院，山西 太原 030032；3.山西省微生物應用技術工程研究中心，山西 太原 030032）

細菌素是細菌核糖體產生的一類具有抑菌活性的蛋白類或多肽類物質，細菌素能賦予產生菌生存優勢[1-2]。大多數乳酸菌都能產生細菌素[3]，細菌素也是益生菌篩選常用的標準之一，在食品工業中作為生物防腐劑用于食物保鮮[4]。由于大多數乳酸菌產生的細菌素成分及性質不完全相同，其抑菌機制也不盡相同，如有的細菌素與細胞膜結合，在細胞膜上聚集，形成孔洞，破壞細胞膜的完整性，導致胞內物質泄露[5]；有的細菌素的作用位點是細胞壁（它能抑制細胞壁中肽聚糖的生物合成[6]）、革蘭氏陰性細菌外膜，有的細菌素干擾脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白質代謝[7]；有的細菌素對敏感菌的抑菌作用還與其細胞內能量代謝及糖類轉運系統等部分相關蛋白表達有關[8]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YP36是從清香型白酒酒醅中分離的乳酸菌，其細菌素對指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有明顯抑制效果，對清香酒醅中酵母菌無抑制作用，在4～121 ℃范圍內表現出熱穩定性，pH穩定性范圍在2.0～4.0之間，對酒醅正常發酵有重要的作用[9]。

蛋白質組學是以蛋白質為研究對象，高通量系統化解析蛋白質組成、功能及相互作用的科學。蛋白質是生命活動的承擔者，蛋白質組學能夠從蛋白水平上揭示研究對象的生理狀態、病理狀態等過程的作用機制[10]。目前蛋白質組學技術主要應用于細胞、組織和體液中蛋白質表達差異的分析[11]，但是利用該技術研究酒醅來源乳酸菌細菌素作用機制尚未報道。

本研究中采用高效液相色譜-串聯質譜（highperformance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）聯用非標記定量蛋白質組學技術[12]對細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2表達的差異表達蛋白進行鑒定，并采用基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析對差異蛋白進行代謝功能分析，旨在為乳酸菌在白酒釀造過程中作用機制提供新的認識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SL32-2、YP36（產細菌素）：本實驗室保存。

1.1.2 試劑

K2HPO3、KH2PO3：天津科密歐化學試劑有限公司；甘油、溴酚藍、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素（Urea）、Tris、二硫蘇糖醇：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；NH4HCO3、三氟乙酸、EmporeTM固相萃取柱（C18，7 mm/3 mL）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；二辛可寧酸測定（bicinchoninic acid assay，BCA）定量試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；KH2PO4、KCl、HCl：國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

MRS培養基[13]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，酵母粉4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，檸檬酸二銨2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，K2HPO4·7H2O 2 g，吐溫-80 1 mL，1 000 mL。121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

GI80DS型高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；ZHJH-C1112B型雙人超凈工作臺、ZXMP-R1230型恒溫恒濕培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；D-37520型低速冷凍離心機、Q Exactive型質譜、Easy nLC型色譜儀、MP Fastprep-24型勻漿儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AKTA Purifier 100型純化儀、EPS601型電泳儀：通用電氣醫療生物科學有限公司；JY92-II型超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；QT-1型Votex振蕩器：上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與細菌素制備

菌株活化：將甘油保藏的乳酸菌菌株YP36接種于MRS培養基中，于37 ℃靜置培養24 h，待乳酸菌菌株YP36活化3代以后，儲存于4 ℃冰箱內備用。

細菌素的制備：將菌株YP36活化后，以3%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后，12 000 r/min離心10 min，將上清液通過0.22 μm的微孔濾膜過濾，所得濾液為細菌素粗品，保存在4 ℃下備用[14]。

1.3.2 細菌素處理前后發酵液樣品的制備

將活化后的植物乳桿菌SL32-2以2%（V/V）接種量接種于MRS培養基中，37 ℃靜置培養4 h，以該發酵液為對照（CK）。活化后的植物乳桿菌SL32-2以2%（V/V）接種量接種于含有10%細菌素粗品的MRS培養基，37 ℃培養4 h的發酵液為處理組樣品（B）。將對照和處理樣品分別用緩沖液清洗3次后，液氮中處理30 min，于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 蛋白質提取和肽段酶解

樣品采用SDT裂解液（4% SDS、100 mmol/L Tris/HCl pH 7.6、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT））提取蛋白質[15]，然后用二辛可寧酸測定（bicinchoninic acid，BCA）法[16]進行蛋白質定量。每個樣品取適量蛋白質采用過濾器輔助蛋白質組制備（filter aided and proteome preparation，FASP）方法[17]進行胰蛋白酶酶解，采用C18 Cartridge對肽段進行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復溶，肽段定量[18]。

1.3.4 HPLC-MS/MS數據采集及蛋白質定量

采用高效液相色譜（HPLC）法液相系統進行樣品分離。樣品由自動進樣器上樣到上樣柱，經過分析柱分離，流速為300 μL/min。流動相為含0.1%甲酸的水溶液（A液）和含0.1%甲酸的84%乙腈（B液）。用95%A液平衡[19]，上樣柱為nanoViper C18色譜柱（100 μm×2 cm），分析柱為C18-A2 Thermo sclentific EASY柱（75 μm×3 cm）。樣品分離后用Q-Exactive質譜儀進行一級、二級質譜數據采集[20]。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍為300～1 800 m/z，在200 m/z時，一級質譜分辨率為70 000，二級質譜分辨率為175 000[21]。

用MaxQuant 1.6.14軟件通過MS和MS/MS搜索肽段母離子及其理論碎片離子的信號來確認該肽段及相關蛋白是否存在于樣本中，并獲得未知肽段、蛋白及翻譯后修飾信息。采用非標記定量（label free quantification，LFQ）對鑒定蛋白進行相對定量[22]。

1.3.5 生物信息學分析方法

用Pfam數據庫進行蛋白質結構域分析。對目標蛋白質利用基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearchtool，BLAST）2GO進行GO（Gene ontology，http：//geneontology.org/）注釋，包括序列比對、GO條目提取、GO注釋和Inter-ProScan補充注釋等4個步驟；利用KAAS（KEGG automatic annotation server）軟件進行KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）通路注釋；采用Fisher精確檢驗，比較目標蛋白質集合和總體蛋白質集合中各個GO分類（或KEGG通路或Domain）的分布情況，以進行富集分析[23]。

2 結果與分析

2.1 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2鑒定蛋白的分布

采用韋恩圖分析細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2鑒定蛋白分布情況，結果見圖1。由圖1可知，處理前鑒定的蛋白質共有1 999個，處理后鑒定的蛋白質共有2 005個，其中處理前后共有蛋白質為1 905個。

圖1 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2中鑒定蛋白韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of identified protein from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

2.2 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白分析

對細菌素處理后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白分析時，以表達倍數（fold change，FC）＞2.0（上調＞2.0倍或下調＜0.5倍）且P值＜0.05為標準，得到細菌素處理后上調、下調蛋白質數目，同時還做了“有無”差異比較，即分析只在細菌素處理前或處理后出現的蛋白質，結果見圖2。

圖2 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白熱圖Fig. 2 Heat map of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由圖2可知，與細菌素處理前相比，細菌素處理后顯著下調的蛋白質有59個，在細菌素處理后消失的蛋白質有26個；有33個蛋白在細菌素處理后開始表達，顯著上調的蛋白質只有15個，這一結果表明細菌素處理后植物乳桿菌SL32-2下調和消失的蛋白數目較多，菌體整體代謝減弱。

進一步對細菌素處理前后差異表達蛋白種類分析，結果見表1。由表1可知，在細菌素處理前CK中鑒定到的蛋白、細菌素處理后鑒定到的表達上調、下調的蛋白中以及細菌素處理后才鑒定到的蛋白中，占比最大的是酶類，分別占65.38%、40%、72.88%、33.33%，由此可知，細菌素處理后會影響到細菌整體的代謝網絡，而不只是簡單的細菌素成分的作用。其次是轉運蛋白，如能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解產生的能量將結合的氨基酸跨膜轉運的寡肽ABC轉運蛋白[24]等，以及將各種糖及其衍生物進行磷酸化然后運輸到胞內的磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）中的糖轉運蛋白[25]，表明細菌素處理后不僅影響細胞內的物質流，還能影響胞外營養物質到胞內，以及胞內各種功能蛋白的運輸。除此之外還有轉錄調節因子、獨有蛋白和未知蛋白。

表1 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白分類Table 1 Classification of differentially expressed proteins from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

2.3 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白的GO功能分析

為了全面深入了解細菌素處理后差異蛋白在生物體中的功能、定位及參與的生物學途徑，通過GO富集分析對蛋白質的功能分類進行注釋。GO功能注釋主要分為3類：生物過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）。以P值＜0.05為篩選標準，對用細菌素處理前后菌株SL32-2差異表達蛋白的GO功能富集分析表明，顯著性差異表達蛋白所涉及的功能條目共有99條，其中屬于生物過程的有78條，屬于分子功能的有21條，其中BP的前20條和MF的前10條功能條目見圖3。由圖3可知，BP的前20條涉及的功能有核苷、核苷酸生物合成及代謝；糖基化合物合成、酒精、有機羥基化合物、多元醇代謝相關過程，且大多與嘧啶核苷及核苷酸生物合成和代謝相關；MF的前10條涉及的功能大多與糖類利用相關。

圖3 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白基因本體富集分析Fig. 3 Gene Ontology enrichment analysis of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

富集因子為該代謝路徑下差異蛋白數目與所有注釋到該路徑蛋白數目的比值，代表富集到目標路徑的蛋白數占比，值越大表示富集的程度越大。在對植物乳桿菌SL32-2細菌素處理后差異表達蛋白GO分析時發現，5條與細胞壁代謝相關的BP條目：（GO：0016998）細胞壁大分子分解代謝過程、（GO：0006027）糖胺聚糖分解代謝過程、（GO：0009253）肽聚糖分解代謝過程、（GO：0006026）氨基聚糖分解代謝過程及（GO：0008152）代謝過程都顯著性富集到兩個相同的蛋白A0A2S3U5Q5、A0A7X1TC68。這兩個蛋白涉及的MF條目有GO：0004553水解酶活（水解O-糖基化合物）、GO：0016798水解酶活性（作用于糖苷鍵）、GO：0003824催化活性，具體見表2。

表2 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2細胞壁代謝相關蛋白基因本體富集分析Table 2 Gene Ontology enrichment analysis of cell wall metabolism related proteins from Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

A0A2S3U5Q5被鑒定為溶菌酶（putative autolytic lysozyme），是細菌素處理新誘導表達的，可以裂解細胞壁肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵[26]，破壞細胞壁的完整性，達到抑菌目的。A0A7X1TC68糖苷水解酶（glycosyl hydrolase family 25，GH25）則是在細菌素處理后表達上調，它屬于GH25家族蛋白，具有溶菌酶活性。溶菌酶是一種抗菌酶，其本質是一種糖苷水解酶，基于序列相似性的糖基水解酶分類系統已經定義了85個不同的家族[27]，GH25僅包含一種具有已知活性的酶，該酶主要水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間的β-1,4-糖苷鍵。說明細菌素處理使乳酸菌表達更多具有溶菌酶活性的蛋白，降解原有細胞壁，使細胞壁不完整，不能維持正常生長，達到抑菌的目的。

2.4 細菌素處理前后差異表達蛋白質的KEGG代謝通路分析結果

將細菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白進行KEGG富集分析，結果共涉及到53段代謝通路，其中顯著性富集到KEGG途徑的有14條（P＜0.05），其富集分析結果見圖4。

圖4 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白京都基因與基因組百科全書富集分析Fig. 4 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由圖4可知，圖中橫坐標為富集因子，縱坐標表示富集程度排名靠前的代謝路徑。每個點的大小表示富集到該GO條目的蛋白的個數，點越大表示富集到該GO條目的蛋白越多，反之則越少[28]。顏色梯度代表lg（P值）的大小，顏色越接近紅色代表P值越小，對應代謝通路富集度的顯著性水平越高。在富集到的14條途徑中，屬于碳代謝的有6條，即淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、檸檬酸（三羧酸）循環、磷酸肌醇代謝、果糖和甘露糖代謝，以及戊糖和葡糖醛酸的相互轉化；氨基酸代謝有5條，即丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成與降解；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；核苷酸代謝1條，核酸代謝1條，跨膜途徑1條。

細菌素處理后植物乳桿菌SL32-2差異表達蛋白質的6段代謝途徑相關酶表達受到影響，其受影響的碳代謝及嘧啶代謝途徑結果見圖5。

圖5 細菌素處理后植物乳桿菌Sl32-2差異表達蛋白受影響的碳代謝及嘧啶代謝途徑Fig. 5 Carbon metabolism and pyrimidine metabolism pathway affected by differentially expressed protein of Lactobacillus plantarum SL32-2 after bacteriocin treatment

由圖5可知，影響最顯著的是碳源吸收階段的淀粉和蔗糖代謝，如淀粉降解需要的α-淀粉酶[EC 3.2.1.1]、麥芽糖磷酸化酶[EC 2.4.1.8]；蔗糖降解需要的蔗糖酶[EC 3.2.1.20]；以及胞外纖維二糖降解需要的纖維二糖Npi-磷酸轉移酶[EC 2.7.1.205]和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶[EC 3.2.1.86]，另外還有一些糖苷酶，如糖苷水解酶家族65蛋白（A0A166KUN4，A0A0G9FBU3）、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（F9URP6，A0A0 R2GBH8、A0A151G2V8），β-葡萄糖苷酶（A0A162GFY1）細菌素處理后這些酶表達全部下調，最終導致D-葡萄糖的生成減少。碳源吸收階段滲透IIC成分（F9UU22）；磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）糖轉運蛋白（T5JR35）顯著性下調，導致進入細胞的葡萄糖減少。還有β-磷酸葡萄糖變位酶（F9US84）下調，β-磷酸葡萄糖變位酶可將葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸是二磷酸尿苷（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖的前體，而UDP-葡萄糖是多種代謝途徑的糖基供體，如細胞壁等。β-磷酸葡萄糖變位酶的下調可能影響細胞形態，抑制細菌生長[29]。

糖酵解/糖異生是糖的分解代謝/合成代謝重要階段，共檢測到9個顯著差異蛋白，其中8個均顯著下調，只有1個顯著上調。8個下調蛋白中，有1個是從纖維二糖得到葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，3個是將磷酸二糖釋放葡萄糖的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（F9URP6，A0A0R2GBH8、A0A151G2V8）；還有4個是不同底物脫氫酶或脫氫酶的組分。糖酵解是產能較少的生物氧化過程，脫氫酶或組分表達下調使糖酵解產生更少的能量，能顯著降低碳源代謝，反過來也會影響糖的異生。該階段唯一上調的是醛醇脫氫酶。細菌中有醇醛脫氫酶能使乙醇和乙醛脫氫，是一種雙功能酶，而且是乙醇厭氧發酵中的關鍵酶[30]。

三羧酸階段，糖酵解產物丙酮酸繼續代謝的關鍵酶，如丙酮酸脫氫酶E1成分[EC 1.2.4.1]、丙酮酸脫氫酶E2成分（二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶）[EC 2.3.1.12]和二氫硫辛酰胺脫氫酶[EC 1.8.1.4]表達也下調，導致進入三羧酸循環的乙酰輔酶A的量減少，最終減少能量供應。α-酮戊二酸脫氫酶-α-亞基的下調削弱了三羧酸循環中的不可逆的限速反應，使整個三羧酸循環代謝下調。關于其他單糖，如果糖和甘露糖代謝也受到影響，如甘露糖-6-磷酸異構酶[EC 5.3.1.8]在細菌素處理后不再表達，導致β-D-果糖-6磷酸的生成量減少；L-艾杜糖醇脫氫酶可將L-山梨糖醇氧化為L-果糖，該酶的下調也可導致L-果糖的減少；甘露醇也是細菌生長的碳源，轉移因子亞基、甘露醇-1-磷酸5-脫氫酶也都下調，導致甘露醇濃度下降。

差異蛋白中數量最多的是輔因子，輔因子是能與酶蛋白結合并能影響其活力的非蛋白成分，因而可影響細菌細胞中很多酶反應（見表3）。

表3 細菌素處理前后植物乳桿菌SL32-2表達的參與輔因子生物合成途徑的顯著差異蛋白Table 3 Significantly difference proteins involved in cofactor biosynthesis pathway expressed by Lactobacillus plantarum SL32-2 before and after bacteriocin treatment

由表3可知，細菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2高達14個輔因子受到影響，11個顯著下調，1個不再表達，有2個表達上調。11個顯著下調輔因子中有9個參與嘧啶代謝，嘧啶是合成細胞壁肽聚糖重要的載體，嘧啶下調直接影響細胞壁的合成，結合GO富集分析中細菌素處理后有溶菌酶上調，還有新的溶菌酶分子合成，共同有效抑制了細胞的生長。下調的輔因子中有5個參與氨基酸代謝，且全部是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，有效減弱了氨基酸之間的轉換以及通過氨基酸途徑再次抑制嘧啶代謝。二氫脂酰脫氫酶[EC 1.8.1.4]的下調則影響了細胞內非常廣泛的代謝反應，如丙酮酸代謝，多種（賴氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸）氨基酸代謝、乙醛酸和二羧酸的代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸循環、部分氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）降解等。

細菌素處理后，植物乳桿菌SL32-2雖然只有一條核酸代謝受影響，但是受影響蛋白數量較多，主要分布在嘧啶代謝的單磷酸尿苷（uridine monophosphate，UMP）合成途徑中，如以丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸為原料合成N-氨基甲酰-L-天冬氨酸途徑中的EC 6.3.5.5（氨甲酰磷酸合酶）和EC 2.1.3.2（天冬氨酸氨甲酰轉移酶），以及以L-天冬氨酸為原料合成UMP途徑中的EC 2.1.3.2（天冬氨酸氨甲酰轉移酶）、EC 3.5.2.3（二氫乳清酸酶）、EC 1.3.1.14（二氫乳清酸脫氫酶（NAD+）、EC 2.4.2.10（乳清酸磷酸核糖轉移酶）和EC 4.1.1.23（5'-磷酸-乳清酸核苷脫羧酶）全部表達下調，使UMP的生成減少，進而能有效影響UDP和細胞壁的合成。

3 結論

本研究利用蛋白質組學技術分析細菌素作用植物乳桿菌SL32-2后抑菌生長的機制表明，細菌素處理后植物乳桿菌SL32-2發酵液顯著上調和下調的蛋白質分別有15個和59個，另外有26個蛋白消失，33個蛋白誘導表達；在上調、下調以及消失和誘導表達蛋白中，數量最多的都是酶類，其次是轉運蛋白。GO功能富集分析表明，顯著性差異表達蛋白的功能條目共99條，主要集中在肽聚糖分解代謝和細胞壁大分子分解代謝、碳水化合物代謝以及嘧啶核苷酸代謝和生物合成等方面。其中，細菌素處理后上調表達的溶菌酶A0A7X1TC68和誘導表達的溶菌酶A0A2S3U5Q5參與了5個BP和3個BF條目，可協同作用降解細菌細胞壁中的肽聚糖，使細胞失去完整性而裂解；KEGG富集分析表明，差異蛋白共涉及淀粉和蔗糖代謝途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、輔因子生物合成途徑和嘧啶代謝途徑等53條通路，使細胞最主要的營養要素碳源的吸收降解及代謝途徑中的關鍵酶表達下調，降低細胞的能量供應等，細胞壁主要成分肽聚糖生物合成中的重要載體UDP前體物質UMP合成途徑中的關鍵酶表達下調，抑制細胞壁的合成。