釀酒酵母細胞cdc50基因敲除及其轉錄組測序分析

李鑫玉，唐秀琴，李子航，劉 佳，王 琦，鄒 偉*

（1.昆明醫科大學 公共衛生學院，云南 昆明 650500；2.昆明醫科大學 基礎醫學院，云南 昆明 650500）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細胞真核微生物，常用于制作面包、啤酒、白酒、葡萄酒等產品。釀酒酵母已完成全基因組測序、轉錄組分析和蛋白相互作用網絡圖的繪制，為基因組遺傳和進化等各個方面提供了豐富的信息[1]。釀酒酵母細胞生命周期短，繁殖較快，易于培養，且大部分基因表達調控和信號轉導機制與高等動植物具有高度同源性，也存在很多與哺乳動物細胞相似的保守生化機制[2]。

Cdc50p屬于TMEM家族，是一種保守的完整跨膜蛋白，主要定位于晚期內體或前空泡腔室[3]。TMEM家族蛋白屬于整合膜蛋白中的一種，是一類至少含有一段完全通過生物膜或部分通過生物膜的跨膜段蛋白質[4]。Cdc50p作為P4-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）酶的β亞基，確保了P4-ATP酶從內質網輸出并正確定位[5-6]。此外，Cdc50p還參與磷脂易位、內吞作用和其他細胞過程[7-8]。Cdc50的同源基因也存在于其他物種中，在人類中發現了tmem30a和tmem30b兩個同源基因，tmem30a是與p4-ATP酶相互作用的主要β亞基，tmem30a的缺失會導致骨骼肌再生障礙[9]，內皮細胞增殖減少和視網膜血管發育受損[10]。目前已知cdc50基因對于P4-ATP酶發揮正常生理功能十分重要，其人類同源基因tmem30a也參與多種細胞的生長發育調控。Cdc50基因同屬于TMEM家族，該家族部分基因與癌癥發生發展有關[11-12]，但cdc50是否參與了某些癌細胞的發生發展尚不可知。

轉錄組學是從整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及其轉錄調控規律[13]，基于高通量測序技術的轉錄組測序是通過對組織中的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）[包括信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）和非編碼RNA]進行測序，全面快速地檢測特定環境和時間條件下的微生物基因表達信息，目前已普遍應用于轉錄組學相關研究工作[14-15]。本研究以PYM14質粒為模板，采用一步聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法擴增cdc50同源重組雙交換片段，醋酸鋰（lithium acetate，LiAc）轉化法敲除cdc50基因，測定cdc50基因敲除對細胞生長的影響，基于Illumina NovaSeq 6000高通量測序平臺對野生型酵母BY4742菌株和Δcdc50突變菌株進行轉錄組分析，篩選二者差異表達基因（differentially expressed gens，DEGs），并對其進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopediaofgenes and genomes，KEGG）通路富集分析，以期揭示Δcdc50突變菌株基因表達譜和信號通路變化，為進一步揭示cdc50基因的分子調控機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與引物

野生型釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4742、質粒PYM14[帶有遺傳霉素418（geneticin 418，G418）的KanMX篩選標記，在大腸桿菌中具有氨芐青霉素（ampicillin，Amp）抗性]：云南生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。

根據酵母基因組數據庫（Saccharomyces genomedatabase，SGD）的cdc50基因（S000000690）和PYM14的質粒序列設計基因敲除引物、敲除驗證引物和實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-fqPCR）引物，引物由擎科生物有限公司合成，見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

1.1.2 化學試劑

膠回收試劑盒、PCR混合酶：北京聚合美生物科技有限公司；瓊脂糖：賽國生物科技有限公司；G418：北京蘭杰柯科技有限公司；核糖核酸（RNA）提取試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）合成試劑盒：北京天根生物科技公司；鮭魚精脫氧核糖核酸（salmon sperm DNA，SS-DNA）、聚乙二醇3350（polyethylene glycol 3350，PEG3350）、醋酸鋰：北京索萊寶科技有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[16]：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物溶解于去離子水中。YPD固體培養基：在液體YPD基礎上加入1.5%瓊脂糖，121 ℃高壓滅菌15 min。

含G418的YPD培養基：每150 mL YPD培養基加入質量濃度為100 mg/mL的G418母液450 μL，終質量濃度為300 μg/mL，用于酵母轉化子的篩選。

1.2 儀器與設備

Allegra X-30低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾特公司；BiOmetra PCR擴增儀器：德國耶拿公司；SPX-70B恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TS-100B恒溫搖床：上海天呈實驗儀器制造有限公司；UV-15紫外燈切膠儀：北京蘭杰柯科技有限公司；DZKW水浴鍋：上海東星建材試驗設備有限公司；MQX200酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；Light Cycler96實時熒光定量PCR儀：美國Life Technologies公司；Ts2R-FL顯微鏡：日本NIKON公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母cdc50基因敲除

以質粒PYM14為模板，Cdc50-UP、Cdc50-DOWN為引物進行PCR擴增，獲得cdc50基因敲除組件[17]。PCR擴增體系和條件按照PCR混合酶說明書進行，擴增完成后取10 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測成功后進行膠回收。采用醋酸鋰轉化法[18]將敲除組件轉化到釀酒酵母BY4742中，取轉化后的菌液200 μL涂布于含300 μg/mL G418的YPD抗性平板上，30 ℃培養3～4 d觀察是否有轉化子。

1.3.2 提取轉化子基因組驗證

挑取在抗性平板上生長出來的轉化子接種于含300 μg/mL的G418的YPD液體培養基中180 r/min、30 ℃培養24 h，按照酵母基因組提取試劑盒提取轉化子基因組后采用驗證引物1-UP、1-DOWN和2-UP、2-DOWN按照PCR混合酶說明書體系進行擴增，采用瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.3.3 實時熒光定量PCR驗證

將野生型釀酒酵母BY4742和陽性轉化子分別在YPD液體培養基和含300 μg/mL的G418的YPD液體培養基中180 r/min、30 ℃培養24 h，根據RNA提取試劑盒提取酵母RNA，使用紫外可見微量分光光度計于波長260 nm處對所提取的RNA吸光度值進行檢測，之后根據反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，參照qPCR試劑盒說明書要求進行擴增，每組樣本設3個復孔，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參對照，采用2-ΔΔCt法[19]計算各基因轉錄水平差異。

1.3.4 細胞形態和生長情況

挑取適量對數期突變菌株Δcdc50和野生型釀酒酵母BY4742細胞，接種到對應的YPD液體培養基中，保證初始樣本OD600nm值相同，置于搖床中180 r/min、30 ℃培養，每隔2 h取適量培養液測其OD600nm值，繪制生長曲線，24 h后取少量菌株BY4742和Δcdc50細胞菌液于載玻片上在顯微鏡下觀察其形態。以菌株BY4742培養24 h后測定的OD600nm值為對照[20]，按以下公式計算基因敲除組酵母細胞相對生長率：

1.3.5 轉錄組測序及分析

取釀酒酵母BY4742和Δcdc50菌株于5 mL YPD液體培養基中180 r/min、30 ℃培養24 h，12 000 r/min離心1 min收集沉淀，用雙蒸水洗滌2次，提取酵母細胞的總RNA后將樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司，采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行文庫構建和轉錄組測序工作。測序片段被高通量測序儀測得的圖像數據經CASAVA堿基識別轉化為序列數據，為保證數據分析的質量及可靠性，需要對原始數據（raw data）進行過濾，同時對純凈數據（Clean Data）進行Q20、Q30和GC含量計算，后續所有分析均是基于純凈數據進行的高質量分析[21]。使用DESeq2軟件進行基因差異表達分析，同時結合進行多重假設檢驗校正后的P＜0.05和|log2Fold Change|≥1篩選差異表達基因。通過Cluster Profiler軟件實現差異表達基因GO富集分析和KEGG通路富集分析，從而獲得差異表達基因顯著相關的生物學功能和代謝通路[22]。

1.3.6 數據分析

組間采用t檢驗分析差異性，應用Graphpad prism9進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 cdc50基因敲除及驗證

Cdc50基因敲除組件的PCR擴增產物的電泳圖見圖1A。由圖1A可知，得到1.7 kb的雙交換同源重組片段，該片段包含cdc50基因上游48 bp同源序列、質粒片段和cdc50基因下游48 bp同源序列，膠回收該片段可見片段濃度高，可用于后續的cdc50基因敲除實驗。雙交換片段具有KanMX篩選標記編碼序列，可在G418平板上進行陽性轉化子篩選。

圖1 cdc50基因敲除雙交換片段擴增（A）、轉化子基因組驗證（B、C）、轉化子測序（D）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應驗證（E）Fig. 1 Gene cdc50 knockout double exchange fragment amplification (A), transformation genome validation (B,C), transformation sequencing (D) and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction validation (E)

醋酸鋰轉化法轉化釀酒酵母3 d后，G418平板長出3個轉化子，提取轉化子基因組。采用驗證引物1進行PCR擴增的電泳圖見圖1B。由圖1B可知，1、2號轉化子基因組得到大小約為2.4 kbp的正確條帶，3號轉化子基因組和野生型釀酒酵母BY4742菌株基因組得到約1.9kbp的條帶。篩選擴增條帶正確且明亮的2號轉化子基因組采用驗證引物2-UP/Z-DOWN擴增，擴增結果見圖1C。由圖1C可知，得到大小約為1.7 kbp的正確條帶。由圖1D測序結果表明，2號克隆菌株在cdc50基因中插入了G418編碼序列。同時提取野生型釀酒酵母BY4742和2號轉化子RNA進行實時熒光定量PCR檢測，由圖1E可知，cdc50基因在該轉化子中不表達，采用drs2基因作為對照，drs2基因在該轉化子中相對表達水平為0.77。結果表明2號轉化子酵母細胞的cdc50基因已被成功敲除。

2.2 細胞生長和形態測定

以培養24 h的野生型BY4742細胞的OD600nm值為對照，分別測量突變菌株Δcdc50在不同時間點的OD600nm值，計算相對生長率，結果見圖2A。

圖2 野生型釀酒酵母菌株BY4742和突變菌株Δcdc50的相對生長率（A）和細胞形態（B）Fig. 2 Relative growth rate (A) and cell morphology (B) of wild type Saccharomyces cereviniae strain BY4742 and mutant strain Δcdc50

由圖2A可知，培養2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h的突變菌株Δcdc50的相對生長率較野生型酵母BY4742菌株降低，均具有顯著差異（P＜0.05），其中培養12 h后，野生型BY4742菌株培養的相對生長率為2.10%，突變菌株Δcdc50為1.98%。菌株BY4742和Δcdc50細胞形態見圖2B。由圖2B可知，顯微鏡下也顯示突變菌株Δcdc50細胞形態與野生型BY4742對比發生了明顯的改變。野生型BY4742釀酒酵母細胞為卵圓形，細胞壁完整，邊緣清晰；突變菌株Δcdc50細胞多為長桿狀，其邊緣較為模糊。

2.3 轉錄組測序數據質控分析

野生型釀酒酵母BY4742菌株和突變菌株Δcdc50進行轉錄組測序分析后結果見表2。由表2可知，6個樣本共獲得264 628 560條純凈序列，總長度約39.63 Gb堿基，其Q20均＞97%，Q30均＞91%，表明原始數據的質量較高，可用于后續的生物信息學分析[23]。

表2 測序數據統計結果Table 2 Statistics results of sequencing data

2.4 差異表達基因分析

野生型釀酒酵母BY4742和突變菌株Δcdc50組基因共表達結果見圖3A。由圖3A可知，均表達6 336個基因，其中兩組共表達基因6 251個。具有顯著統計學差異的基因火山圖見圖3B。由圖3B可知，兩組共篩選出581個差異表達基因（DEGs），其中cdc50基因敲除后發生上調的基因有271個，下調的基因有310個。

圖3 基因共表達韋恩圖（A）和差異基因火山圖（B）Fig. 3 Venn diagram of gene co-expression (A) and volcano map of differential gene (B)

2.5 GO富集分析

差異表達基因GO富集分析結果見圖4。由圖4可知，Δcdc50菌株的差異表達基因（DEGs）主要富集在生物學過程（biological process，BP）的氧化還原過程、碳水化合物代謝、細胞氮化合物分解代謝、雜環分解代謝和有機環狀化合物分解代謝等；細胞組成（cellular component，CC）結果顯示DEGs主要分布于薄膜、細胞壁和外部封裝結構等部位；分子功能（molecular function，MF）富集結果顯示，DEGs主要影響氧化還原酶活性、輔助因子結合、跨膜轉運體的活性以及水解酶活性等來發揮作用。其中差異表達基因最主要影響的是細胞氧化還原過程，在BP中富集到氧化還原過程的DEGs有44個，在MF中也有33個DEGs富集到氧化還原酶活性。參與表達的氧化還原酶有6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（Gnd1p）、鐵螯合還原酶（Fre7p）、C-24（28）甾醇還原酶（Erg4p）和血紅素加氧酶（Hmx1p）等。除此之外，在MF中也有29個DEGs富集到跨膜轉運體活性，參與被動跨膜轉運蛋白活性的有Hsp30p、Aqy3p、Yro2p和Mrh1p。轉運蛋白介導生物膜內外化學物質的跨膜轉運及信號交換，對細胞攝取營養物質、外排代謝產物及信號轉導等方面起著重要作用[24-25]。通過GO富集分析推測釀酒酵母cdc50基因可能與細胞的氧化還原過程和跨膜轉運密切相關。

圖4 差異表達基因基因本體論富集分析結果Fig. 4 Results of Gene Ontology enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 KEGG分析

從KEGG富集結果中選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進行展示，以P＜0.05作為顯著性富集的閾值，結果見圖5。由圖5可知，差異表達基因（DEGs）主要參與了糖酵解/糖異生、脂肪酸降解、碳代謝、次生代謝物的生物合成等過程，也與過氧化物酶體的作用密切相關。其中，富集通路中DEGs富集水平最顯著的糖酵解/糖異生代謝通路，該通路涉及到的基因為cdc19、pcd1、adh2、tdh3和pox1等，其中Cdc19p是酵母糖酵解的丙酮酸激酶[16]。除此之外，次生代謝物的生物合成富集DEGs數目最多，碳代謝通路次之。通過KEGG富集分析推測cdc50基因對釀酒酵母細胞糖代謝過程具有重要調控作用。

圖5 差異表達基因京都基因與基因百科全書（KEGG）富集分析散點圖Fig. 5 Scatter plot of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of differentially expressed genes

3 結論

釀酒酵母細胞cdc50基因缺失會抑制細胞生長，改變細胞形態。利用RNA-seq轉錄組測序技術對野生型酵母菌株BY4742和突變菌株Δcdc50進行比較分析后表明，兩組差異表達基因共有581個，其中cdc50基因敲除后上調基因有271個，下調基因有310個。GO功能分析表明，差異表達基因主要富集在生物學過程中的氧化還原過程等，分子功能中的氧化還原酶活性、輔助因子結合和跨膜轉運體活性等。KEGG富集分析表明，差異表達基因主要富集在糖酵解/糖異生、脂肪酸降解和碳代謝通路等。本研究為揭示cdc50基因的生物學作用和相關分子機制的提供了理論基礎。