黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖發酵條件優化及其抗氧化活性研究

龍丹丹，葉淑紅，燕欣悅，王琛郴，崔艷平，張 彧*

（大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

微生物多糖是細菌[1]、真菌[2]、酵母菌等微生物在生長和代謝過程中產生的多糖聚合物，也稱內生菌多糖，對自身具有保護作用。內生菌多糖根據在細胞內的位置，可分為胞內多糖、胞壁多糖[3]和胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）。其中，內生菌胞外多糖[4]是在生長代謝過程中分泌到細胞壁[5]外常滲于培養基的一類糖類化合物。與胞內多糖相比，胞外多糖在組成和結構上有很大差異，并且具有不同的功能特性。因此內生菌胞外多糖產量的提高和功能的探索讓其具有較高的研究價值和工業應用前景。

近年來，花椒被公認為是研究生物活性化合物的很有吸引力的材料，包括酰胺、揮發油、生物堿和多糖類化合物[6]。尤其多糖類化合物顯示出顯著的藥理活性。多糖具有提高免疫力、抗病毒及抗癌、降血糖[7]等重要作用。因此它引起了營養學、醫學、食品科學等領域研究人員的關注。基于某些內生菌能產生和其共生植物相同或相似生理活性物質的特點，近年來對藥用植物內生菌的研究十分活躍。利用內生菌，實現花椒多糖的微生物發酵體外培養，則可使花椒多糖的工業化生產不受植物資源的限制，并可防止花椒資源的日益短缺[8]。

生物體在新陳代謝過程中會產生自由基[9]。國內外關于微生物胞外多糖的抗氧化性能的報道較多。HU X等[10]研究發現，內生真菌Talaromyces purpureogenus的胞外多糖具有良好抗氧化性；蔣光陽等[11]研究發現，乳酸菌胞外多糖對1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基和羥自由基均具有一定的清除能力；王艷等[12]從發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）TG4-1-1分離的EPS具有作為天然抗氧化劑或功能性食品添加劑的巨大潛力。目前，胞外多糖的研究大多集中在乳酸菌[13]上，但其產糖量相對較低，極大地限制了其應用和發展[14]。假單胞菌是自然界廣泛存在的微生物菌群，黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）是第四類病原微生物[15]，通常不會引起人類或動物疾病的微生物。此外研究表明，大多數假單胞菌都能夠產生胞外多糖，但目前有關于黃褐假單胞菌產EPS的研究較少。

前期試驗基于對從花椒葉中自主分離、篩選和鑒定的一株菌株黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）Y11的研究發現，該菌株能夠產生胞外多糖，本研究探究了該菌的最佳產胞外多糖條件以及胞外多糖的抗氧化性能，旨在為胞外多糖的工業化生產、以及花椒內生菌代謝物的進一步開發及利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黃褐假單胞菌（Pseudomonas fulva）Y11：由大連工業大學東山采摘的花椒葉中經自主篩選得到的內生菌株。

1.1.2 試劑

果糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；木糖（分析純）：上海伊卡生物技術有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

發酵液體培養基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO41 g/L，MnSO40.5 g/L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。固體培養基加入瓊脂20 g。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；SHP-150型生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；島津UV-2600紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；ZHWY-211B型恒溫冷凍搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵液的制備

從固體培養基中挑取菌株Y11，接種至發酵液體培養基中，28 ℃、160 r/min培養48 h，作為種子液。并將種子液OD600nm值調至1.00±0.05后以4%（V/V）的接種量接種到裝液量100 mL/250 mL的發酵液體培養基中，在28 ℃、160 r/min條件下發酵72 h。

1.3.2 多糖含量的測定

多糖含量在李慧穎[16]報道的苯酚硫酸法基礎上進行一定修改后測定。稱取無水葡萄糖粉末10 mg，去離子水稀釋定容至10 mL，即為1 mg/mL。使用去離子水將葡萄糖標準溶液稀釋為0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL。取上述不同質量濃度的葡萄糖標準溶液各1 mL，分別加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL濃硫酸，搖勻靜置30 min，于波長490 nm處測定吸光度值，以葡萄糖標準溶液質量濃度為x軸，吸光度值為y軸，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=2.11x+0.002 3，R2=0.999 5。根據標準曲線方程計算樣品中的多糖含量。

1.3.3 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及其產胞外多糖曲線繪制

按照1.3.1的方法制備黃褐假單胞菌Y11種子液，向發酵液培養基中注入4%接種量的種子液，28 ℃、160 r/min條件下培養，每隔4 h測定OD600nm值，以去離子水為空白對照。以發酵時間為橫坐標，以OD600nm值為縱坐標繪制菌株生長曲線。黃褐假單胞菌Y11胞外多糖產量按照1.3.2每隔24 h進行測定。以發酵時間為橫坐標，胞外多糖產量為縱坐標，繪制該菌株的胞外多糖產量曲線。

1.3.4 單因素試驗

根據1.1.3發酵液體培養基及1.3.1發酵液制備為基礎條件，改變單一變量，分別考察碳源（葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖）和碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、氮源（大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、硫酸銨、酵母抽提物）及氮源添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、無機鹽（磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀）及無機鹽添加量（2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、轉速（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）、發酵溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對黃褐假單胞菌Y11胞外多糖產量的影響。

1.3.5 Plackett-Burman設計

采用Placket-Burman（PB）試驗設計檢驗篩選顯著影響因素。在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 13軟件，考察不同碳源添加量、氮源添加量、無機鹽添加量、pH、發酵時間、發酵速度、發酵溫度、接種量8個因素對胞外多糖產量的影響，PB試驗因素及水平見表1。

表1 黃褐假單胞菌產胞外多糖發酵條件優化Placket-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Placket-Burman experiments for fermentation conditions optimization of extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae

1.3.6 最陡爬坡試驗

根據Placket-Burman試驗結果，選擇對胞外多糖產量具有顯著性影響的因素，利用最陡爬坡試驗確定響應面試驗中心點。

1.3.7 胞外多糖發酵條件優化響應面試驗設計

在Plackett-Burman設計的基礎上，采用Design-Expert 13軟件進行響應面設計，根據3個顯著因素：麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C）設計3因素3水平的測試組合，以研究因素變化對胞外多糖產量的影響，Box-Behnken試驗因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.8 胞外多糖抗氧化性評價

（1）DPPH自由基清除率測定

參照WANG Q F等[17]的試驗方法稍作修改。將2 mL DPPH-乙醇溶液（4×10-3mol/L）與2 mL測試的胞外多糖或不同質量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的抗壞血酸在試管中混合。將混合物避光反應30 min，在波長517 nm處測量混合物的吸光度值。按公式（1）中計算DPPH自由基清除率。

（2）ABTS自由基清除率測定

參照WANG W N等[18]的試驗方法稍作修改。將等體積的7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8混合并在黑暗中放置12 h。將混合物用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。將不同質量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的樣品（0.2 mL）加入0.8 mL ABTS溶液中，37 ℃避光振蕩15 min，在波長734 nm處測量吸光度值。按式（2）計算ABTS自由基清除率。

（3）羥自由基自由基清除率測定

參照HAO L M等[19]的試驗方法稍作修改。首先將1 mL不同質量濃度（0、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5 mg/mL）的胞外多糖或抗壞血酸加入10 mL試管中，然后加入1 mL FeSO4（9×10-3mol/L）轉移至溶液中混勻；之后加入1 mL H2O2（8.8×10-3mol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（9×10-3mol/L）并充分混合。然后將混合物置于37 ℃水浴1 h。以蒸餾水為空白，在波長510 nm處測量混合物的吸光度值。按式（3）計算羥自由基清除率。

（4）超氧陰離子自由基清除率測定

參照文獻[20]的方法取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）5 mL，置于25 ℃水浴中預熱20 min，加入4 mL不同質量濃度（0、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL）的胞外多糖，于25 ℃水浴中預熱20 min，然后在25 ℃水浴中加入3 mmol/L預熱20 min的鄰苯三酚溶液1 mL，混勻，在25 ℃水浴中準確反應5 min，加10 mol/L HCl 1 mL終止反應，測定波長320 nm處的吸光度值，空白對照組用等體積蒸餾水代替樣品。每個樣品做3個平行樣品，取平均值。按式（4）計算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.9 數據統計分析

所有試驗設置3個平行，根據試驗數據得到結果以“平均值±標準差”來表示。采用SPSS26.0軟件進行差異顯著性分析，采用Origin 2021軟件進行繪圖，Plackett-Burman設計與響應面試驗采用Design Expert 13軟件進行設計和分析[21]。

2 結果與分析

2.1 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及其產胞外多糖曲線

黃褐假單胞菌Y11生長曲線及產胞外多糖曲線見圖1。

圖1 黃褐假單胞菌Y11生長曲線及產胞外多糖曲線Fig. 1 Growth curve and extracellular polysaccharide production curve of Pseudomonas flavus Y11

由圖1可知，黃褐假單胞菌Y11的生長和產EPS是同步的，屬于同步合成型，也叫生長偶聯型。在前36 h菌株繁殖迅速，曲線呈快速增長，為對數生長期；在36 h時OD600nm值基本達到最高點，36 h時后菌株穩定繁殖，進入穩定期。所以在活化菌株時，搖床培養36 h為最佳時間。EPS產量在發酵72 h時達到最大值（1.23 g/L），之后由于菌株進入衰亡期，EPS產量下降。因此應通過優化發酵條件，補充營養底物，促進細菌生長，以產生更多的胞外多糖[22]。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 碳源對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

考察不同碳源種類及最佳碳源添加量對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響，結果見圖2。

圖2 碳源種類（A）及麥芽糖添加量（B）對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 2 Effect of carbon source types (A) and maltose addition (B)on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖2A可知，根據所選取的六種碳源對黃褐假單胞菌Y11產糖能力的影響來看，當麥芽糖作為碳源時，黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖能力最強，為2.05 g/L，產胞外多糖能力顯著高于其他碳源（P＜0.05），因此最佳碳源為麥芽糖。由圖2B可知，胞外多糖產量隨麥芽糖添加量的增加呈現先升高后降低的趨勢，當麥芽糖添加量為40 g/L時，EPS產量最高，為3.16 g/L；這可能是因為當培養基中麥芽糖添加量低于40g/L時，培養基中的碳源含量不足以滿足黃褐假單胞菌Y11的生長代謝需要[23]，導致產生的EPS被新陳代謝消耗掉；在添加量＞40 g/L時，胞外多糖含量降低，這可能是由于培養基中麥芽糖含量過多，導致菌體內外滲透壓失衡，其生長受到抑制，從而影響細胞外多糖的合成，故麥芽糖最佳添加量為40g/L。

2.2.2 氮源對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

氮同樣是生物和EPS生產的主要營養素[24]，不同氮源種類及最佳氮源添加量對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響見圖3。

圖3 氮源種類（A）及大豆蛋白胨添加量（B）對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source types (A) and soy peptone addition(B) on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖3A可知，不同氮源對黃褐假單胞菌Y11產EPS含量的影響存在顯著差異（P＜0.05）。與無機氮源相比，有機氮源明顯優于無機氮源。當大豆蛋白胨作為氮源時，更顯著有利于黃褐假單胞菌Y11產生胞外多糖（P＜0.05），EPS產量最高為3.11 g/L。由圖3B可知，胞外多糖產量隨著大豆蛋白胨質量濃度的增加先顯著升高后降低（P＜0.05），這是因為當氮源含量過多，細菌沒有充足能量合成代謝產物。當大豆蛋白胨質量濃度為10 g/L時，EPS產量最高，為3.31 g/L，故最佳大豆蛋白胨添加量為10 g/L。

2.2.3 無機鹽對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

不同無機鹽及最佳無機鹽添加量對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響見圖4。

圖4 無機鹽離子種類（A）及磷酸二氫鈉添加量（B）對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 4 Effect of inorganic salt ion species (A) and sodium dihydrogen phosphate addition (B) on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

由圖4A可知，這幾種無機鹽離子的添加對黃褐假單胞菌Y11產EPS含量均具有一定的促進作用。當無機鹽離子為磷酸二氫鈉時，黃褐假單胞菌Y11的EPS產量最高，為4.19 g/L。因此，選用磷酸二氫鈉作為培養基中無機鹽類。由圖4B可知，胞外多糖產量隨著磷酸二氫鈉質量濃度的增加先顯著升高后降低的趨勢（P＜0.05），當磷酸二氫鈉的添加量為8 g/L時，黃褐假單胞菌Y11EPS產量最高，為4.16g/L。這表明EPS的產生可能與磷酸鹽的添加有關，磷酸鹽是EPS分泌的重要刺激物[25]，有利于EPS的產生。因此最佳無機鹽及添加量為8 g/L磷酸二氫鈉。

2.2.4 初始pH對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

不同初始pH對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響見圖5。由圖5可知，胞外多糖產量隨著初始pH的增加先升高后降低，由此說明菌株只有在適宜pH條件下才能正常生長代謝，酶活性良好，對多糖產物的合成才能發揮最大作用。因此，EPS生產的最佳培養初始pH為7.0，此時獲得了最高的EPS產量，為4.19 g/L。

圖5 初始pH對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 5 Effect of initial pH on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

2.2.5 發酵時間對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

不同發酵時間對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響見圖6。由圖6可知，EPS產量從發酵1～3 d呈快速生長趨勢，從3～5 d略有下降。發酵3 d時，EPS產量達到最高水平，為4.21g/L。3 d后，細菌菌株進入衰亡階段，因此生物量下降[26]。故最佳發酵時間為3 d。

圖6 發酵時間對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 6 Effect of fermentation time on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

2.2.6 轉速對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

轉速對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響見圖7。

圖7 轉速對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 7 Effect of rotational speed on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas flavus Y11

一般來說，搖瓶發酵時，轉速越高，溶氧越多，越適合菌種培養和發酵。但研究表明，速度高時溶解氧不一定高。由圖7可知，在轉速120～160 r/min范圍內，轉速越高，EPS產量越大；轉速為160 r/min時，黃褐假單胞菌Y11的EPS產量最高，為4.23 g/L；轉速為160～200 r/min時開始下降，這與文獻[27]的研究結果一致，故最佳搖床轉速為160 r/min。

2.2.7 發酵溫度對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

不同發酵溫度對黃褐假單胞菌Y11EPS產量的影響見圖8。由圖8可知，在20～36 ℃的發酵溫度范圍內菌株EPS產量先升高后降低，在28 ℃時，EPS產量最高為4.26 g/L。溫度過高或過低影響菌株內酶促反應速率的變化，都不利于EPS的生產，故最佳發酵溫度為28 ℃。

圖8 發酵溫度對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 8 Effect of fermentation temperature on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae Y11

2.2.8 接種量對黃褐假單胞菌Y11產EPS的影響

接種量的多少會影響微生物發酵產物的合成，不同接種量對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響結果見圖9。由圖9可知，相同發酵時間下，隨著接種量的增加，黃褐假單胞菌Y11的EPS產量先升高后降低，且接種量為4%時EPS產量最高，為4.27 g/L，接種量超過4%后開始下降，可能是因為接種量過多引起細菌之間的競爭，影響了EPS的合成和積累[28]。故最佳接種量為4%。

圖9 接種量對黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖的影響Fig. 9 Effect of inoculum on extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae Y11

2.3 Plackett-Burman設計試驗結果及分析

在單因素試驗的基礎上，設計Plackett-Burman試驗，結果見表3，方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3和表4可知，模型變異系數（coefficient of variation，CV）=6.23%＜10%，R2（0.987 5）與調整后的R2adj（0.954 3）之差＜0.1，表明該模型具有較強的優化信號和適用性較好[29]。模型P=0.008 9＜0.05，說明回歸模型具有統計學意義，模型擬合良好。經方差分析得出的多元回歸方程為：Y=2.98+0.6275A+0.390 8B+0.329 2C+0.139 2D+0.077 5E-0.030 8F+0.009 2G+0.040 8H

由表3可知，第4組可獲得最高的胞外多糖產量，為4.27 g/L。其中，麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C），這三種因素對EPS產量有顯著影響（P＜0.05），因此選擇這三個因素進行最陡爬坡試驗，其他因素保持在單因素法測定的最佳水平進行后續試驗。

2.4 最陡爬坡試驗

為了逼近麥芽糖添加量（A）、大豆蛋白胨添加量（B）、磷酸二氫鈉添加量（C）的響應中心點，根據Plackett-Burman試驗結果，采用Design-Expert 13設計最陡爬坡試驗，試驗設計及結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the streepest climbing tests

由表5可知，在試驗號2的培養條件下，胞外多糖產量最高，可達4.25 g/L。因此選擇麥芽糖40 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、磷酸二氫鈉8 g/L作為響應面試驗的中心點。

2.5 Box-Behnken設計試驗結果及分析

在單因素法和Plackett-Burman設計的基礎上，以麥芽糖（A）、大豆蛋白胨（B）和磷酸二氫鈉（C）添加量為考察因素，以胞外多糖產量（Y）為評價指標進行Box-Behnken試驗，優化3個變量的最佳添加量及其交互作用，結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 黃褐假單胞菌產胞外多糖培養條件優化響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results of response surface experiments for culture conditions optimization of extracellular polysaccharide production by Pseudomonas syringae

表7 響應面試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface test results

采用Design-Expert 13軟件對表6試驗結果進行多元回歸擬合分析，結果表明，EPS產量的預測產量Y可由以下二階多項式方程求得：Y=4.44+1.01A+0.267 5B+0.155 0C+0.177 5AB+0.042 5AC-0.057 5BC-1.14A2-0.741 3B2-0.341 2C2

由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），這表明模型方程足以預測任意變量組合的EPS產量。模型的決定系數R2為0.988 1，表明98.81%的響應變異性可以被模型解釋。此外，預測值與實際值之間的高度相似性也反映了響應面試驗的準確性和適用性，可用于獲得優化的最大EPS產量。由表6可知，一次項A、B、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

2.6 最佳工藝驗證

通過對響應面試驗結果進行分析，得到最佳發酵工藝為麥芽糖添加量44.15 g/L、大豆蛋白胨濃度11.32 g/L、磷酸二氫鈉7.80 g/L。結合Plackett-Burman聯合BBD-RSM進行的優化試驗，并根據實際操作可行性，得到最佳條件為麥芽糖44 g/L、大豆蛋白胨11g/L、磷酸二氫鈉8 g/L、接種量4%、轉速160 r/min、發酵溫度28 ℃、發酵時間72 h、初始pH 7，此時胞外多糖的產量最高為4.68 g/L，以上述條件進行了3次驗證試驗。結果發現該條件下胞外多糖的實際值為（4.56±0.13）g/L，接近于預測值4.68 g/L。因此，通過Plackett-Burman設計與BBD響應面方法相結合優化黃褐假單胞菌合成胞外多糖的發酵條件是可靠且實用的。

2.7 黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖抗氧化性評價

不同質量濃度的胞外多糖對4種自由基的清除活性見圖10。由圖10可知，在一定濃度范圍內，EPS對DPPH、ABTS、OH、超氧陰離子自由基清除活性表現出濃度依賴性，但均低于維生素C（vitamin C，VC）。當質量濃度為2.5 mg/mL時，EPS的自由基清除率可達到最大值，EPS對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力分別為（70.83±1.80）%、（45.00±1.73）%、（65.83±1.80）%和（44.6±2.11）%，這表明EPS具有較好的自由基清除活性。

圖10 不同質量濃度EPS對DPPH（A）、ABTS（B）、OH（C）及超氧陰離子（D）自由基清除率的影響Fig. 10 Effect of different mass concentrations of EPS on free radical scavenging rate of DPPH (A), ABTS (B), OH (C) and superoxide anion (D)

3 結論

本研究通過單因素試驗、Plackett-Burman設計聯合Box-Behnken響應面設計，優化了黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖條件，并研究了其胞外多糖的抗氧化性。結果表明，黃褐假單胞菌Y11產胞外多糖最佳發酵工藝為麥芽糖添加量44 g/L、大豆蛋白胨添加量11 g/L、磷酸二氫鈉添加量8 g/L、接種量4%、轉速160 r/min、發酵溫度28 ℃、發酵時間72 h、初始pH 7.0，此時胞外多糖的產量最高為4.56 g/L，是優化前的3.7倍。抗氧化性研究結果表明，EPS具有一定的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除活性，對于測定的體外活性強弱表現為VC＞EPS。本研究為黃褐假單胞菌EPS的工業化生產提供了一定的參考，對胞外多糖的體外抗氧化活性提供了理論依據。