不同品種糯紅高粱花期內生酵母菌群多樣性分析

劉雯雯，陳 露，胡連清，馮瑞章，魏 琴，周萬海*，向秋瑾，黃思琪

（1.宜賓學院 四川省油樟工程技術研究中心，四川 宜賓 644007；2.宜賓學院 農林與食品工程學部，四川 宜賓 644007）

內生酵母是定植于健康植物中且與宿主植物形成互惠互利關系的一種獨特內生微生物類群[1]，宿主植物為內生酵母提供營養和穩定的環境條件，而內生酵母通過分泌植物激素，如吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPYA）等次生代謝產物，提高植物抵抗不利條件的能力，促進植物生長，維持植株健康狀態[2]，內生酵母也能通過乙烯調控機制抑制植物對金屬的吸收，保護植物免受金屬毒性[3]。相對于同一植物的內生細菌，內生酵母菌數量和多樣性均較少，但因具有獨特的分泌抑制物如木糖和乙醇等功能[4]，且對植物化學物質的耐受性更強[5]，內生酵母菌具有特殊研究價值。目前，已有關于陳皮[6]、松蘿[7]、水稻和玉米[8]等植物內生酵母的研究，其多樣性分析通常采用傳統平板培養法和高通量測序技術檢測，高通量測序技術因可直接從植物基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）層面快速分析內生酵母多樣性和群落結構，被廣泛應用于微生物多個領域。

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是中國主要雜糧作物之一，產量僅次于玉米、小麥、水稻和大麥。因其獨有的抗旱、耐澇、耐鹽堿和耐貧瘠等特性，在惡劣環境下也能正常生長，是食品配料、飼料和釀酒業原料的重要來源[9]。中國高梁主要分布于東北（遼寧、吉林和黑龍江）、華北（山西、內蒙古和河南）和西南（四川、貴州和重慶）等3個主產區，其中西南地區以糯性高粱為主[10]。糯紅高梁屬國家地理標志的保護農產品，作為釀酒原料在釀酒逆反應過程中表現出易糊化、易發酵的優勢，這一釀造原料品質的形成可能與內生酵母組成有密不可分的關系[11]。宜賓釀酒專用糯紅高粱包括雜交種金糯粱1號和地方種青殼洋等。有研究顯示，金糯粱1號具有植株矮、產量高、抗病力強的特點，主要經濟現狀優于青殼洋[12]。現僅有通過可培養法從2個品種中分離純化內生酵母，并篩選具有產蛋白酶功能菌株的報道[13]，而關于采用高通量技術分析花期糯紅高粱內生酵母的研究鮮見報道。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對不同品種糯紅高粱（雜交種金糯粱1號和地方種青殼洋）花期不同器官（根、莖、葉、花）內生酵母菌群落多樣性進行分析，為探究高粱與內生酵母共生關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

雜交種金糯粱1號（FA）和地方種青殼洋（FB）：宜賓市翠屏區農牧局農技推廣中心。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.@Soil DNA Kit試劑盒：美國OMEGA公司；引物NL1F（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL2R（5'-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3'）：上海美吉生物醫藥科技有限公司；體積分數75%乙醇：海氏海諾乳膠（青島）有限公司；次氯酸鈉（99%）：廣東博銳化工有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：法國Biowest公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DPH-9052微生物培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；RS489恒溫搖床：北京東聯哈爾儀器有限公司；BSA2202S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；GeneAmp 9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計：美國賽默飛公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 糯紅高粱組織無菌處理

待高粱進入花期時，采集并標記2個品種健康的根（FR）、莖（FS）、葉（FL）與花（FF），各樣本3個重復。將樣本裝入無菌袋內，冷鏈帶回實驗室用于后續試驗。根表面依次用流水沖洗60 min，無菌水沖洗2次，體積分數75%乙醇處理1 min，無菌水沖洗1次，5%NaClO處理3 min，體積分數75%乙醇處理1 min，晾干。莖表面依次用流水沖洗60 min，無菌水沖洗2次，體積分數75%乙醇處理0.5 min，無菌水沖洗1次，4%NaClO處理4 min，體積分數75%乙醇處理20 s，晾干。葉和花表面依次用流水沖洗60 min，無菌水沖洗2次，體積分數75%乙醇處理20 s，無菌水處理1次，3%NaClO處理3 min，體積分數75%乙醇處理20 s，晾干。

1.3.2 樣本DNA提取、PCR擴增與Illumina MiSeq高通量測序

采用E.Z.N.A.@Soil DNA Kit試劑盒提取不同品種糯紅高粱各器官基因組DNA，利用Nanodrop 2000檢測DNA濃度和純度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA質量，合格的DNA用于PCR擴增。以提取的基因組DNA為模板，使用引物NL1F和NL2R對內生酵母菌的26S rDNA D1/D2區基因進行PCR擴增，PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，30次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增體系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL，5 μmol/L正反引物各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）0.2 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，利用Illumina MiSeq PE300平臺對擴增產物進行雙端測序。

1.3.3 數據處理與統計分析

從Illumina MiseqTM測序平臺抽取得到各樣本的有效數據，使用Usearch去除預處理后的非放大區域序列，修正序列錯誤。同時，利用Blastn比較去除嵌合體序列和數據庫中代表序列，將低于閾值的比較結果作為目標區域外序列。根據序列間距離，借助Uparse將所有樣本序列進行聚類，按照序列間97%相似性將序列分割成各個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），展開OTU分析。用Qiime軟件對OTU中出現頻數最高的序列進行物種注釋分析[14]，并分別在門、綱、目、科、屬分類水平統計各樣本群落組成，基于物種注釋結果繪制群落柱形圖和韋恩圖。Alpha多樣性分析包括香農（Shannon）指數、辛普森（Simpson）指數、超1（Chao1）指數、ACE指數、Sob分析指數，其中Shannon指數、Simpson指數反映樣本中內生酵母群落多樣性，Shannon值越大表明群落多樣性越高，而Simpson指數值越大表明群落多樣性越低；ACE、Chao1和Sob指數反映樣本內生酵母群落豐富度[15]。基于物種注釋結果，使用非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）進行Beta多樣性分析，主要評估糯紅高粱不同樣本在物種組成上的相似性和差異性[16]。采用線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）尋找糯紅高梁內生酵母菌中的差異菌。利用FUNGuild（http：//funguild.org）數據庫對內生酵母菌群功能進行注釋，置信度選擇很可能（probable）和極可能（highly probable）。利用Microsoft Excel 2016進行數據整理和分析，運用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 序列深度分析與數據質控

通過高通量測序分析，從不同樣本中共獲得407 060條高質量序列，各樣本序列數范圍為10 806～25 218條，平均堿基長度為269 bp。

2.2 糯紅高粱內生酵母菌群OTU分析

按照97%相似水平對序列進行OTU劃分和注釋，結果見表1。由表1可知，糯紅高粱樣本中共注釋到內生酵母菌8門182屬337 OTUs，其中金糯粱1號共鑒定到7門104屬173 OTUs；青殼洋共鑒定到8門176屬315 OTUs。按照不同器官分類，根部共鑒定獲得內生酵母7門105屬200 OTUs；莖部鑒定獲得內生酵母5門96屬130 OTUs；葉部鑒定獲得內生酵母4門107屬163 OTUs；花部鑒定獲得內生酵母5門50屬64 OTUs。因此，地方種青殼洋和糯紅高粱根部中內生酵母群落組成更為豐富。

表1 糯紅高粱花期不同品種及器官樣本內生酵母菌群分類結果Table 1 Taxonomic results of endophytic yeast in different varieties and organs of waxy sorghum at flowering period

為分析樣本共有和特有OTU數目，繪制OTU Venn圖，結果見圖1。

圖1 糯紅高粱花期不同品種（a）及器官（b）樣本內生酵母菌OTU分布韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of endophytic yeast OTU distribution in different varieties (a) and organs (b) of waxy sorghum at flowering period

由圖1可知，按照不同品種分類，金糯粱1號和青殼洋共有OTUs數為151個，特有OTUs數分別為22個和164個。按照不同器官分類，根、莖、葉和花共有OTUs數為25個，特有OTUs數分別為107、27、58和10個。結果表明，糯紅高粱花期不同品種及不同器官內生酵母群落結果均具有一定相似性，且也表現出特異性，特異性以青殼洋高于金糯粱1號，以地下器官（根）高于地上器官（莖、葉、花）。

2.3 糯紅高粱內生酵母菌群多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

糯紅高粱花期不同品種及不同器官樣本內生酵母菌群的Alpha多樣性分析結果見表2。由表2可知，按照不同品種分類，不同品種糯紅高粱內生酵母菌群的Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和Sob指數均存在顯著性差異（P＜0.05），且青殼洋內生酵母菌群的Shannon指數、Chao1指數和Sob指數顯著更高（P＜0.05），Simpson指數顯著更低（P＜0.05），說明青殼洋內生酵母菌群落多樣性和豐富度均顯著性高于金糯粱1號。根據不同器官分類，糯紅高粱不同器官內生酵母菌群的Shannon指數、Simpson指數和ACE指數均無顯著性差異（P＞0.05），僅有Chao1和Sob指數存在顯著性差異（P＜0.05），且葉部內生酵母菌群落顯著高于莖和花（P＜0.05），與根部無顯著差異（P＞0.05），說明葉部內生酵母菌群的豐富度顯著性高于莖和花。結果表明，不同品種糯紅高粱的內生酵母群落多樣性和豐富度存在差異，且青殼洋內生酵母菌群的多樣性和豐富度均最高；糯紅高粱花期不同器官內生酵母菌群豐富度存在差異，且葉部內生酵母菌群的豐富度最高，其次為根部和莖部，花部最低。

表2 糯紅高粱花期不同品種及器官樣本內生酵母菌群的Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of endophytic yeast in different varieties and organs of waxy sorghum at flowering period

2.3.2 Beta多樣性分析

糯紅高粱花期不同品種及不同器官樣本內生酵母菌群的Beta多樣性分析結果見圖2。由圖2可知，糯紅高粱花期不同品種間內生酵母菌OTU（R=0.135 6，P=0.044）及不同器官間內生酵母菌OTU（R=0.723 9，P=0.001）均存在顯著性差異（P＜0.05）。通常認為Stress＜0.1時，不同樣本具有一個好的排序，糯紅高粱不同分組Stress均為0.09，說明品種和器官分組是一個好的排序。

圖2 糯紅高粱花期不同品種（a）及器官（b）樣本內生酵母菌群Beta多樣性分析結果Fig. 2 Beta diversity analysis results of endophytic yeast in different varieties (a) and organs (b) of waxy sorghum at flowering period

2.4 糯紅高粱內生酵母群落結構分析

基于門水平糯紅高粱內生酵母菌群結構見圖3，將相對豐度最大的門類和屬類定義為優勢菌門和優勢菌屬。由圖3可知，在門分類水平上，按照不同品種分類，金糯粱1號中內生酵母菌群主要分布在子囊菌門（Ascomycota）（90.99%）、未知真菌門（Unclassified Fungi）（5.42%）、擔子菌門（Basidiomycota）（2.47%）、Evosea（1.10%）；青殼洋中內生酵母菌群主要分布在子囊菌門（55.03%）、擔子菌門（21.79%）、未知真菌門（1.01%）。按照不同器官分類，糯紅高粱根部相對豐度最高的門類為未知真菌門（49.63%）；莖部和葉部相對豐度最高的門類均為子囊菌門，相對豐度分別為66.38%和80.13%；花部擔子菌門（30.47%）的相對豐度最高，且Evosea的相對豐度高于其他器官。

圖3 基于門水平糯紅高粱花期不同品種（a）和器官（b）樣本內生酵母菌群落結構分析結果Fig. 3 Community structure analysis results of endophytic yeasts in different varieties (a) and organs (b) of waxy sorghum based on phylum level at flowering period

基于屬水平糯紅高粱內生酵母菌群結構見圖4。由圖4可知，在屬分類水平上，按照不同品種分類，金糯粱1號中相對豐度＞5%的酵母屬為刺盾炱目未分類菌屬（Unclassified Chaetothyriales）（41.50%）、Alatosessilispora（15.12%）、新莖點霉屬（Neosetophoma）（6.37%）和未知真菌屬（Unclassified Fungi）（5.42%）；青殼洋中相對豐度＞5%的酵母屬為未知真菌屬（21.84%）、刺盾炱目未分類菌屬（9.58%）、鐮刀菌屬（Fusarium）（6.74%）、新莖點霉屬（5.72%）和Alatosessilispora（5.24%）。2個品種共有內生酵母屬為98個。按照不同器官分類，根部中相對豐度＞5%的酵母屬為未知真菌屬（49.63%）、鐮刀菌屬（14.19%）和傘菌綱未分類菌屬（Unclassified Agaricomycetes）（6.55%）；莖部中相對豐度＞5%的酵母屬為枝氯霉屬（Ramichloridium）（36.34%）、Papiliotrema（8.18%）、鐮刀菌屬（7.44%）和Phyllozyma（5.30%）；葉部中相對豐度＞5%的酵母屬為刺盾炱目未分類菌屬（27.67%）、Alatosessilispora（12.66%）、新莖點霉屬（10.02%）、亞隔孢殼屬（Didymella）（7.70%）、漢納酵母屬（Hannaella）（5.98%）；花部中相對豐度＞5%的酵母屬為Didymium（19.40%）、未知真菌屬（16.42%）、Pseudozyma（13.06%）、鐮刀菌屬（8.46%）、Microbotryozyma（7.84%）和煤絨菌屬（Fuligo）（6.22%）。根、莖、葉、花共有內生酵母屬24個，包括Pseudozyma、Golubevia、Phaeodothis、Kondoa、新莖點霉屬、Symmetrospora、Papiliotrema、漢納酵母屬、Tilletiopsis等。結果表明，糯紅高粱花期內生酵母的群落組成和相對豐度在品種和器官之間存在較大差異。

圖4 基于屬水平糯紅高粱花期不同品種（a）和器官（b）樣本內生酵母菌群落結構分析結果Fig. 4 Community structure analysis results of endophytic yeasts in different varieties (a) and organs (b) of waxy sorghum based on genus level at flowering period

在門水平上，除未知真菌門外，金糯粱1號、青殼洋以及根、莖、葉和花器官樣本中內生酵母主要歸類于子囊菌門和擔子菌門，這與現有部分關于內生酵母菌的研究類似[8，17]，子囊菌門是最有可能與植物互惠共生的門類，可分解難降解性有機質，并參與養分循環[16]。隸屬于子囊菌門和擔子菌門的酵母菌可棲居在如冰川、森林、沼澤等極端環境以及維管束植物、果實和腐爛木材表面等自然環境中，具有耐寒、耐鹽堿、耐高酸等特征[18]，因此，對后期可培養法分離純化并鑒定內生酵母菌株試驗具有參考意義。在屬水平上，不同品種和器官樣本的優勢菌屬存在共性與差異，其中共有屬類包括Neoosetophoma、枝氯霉屬和漢納酵母屬等，研究表明Neoosetophoma產生的3種類萜代謝產物對乳腺癌、卵巢癌及間皮瘤有一定作用[19]；本研究中枝氯霉屬屬于內生菌，有研究顯示此屬類也發現于外生真菌中，利于降解角質層并增加宿主的斜坡耐受性[20]；漢納酵母屬具有清除活性氧、降解病原菌細胞壁、提高植物抗性和抗性物質的合成等作用，對蘋果青霉病具有一定生物防治作用[21-22]；本研究中Pseudozyma在糯紅高粱花部中的相對豐度（13.06%）顯著高于其他器官，該屬類現已成為一種商業酵母，能分泌糖脂生物表面活性劑、角鯊烯、衣康酸等物質，其代謝物中分離純化的α-D-甘露聚糖具有鎮痛和抗炎活性，作為內生菌群參與促進植物健康生長過程[23]。不同品種和器官樣本中內生酵母菌群表現出差異性，可能是因菌株在不同生境條件下具有不同的傳播機制所致。如Papiliotrema僅出現在青殼洋中，研究表明，其可用于植物病原真菌的生物防治，有助于果實采前和采后的品質維護，且能改善菌根定殖、氮營養和植物生長[24]，說明通過對青殼洋內生酵母的分離純化獲得該屬，有利于功能優勢菌的開發。本研究中仍有一些OTU序列在不同的分類水平上未被注釋分類，表明糯紅高粱中還蘊含有部分未知的內生酵母需深入研究。有研究表明，不同地理區域、不同栽培方式和不同生長年限等因素對內生菌的組成有顯著影響[25]，本研究2個品種均種植于同一區域且統一時間采收，后續將嚴格控制栽培措施和施肥方式，探討糯紅高梁中內生菌群的組成。

2.5 糯紅高粱內生酵母菌群落差異性

通過LEfSe多級物種層級分析糯紅高梁花期不同品種及器官樣本中內生酵母菌中的差異菌，結果見圖5。由圖5可知，按照不同品種分類，在LDA閾值為2時，僅有青殼洋中具有起重要作用的內生酵母類群，包括擔子菌門、酵母菌綱（Saccharomycetes）、酵母菌目（Saccharomycetales）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）等2門5綱9目12科12屬。按照不同器官分類，未知真菌門、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）等1門2綱3目3科4屬是根中起重要作用的內生酵母菌類群；座囊菌綱（Dothideomycetes）、球腔菌目（Mycosphaerellales）、錐梗菌科（Dissoconiaceae）等1綱1目2科2屬是莖中起重要作用的內生酵母菌類群；子囊菌門、刺盾炱目（Chaetothyriales）、漢納酵母屬等1門3綱8目15科20屬是葉中起重要作用的內生酵母菌類群；花中起重要作用的內生酵母類群是擔子菌門、黑粉菌綱（Ustilaginomycetes）和Pseudozyma等1門2綱4目3科4屬。

圖5 糯紅高粱花期不同品種（a）及器官（b）樣本內生酵母菌群差異LEfSe分析結果Fig. 5 LEfSe analysis results of endophytic yeast microbial community difference in different varieties (a) and organs (b) of waxy sorghum at flowering period

2.6 糯紅高粱內生酵母菌群功能差異分析

基于FUNGuild數據庫解析糯紅高粱2個品種和4個器官內生酵母菌的營養型和生態功能類別，選擇“很可能”和“極可能”置信度作為分析對象，結果見表3。

表3 糯紅高粱花期不同品種和器官樣本內生酵母菌群功能結構分析結果Table 3 Functional structure analysis results of endophytic yeast in different varieties and organs of waxy sorghum at flowering period

由表3可知，內生酵母菌營養模式可分為7種，分別為病理型、腐生型、共生型、病理-腐生型、病理-共生型、腐生-共生型和病理-腐生-共生型。同時可分為動物病理菌群、植物病理菌群、真菌寄生菌群等24個生態功能群。按照不同品種分類，金糯粱1號和青殼洋共有營養型6種，共有生態功能群15個，其中青殼洋獨有功能菌株數量較多。按照不同器官分類，根、莖、葉和花共有營養型3種，共有生態功能群6個。不同器官獨有功能群存在差異，其中葉部獨有功能菌株數最多，花部最少。

在植物演化選擇過程中，內生菌為應對植物各階段生理狀態，具備了共生、腐生和寄生等生存策略，不同品種和器官營養模式和功能群數差異較大。在功能結構中Medicopsis和隔擔耳屬（Septobasidium）被定義為動物病原菌，說明某些動物病原菌可跨界侵染不同生物宿主[26]。擲孢酵母屬（Sporobolomyces）被定義為病理-腐生型菌，顯示主要存在于葉、莖器官及青殼洋中，也被發現于自蘋果、葡萄等植株的葉、花和果實中，能引發植物病變，但又是促進生物體抗性增加的調控因子[27]，與羅方雯等[28]從茅臺醬香白酒釀造大曲中分離的酵母菌株相似。病理型在葉器官中占比最高，說明該功能群可能易集中于生長旺盛且豐富的營養物質部位[29]。由于內生酵母菌在不同品種和器官中發揮不同功能，賦予不同器官和品種的產物和功能差異。

前期本課題組已從糯紅高粱不同器官中分離篩選得到33株產明膠、干酪素等蛋白酶的內生酵母[13]，后續隨著可培養功能菌株的深入發掘，糯紅高粱內生酵母菌的功能將會進一步明確，因此分析內生酵母菌的多樣性和組成，對功能性菌株開展應用研究奠定基礎。

3 結論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術對花期糯紅高粱不同品種及不同器官的內生酵母菌群多樣性進行分析，結果表明，共注釋到8門182屬。地方種青殼洋內生酵母菌的群落多樣性和豐富度均高于雜交種金糯粱1號，葉部豐富度最高。不同品種及莖葉的優勢菌門均為子囊菌門（Ascomycota），花和根部的優勢菌門分別為擔子菌門（Basidiomycota）、未知真菌門（Unclassified Fungi）；在屬水平上，金糯粱1號和青殼洋優勢菌屬分別為刺盾炱目未分類菌屬（Unclassified Chaetothyriales）和未知真菌屬，根、莖、葉和花部的優勢菌屬分別為未知真菌屬、枝氯霉屬（Ramichloridium）、刺盾炱目未分類菌屬和Didymium。采用LEfSe對不同樣品間的差異指示菌進行分析，結果顯示，青殼洋中最重要的差異指示屬為Papiliotrema；根、莖、葉和花部最重要的差異指示屬分別為鐮刀菌屬（Fusarium）、枝氯霉屬、Alatosessilispora和Pseudozyma。通過FUNGuild對菌群功能預測，結果顯示，糯紅高粱內生酵母菌群功能豐富，可分為7種營養模式和24個生態功能群，且青殼洋和葉部獨有功能菌數最多。本研究結果為后期深入探究內生酵母與宿主糯紅高粱的互作機制及功能菌的開發提供參考。